Chemistry
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Análise de arquiteturas de proteínas e complexos proteína-ligante por espectrometria de massa estrutural Integrativa
Chapters
Summary October 15th, 2018
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Espectrometria de massa (MS) emergiu como uma importante ferramenta para a investigação da estrutura e a dinâmica dos conjuntos macromoleculares. Aqui, nós integramos abordagens baseadas em MS para interrogar a formação do complexo de proteínas e a ligação do ligante.
Transcript
Hoje em dia a espectrometria de massa desempenha um papel importante na biologia estrutural. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre importantes macromoléculas biológicas em seu estado natal, especialmente proteínas e complexos proteicos. A espectrometria de massa nativa é amplamente aplicável a uma variedade de conjuntos biomoleculares, incluindo sistemas multiproteínas e ácidos nucleicos.
A principal vantagem desta técnica é que ela é rápida e altamente sensível. Pode ser usado para interrogar amostras de proteína heterogêneas, possibilitando a análise de múltiplas proteínas em estado oligomerico simultaneamente. Demonstrando o procedimento será Andy Lau, um estudante de doutorado do meu grupo.
Para iniciar este procedimento, prepare os capilares internos para nanoeletríspray, conforme descrito no protocolo de texto. Prepare uma amostra sem ligante como um controle para cada corrida, pois o buffer troca cada um em acetato de amônio. Em seguida, selecione os modos de sensibilidade, aquisição de íons positivos e tof de mobilidade.
Em seguida, ligue os gases da armadilha, API e IMS. Para a separação IM use os pontos de partida de nitrogênio e argônio mostrados aqui e ajuste conforme necessário. Defina uma faixa de aquisição adequada de m/z.
Para uma proteína desconhecida, as etapas iniciais de otimização devem usar uma ampla gama. Insira o capilar revestido de ouro em um suporte capilar. Em seguida, carregue entre dois e três microliters da solução complexa de proteína de interesse no capilar.
Aperte suavemente o capilar e coloque-o no estágio de origem do eletrospray. Deslize o estágio em posição para começar a adquirir dados. Aplique uma pressão de gás de baixo fluxo nano-fluxo até que uma gota se forme na ponta do capilar.
Mova o capilar em relação ao cone e monitore a corrente de íons para alcançar uma corrente de íon estável. Aplique uma tensão capilar na faixa entre 0,9 e 1,6 kilovolts. Em seguida, defina o cone de amostragem, deslocamento de origem, temperatura da origem e fluxo de gás cone conforme descrito no protocolo de texto.
Para adquirir um espectro de massa bem resolvido e transmissão de íon maximizada, ajuste os parâmetros de MS e monitore a mudança resultante no espectro. Coloque a energia de colisão da armadilha em um ponto de partida inicial entre 10 e 50 volts. Se os deslocamentos de tensão forem insuficientes, ajuste as energias de colisão da armadilha.
Coloque a armadilha através de sua tensão em um ponto de partida inicial entre 20 e 45 volts. Melhore a desolação otimizando essa tensão. Depois disso, otimize a velocidade de onda e a altura das ondas conforme descrito no texto para obter a melhor separação de mobilidade.
Para estudos envolvendo HerA e NurA use uma velocidade de onda de 40 metros por segundo e uma altura de onda entre 550 e 650 volts. Para análise de ligação de DNA, misture a proteína e o DNA em uma razão molar que permite a formação do complexo de DNA proteico. Adicione quantidades crescentes de qualquer um dos seguintes, 5'O-3-thio-triphosfato, sal de tetralítico ou ADP.
Utilizando software apropriado, mede as massas de espécies geradas e identifica a ligação de ligantes, como a vinculação ATP e ADP e estados oligomericos. Em seguida, use as intensidades de íons observadas no espectro bruto de ESI MS para quantificar a abundância relativa correspondente das espécies. Depois de otimizar as condições do instrumento para transmissão estável, reduza a energia colisal e o cone amostral o mais baixo possível, mantendo ainda boa qualidade de espectro.
Use a velocidade de onda otimizada anteriormente determinada e a altura das ondas para adquirir IM MS. Meça o tempo de deriva de íon em três velocidades de onda diferentes, mantendo a mesma altura de onda. Para determinar a proteína íon CCS meça quatro calibrantes proteicos, dois com a massa acima da proteína em investigação e dois com a massa abaixo, utilizando as mesmas condições de instrumentação. Primeiro, prepare as amostras de proteína e troque-as em acetato de amônio, conforme descrito no protocolo de texto.
Adicione solvente em incrementos de 10% até atingir a quantidade desejada. Incubar no gelo por uma hora. Depois disso, adquira um espectro IM-MS para cada amostra.
Usando o software SUMMIT, atribua subcoplexos proteicos e gere redes de interação proteica. Alternativamente, gerar manualmente uma lista de massas teóricas para as espécies esperadas. Para começar a investigar a estabilidade do complexo proteico, registo os dados do IM-MS enquanto aumentam a tensão de aceleração da armadilha de 10 volts para 200 volts, que se desdobrará progressivamente para a proteína e a fase do gás.
Analise os dados usando software apropriado e gere gráficos desdobrados empilhando as distribuições de CCS normalizadas de intensidade em cada tensão acelerada para cada estado de carga. Os resultados nativos de ESM revelam o estado oligomérico, a composição e a topologia do complexo HerA e NurA. À medida que as interações não covalentes são preservadas na fase de gás, os experimentos nativos de gamma S e ADP são usados para determinar a ligação de nucleotídeos em pares no HerA e nurA.
Espectros em massa dos estados oligomericos hera revelam que o aumento da concentração de gama S ATP aumenta a intensidade relativa do HerA hexameric. Os valores experimentais do CCS para as proteínas e seus complexos são então derivados dos experimentos IM-MS. Esses valores são vistos como de boa concordância com as medidas teóricas da cristalografia de raios-X, que valida o uso de valores ccs para a construção de modelos de baixa resolução de montagem de proteínas.
A análise da CIU e da KEcom revela que o DNA ligado ao HerA-NurA é mais estável do que o complexo livre de DNA. A análise do CIU MS e os respectivos estados vinculantes da ATP mostram que os quatro estados vinculados à ATP gama S reduzem a estabilidade complexa na fase do gás. No entanto, o estado vinculado a seis ATP gama S em que todos os locais estão ocupados, é visto como o mais estável.
Medições precisas da massa molecular de um complexo intacto fornecem uma visão valiosa da caracterização biomolecular. Podemos obter informações sobre caminhos complexos de montagem, oligomerização de proteínas e ligação de ligantes. A combinação de todas essas informações permite gerar modelos detalhados de conjuntos biológicos funcionais.
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