Chemistry
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Analysere Protein arkitekturer og Protein-Ligand komplekser af Integrativ strukturelle massespektrometri
Summary October 15th, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Massespektrometri (MS) er opstået som et vigtigt redskab for undersøgelse af strukturen og dynamikken i makromolekylære forsamlinger. Her, integrere vi MS-baserede tilgange til at afhøre protein kompleks dannelse og ligand bindende.
Transcript
I dag massespektrometri spiller en vigtig rolle i strukturel biologi. Denne metode kan hjælpe med at besvare vigtige spørgsmål om vigtige biologiske makromolekyler i deres oprindelige tilstand, især proteiner og proteinkomplekser. Native massespektrometri er bredt anvendelig til en række biomolekylære forsamlinger, herunder multiprotein og nukleinsyre systemer.
Den største fordel ved denne teknik er, at det er hurtigt og meget følsomt. Det kan bruges til at afhøre heterogene proteinprøver, gør det muligt at analysere flere proteiner i oligomerisk tilstand samtidigt. At demonstrere proceduren vil være Andy Lau, en ph.d.-studerende i min gruppe.
For at indlede denne procedure skal de interne kapillærer forberede nanoelektrospray som beskrevet i tekstprotokollen. Forbered en ligand-fri prøve som et kontrolelement for hvert løb som bufferbytte hver i ammoniumacetat. Vælg derefter tilstandene følsomhed, positiv ionerhvervelse og mobilitets-TOF..
Næste sving på fælden, API, og IMS gasser. Til IM-separation anvendes nitrogen- og argonstartpunkterne vist her og justeres efter behov. Angiv et passende m/z-anskaffelsesområde.
For et ukendt protein bør de indledende optimeringstrin bruge en bred vifte. Sæt den guldbelagte kapillær i en kapillærholder. Derefter belastning mellem to og tre mikroliter af protein kompleks løsning af interesse i kapillær.
Stram kapillæren forsigtigt og læg den på elektrospraykildestadiet. Skub fasen i position for at begynde at hente data. Påfør et lavt nanoflow gastryk, indtil et fald dannes på spidsen af kapillæren.
Flyt kapillæren i forhold til keglen, og overvåg ionstrømen for at opnå en stabil ionstrøm. Der påføres en kapillær spænding i området mellem 0,9 og 1,6 kilovolt. Angiv derefter samplingkeningen, kildeforskydningen, kildetemperaturen og keglegasstrømmen som beskrevet i tekstprotokollen.
For at opnå et velafsteplet massespektrum og maksimeret iontransmission skal du justere MS-parametrene og overvåge den deraf følgende ændring i spektrene. Indstil fældekollisionsenergien til et indledende udgangspunkt mellem 10 og 50 volt. Hvis spændingsforskydningerne er utilstrækkelige, skal du justere spændingskollisionsenergierne.
Indstil fælden via spændingen til et indledende udgangspunkt mellem 20 og 45 volt. Forbedre ødelæggelse ved at optimere denne spænding. Derefter optimeres bølgehastigheden og bølgehøjden som beskrevet i teksten for at opnå den bedste mobilitetsadskillelse.
For undersøgelser, der involverer HerA og NurA bruge en bølgehastighed på 40 meter i sekundet og en bølgehøjde mellem 550 og 650 volt. For DNA-bindingsanalyse blandes proteinet og DNA'et i et molære forhold, der giver mulighed for protein-DNA-kompleks dannelse. Tilføj stigende mængder af en af følgende, 5'O-3-thio-tripfosfat, tetralithium salt, eller ADP.
Ved hjælp af passende software måle masserne af genererede arter og identificere ligand bindende, såsom ATP og ADP bindende og oligomeric stater. Brug derefter de ionintensiteter, der er observeret i det rå ESI MS-spektre, til at kvantificere den tilsvarende relative forekomst af arter. Efter optimering af instrumentbetingelserne for stabil transmission reduceres kollisionsenergien og prøvetagningskeveen så lavt som muligt, samtidig med at den bevarer en god spektrekvalitet.
Brug den tidligere bestemte optimerede bølgehastighed og bølgehøjde til at anskaffe IM MS. Mål iondriftstiden ved tre forskellige bølgehastigheder, samtidig med at den samme bølgehøjde opretholdes. For at bestemme proteinion CCS måle fire protein calibrants, to med massen over det protein, der undersøges, og to med massen nedenfor, ved hjælp af de samme instrumentering betingelser. Først forberede protein prøver og buffer udveksle dem i ammoniumacetat som skitseret i tekstprotokollen.
Der tilsættes opløsningsmiddel i intervaller på 10 %, indtil det når den ønskede mængde. Inkuber på is i en time. Derefter skal du anskaffe et IM-MS-spektrum for hver prøve.
Brug SUMMIT-softwaren til at tildele proteinunderkomplekser og generere proteininteraktionsnetværk. Alternativt manuelt generere en liste over teoretiske masser for de forventede arter. For at begynde at undersøge protein kompleks stabilitet, registrere IM-MS data og samtidig øge fælden acceleration spænding fra 10 volt til 200 volt, som gradvist vil udfolde sig til protein og gasfasen.
Analysér dataene ved hjælp af passende software, og generer todimensionale udfoldelsesområder ved at stable intensiteten normaliserede CCS-distributioner ved hver accelererende spænding for hver opladningstilstand. Native MS resultater afslører oligomeric tilstand, sammensætning, og topologi af HerA og NurA kompleks. Da ikke-kovalerente interaktioner bevares i gasfasen, bruges oprindelige MS for ATP gamma S og ADP-titreringseksperimenter til at bestemme den parvise nukleotidbinding i HerA og NurA.
Massespektre af HerA oligomeric stater afslører, at øge ATP gamma S koncentration øger den relative intensitet hexameric HerA. De eksperimentelle CCS-værdier for proteinerne og deres komplekser stammer derefter fra IM-MS-forsøgene. Disse værdier ses at have god enighed med teoretiske målinger fra røntgenkrystallografi, som validerer ved hjælp af CCS-værdier til opbygning af lavopløsningsmodeller for proteinsamling.
CIU og KEcom analyse afslører, at DNA bundet HerA-NurA er mere stabil end DNA-fri kompleks. CIU MS-analyse og de respektive ATP-bindingstilstande viser, at de fire ATP gamma S-bundet tilstand reducerer den komplekse stabilitet i gasfasen. Men de seks ATP gamma S bundet tilstand, hvor alle steder er besat, ses at være den mest stabile.
Nøjagtige målinger af molekylmassen i et intakt kompleks giver værdifuld indsigt i biomolekylær karakterisering. Vi kan få oplysninger om komplekse samling veje, protein oligomerization, og ligand bindende. Ved at kombinere alle disse oplysninger gør det muligt at generere detaljerede modeller af funktionelle biologiske forsamlinger.
Related Videos
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
CH
DE