Chemistry
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Análisis de arquitecturas de proteínas y complejos de proteína-ligando por espectrometría de masa estructural integrativo
Chapters
Summary October 15th, 2018
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Espectrometría de masas (MS) se ha convertido en una herramienta importante para la investigación de la estructura y la dinámica de asambleas macromoleculares. Aquí, integramos los enfoques basados en la MS para interrogar la formación de complejos de proteína y de ligando.
Transcript
Hoy en día la espectrometría de masas desempeña un papel importante en la biología estructural. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre macromoléculas biológicas importantes en su estado nativo, especialmente proteínas y complejos proteicos. La espectrometría de masas nativa es ampliamente aplicable a una variedad de conjuntos biomoleculares, incluyendo sistemas de multiproteína y ácido nucleico.
La principal ventaja de esta técnica es que es rápida y altamente sensible. Se puede utilizar para interrogar muestras de proteínas heterogéneas, hacer posible analizar múltiples proteínas en estado oligomérico simultáneamente. Demostrando el procedimiento estará Andy Lau, un estudiante de doctorado en mi grupo.
Para comenzar este procedimiento, prepare los capilares internos para la nanoelectrospray como se describe en el protocolo de texto. Preparar una muestra libre de ligandos como control para cada carrera como intercambio de búfer cada uno en acetato de amonio. A continuación, seleccione los modos TOF de sensibilidad, adquisición de iones positivos y movilidad.
A continuación, active los gases de captura, API e IMS. Para la separación de mensajería instantánea, utilice los puntos de partida de nitrógeno y argón que se muestran aquí y ajuste según sea necesario. Establezca un rango de adquisición m/z adecuado.
Para una proteína desconocida, los pasos de optimización inicial deben utilizar una amplia gama. Inserte el capilar recubierto de oro en un soporte capilar. A continuación, cargue entre dos y tres microlitros de la solución compleja proteica de interés en el capilar.
Apriete suavemente el capilar y colóquelo en la etapa de la fuente de la electrospray. Deslice la etapa en su posición para empezar a adquirir datos. Aplique una presión de gas de nanoflujo bajo hasta que se forme una gota en la punta del capilar.
Mueva el capilar con respecto al cono y monitoree la corriente iónica para lograr una corriente iónica estable. Aplicar una tensión capilar en el rango entre 0,9 y 1,6 kilovoltas. A continuación, establezca el cono de muestreo, el desplazamiento de origen, la temperatura de origen y el flujo de gas de cono como se describe en el protocolo de texto.
Para adquirir un espectro de masa bien resuelto y una transmisión iónica maximizada, ajuste los parámetros de MS y supervise el cambio resultante en los espectros. Ajuste la energía de colisión de trampa a un punto de partida inicial entre 10 y 50 voltios. Si los desplazamientos de voltaje son insuficientes, ajuste las energías de colisión de trampa.
Ajuste la trampa a través de su voltaje a un punto de partida inicial entre 20 y 45 voltios. Mejore la desolación optimizando este voltaje. Después de esto, optimice la velocidad de onda y la altura de onda como se describe en el texto para lograr la mejor separación de movilidad.
Para estudios que involucran HerA y NurA, utilice una velocidad de onda de 40 metros por segundo y una altura de onda entre 550 y 650 voltios. Para el análisis de unión al ADN, mezcle la proteína y el ADN en una proporción molar que permita la formación compleja de ADN proteico. Agregue cantidades crecientes de cualquiera de los siguientes, 5'O-3-thio-trifosfato, sal de tetralitio o ADP.
El uso de software adecuado mide las masas de las especies generadas e identifica la unión de ligandos, como los estados de unión y oligoméricos ATP y ADP. A continuación, utilice las intensidades iónicas observadas en los espectros de LA MS ESI en bruto para cuantificar la abundancia relativa de especies correspondiente. Después de optimizar las condiciones del instrumento para una transmisión estable, reduzca la energía colisional y el cono de muestreo lo más bajo posible, conservando al mismo tiempo una buena calidad de los espectros.
Utilice la velocidad de onda y la altura de onda optimizadas previamente determinadas para adquirir IM MS. Mida el tiempo de deriva iónico a tres velocidades de onda diferentes mientras mantiene la misma altura de onda. Para determinar el CCS de iones de proteína medir cuatro calibradores de proteínas, dos con la masa por encima de la proteína bajo investigación y dos con la masa por debajo, utilizando las mismas condiciones de instrumentación. En primer lugar, preparar las muestras de proteínas y el tampón intercambiarlas en acetato de amonio como se describe en el protocolo de texto.
Añadir disolvente en incrementos del 10% hasta alcanzar la cantidad deseada. Incubar sobre hielo durante una hora. Después de esto, adquiera un espectro IM-MS para cada muestra.
Con el software SUMMIT, asigne subcomplejos proteicos y genere redes de interacción con proteínas. Alternativamente, generar manualmente una lista de masas teóricas para las especies esperadas. Para comenzar a investigar la estabilidad compleja de proteínas, registre los datos de IM-MS mientras aumenta el voltaje de aceleración de la trampa de 10 voltios a 200 voltios, que se desarrollará progresivamente a la fase de proteína y gas.
Analice los datos utilizando el software adecuado y genere gráficas de desdoblamiento bidimensionales apilando las distribuciones de CCS normalizadas de intensidad en cada voltaje de aceleración para cada estado de carga. Los resultados nativos de la EM revelan el estado oligomérico, la composición y la topología del complejo HerA y NurA. A medida que las interacciones no covalentes se conservan en la fase gaseosa, la MS nativa de los experimentos de valoración ATP gamma S y ADP, se utiliza para determinar la unión de nucleótidos en pareja en el HerA y NurA.
Los espectros de masa de los estados oligoméricos de HerA revelan que el aumento de la concentración de gamma S ATP aumenta la intensidad relativa de la HerA hexamérica. Los valores experimentales de CCS para las proteínas y sus complejos se derivan de los experimentos IM-MS. Se considera que estos valores tienen un buen acuerdo con las mediciones teóricas de la cristalografía de rayos X, que valida el uso de valores de CCS para la construcción de modelos de baja resolución de ensamblaje de proteínas.
El análisis de CIU y KEcom revela que herA-NurA unido al ADN es más estable que el complejo libre de ADN. El análisis de MS de CIU y los respectivos estados de enlace ATP muestran que el estado enlazado a los cuatro modelos GAMMA S reduce la estabilidad compleja en la fase de gas. Sin embargo, el estado de seis ATP gamma S en el que todos los sitios están ocupados, se considera que es el más estable.
Las mediciones precisas de la masa molecular de un complejo intacto proporcionan información valiosa sobre la caracterización biomolecular. Podemos obtener información sobre vías de montaje complejas, oligomerización de proteínas y unión de ligandos. La combinación de toda esta información permite generar modelos detallados de conjuntos biológicos funcionales.
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