Chemistry
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एकीकृत संरचनात्मक द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा प्रोटीन आर्किटेक्चर और प्रोटीन-Ligand परिसरों का विश्लेषण
Summary October 15th, 2018
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मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) संरचना और macromolecular विधानसभाओं की गतिशीलता की जांच के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में उभरा है । यहां, हम एकीकृत एमएस आधारित दृष्टिकोण प्रोटीन जटिल गठन और ligand बाध्यकारी पूछताछ करने के लिए ।
Transcript
आजकल बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री संरचनात्मक जीव विज्ञान में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। यह विधि उनके मूल राज्य, विशेष रूप से प्रोटीन और प्रोटीन परिसरों में महत्वपूर्ण जैविक मैक्रोमॉलिक्यूल्स के बारे में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने में मदद कर सकती है। देशी द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री मल्टीप्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड सिस्टम सहित विभिन्न प्रकार की जैव अणुवृक्ष विधानसभाओं पर व्यापक रूप से लागू होता है।
इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह तेजी से और अत्यधिक संवेदनशील है। इसका उपयोग विषम प्रोटीन नमूनों से पूछताछ करने के लिए किया जा सकता है, जिससे एक साथ अल्पाहारिक स्थिति में कई प्रोटीन का विश्लेषण करना संभव हो जाता है। प्रक्रिया का प्रदर्शन एंडी Lau, मेरे समूह में एक पीएचडी के छात्र होगा ।
इस प्रक्रिया को शुरू करने के लिए, पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित नैनोइलेक्ट्रोस्प्रे के लिए इन-हाउस केशिकाएं तैयार करें। प्रत्येक रन के लिए एक नियंत्रण के रूप में एक लिगांड-मुक्त नमूना तैयार करें क्योंकि बफर प्रत्येक को अमोनियम एसीटेट में एक्सचेंज करें। इसके बाद, संवेदनशीलता, सकारात्मक आयन अधिग्रहण, और गतिशीलता TOF मोड का चयन करें।
जाल, एपीआई और आईएमएस गैसों पर अगला चालू करें। आईएम जुदाई के लिए नाइट्रोजन और आर्गन शुरू अंक यहां दिखाया और आवश्यक के रूप में समायोजित का उपयोग करें । एक उपयुक्त मेस/ जेड अधिग्रहण रेंज निर्धारित करें।
एक अज्ञात प्रोटीन के लिए प्रारंभिक अनुकूलन चरणों को एक विस्तृत श्रृंखला का उपयोग करना चाहिए। सोने को लेपित केशिका को एक केशिका धारक में डालें। फिर केशिका में ब्याज के प्रोटीन जटिल समाधान के दो और तीन माइक्रोलीटर के बीच लोड करें।
धीरे-धीरे केशिका को कस लें और इसे इलेक्ट्रोस्प्रे स्रोत चरण पर रखें। डेटा प्राप्त करना शुरू करने के लिए चरण को स्थिति में स्लाइड करें। केशिका की नोक पर एक बूंद रूपों तक एक कम नैनो प्रवाह गैस दबाव लागू करें ।
शंकु के संबंध में केशिका ले जाएं और एक स्थिर आयन वर्तमान को प्राप्त करने के लिए आयन वर्तमान की निगरानी करें। 0.9 और 1.6 किलोवोल्ट के बीच की सीमा में एक केशिका वोल्टेज लागू करें। फिर पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित नमूना शंकु, स्रोत ऑफसेट, स्रोत तापमान और शंकु गैस प्रवाह सेट करें।
एक अच्छी तरह से हल किए गए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम प्राप्त करने और आयन ट्रांसमिशन को अधिकतम करने के लिए, एमएस मापदंडों को समायोजित करें और स्पेक्ट्रा में परिणामी परिवर्तन की निगरानी करें। 10 और 50 वोल्ट के बीच एक प्रारंभिक प्रारंभिक बिंदु के लिए जाल टकराव ऊर्जा सेट करें। यदि वोल्टेज ऑफसेट अपर्याप्त हैं, तो जाल टकराव ऊर्जा को समायोजित करें।
20 और 45 वोल्ट के बीच एक प्रारंभिक प्रारंभिक बिंदु के लिए अपने वोल्टेज के माध्यम से जाल सेट करें। इस वोल्टेज को अनुकूलित करके वीरानी में सुधार करें। इसके बाद, सर्वोत्तम गतिशीलता पृथक्करण प्राप्त करने के लिए पाठ में उल्लिखित तरंग वेग और तरंग ऊंचाई को अनुकूलित करें।
हेरा और नूरा से जुड़े अध्ययनों के लिए 40 मीटर प्रति सेकंड की तरंग वेग और 550 और 650 वोल्ट के बीच एक लहर ऊंचाई का उपयोग करें। डीएनए बाध्यकारी विश्लेषण के लिए, प्रोटीन और डीएनए को मोलर अनुपात में मिलाएं जो प्रोटीन डीएनए जटिल गठन की अनुमति देता है। निम्नलिखित में से किसी की बढ़ती मात्रा जोड़ें, 5'O-3-थिओ-ट्रिप्होस्फेट, टेट्रालिथियम नमक, या एडीपी।
उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग करके उत्पन्न प्रजातियों की जनता को मापते हैं और एटीपी और एडीपी बाध्यकारी और अल्पाधिकार राज्यों जैसे लिगांड बाइंडिंग की पहचान करते हैं। फिर प्रजातियों के इसी सापेक्ष बहुतायत की मात्रा निर्धारित करने के लिए कच्चे ईएसआई एमएस स्पेक्ट्रा में देखी गई आयन तीव्रता का उपयोग करें। स्थिर संचरण के लिए साधन की स्थिति को अनुकूलित करने के बाद, टकराव की ऊर्जा को कम करें और शंकु को यथासंभव कम से कम करें, जबकि अभी भी अच्छी स्पेक्ट्रा गुणवत्ता को बनाए रखते हैं।
आईएम एमएस प्राप्त करने के लिए पहले से निर्धारित अनुकूलित तरंग वेग और तरंग ऊंचाई का उपयोग करें। एक ही तरंग ऊंचाई को बनाए रखते हुए तीन अलग-अलग तरंग वेग पर आयन बहाव समय को मापें। प्रोटीन आयन सीसीएस उपाय करने के लिए चार प्रोटीन कैलिब्रेंट, जांच के तहत प्रोटीन के ऊपर द्रव्यमान के साथ दो और नीचे द्रव्यमान के साथ दो, एक ही इंस्ट्रूमेंटेशन शर्तों का उपयोग कर । सबसे पहले, प्रोटीन के नमूने तैयार करें और बफर उन्हें अमोनियम एसीटेट में विनिमय करें जैसा कि पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित है।
वांछित राशि तक पहुंचने तक 10% वेतन वृद्धि में सॉल्वेंट जोड़ें। एक घंटे के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट। इसके बाद, प्रत्येक नमूने के लिए आईएम-एमएस स्पेक्ट्रम प्राप्त करें।
शिखर सम्मेलन सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, प्रोटीन सबकॉम्प्लेक्स आवंटित करें और प्रोटीन इंटरैक्शन नेटवर्क उत्पन्न करें। वैकल्पिक रूप से, मैन्युअल रूप से अपेक्षित प्रजातियों के लिए सैद्धांतिक जनता की एक सूची उत्पन्न करें। प्रोटीन जटिल स्थिरता की जांच शुरू करने के लिए, आईएम-एमएस डेटा रिकॉर्ड करते हुए 10 वोल्ट से २०० वोल्ट तक ट्रैप त्वरण वोल्टेज में वृद्धि, जो उत्तरोत्तर प्रोटीन और गैस चरण के लिए प्रकट होगा ।
उपयुक्त सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण करें और प्रत्येक चार्ज राज्य के लिए प्रत्येक त्वरित वोल्टेज पर तीव्रता सामान्यीकृत सीसीएस वितरण को ढेर करके दो-आयामी खुलासा भूखंड उत्पन्न करें। देशी एमएस परिणाम हेरा और नूरा परिसर की अल्पाधिकारी स्थिति, संरचना और टोपोलॉजी को प्रकट करते हैं। चूंकि गैस चरण में गैर-कोवैलेंट इंटरैक्शन को संरक्षित किया जाता है, इसलिए एटीपी गामा एस और एडीपी टिटरेशन प्रयोगों के मूल निवासी एमएस का उपयोग हेरा और नूरा में जोड़ी-वार न्यूक्लियोटाइड बाध्यकारी निर्धारित करने के लिए किया जाता है।
हेरा ओलिगोमेरिक राज्यों के बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रा से पता चलता है कि एटीपी गामा एस एकाग्रता बढ़ाने से हेक्सामेरिक हेरा की सापेक्ष तीव्रता बढ़ जाती है। प्रोटीन और उनके परिसरों के लिए प्रायोगिक सीसीएस मूल्यों तो आईएम-एमएस प्रयोगों से प्राप्त कर रहे हैं । इन मूल्यों को एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी से सैद्धांतिक माप के साथ अच्छा समझौता देखा जाता है, जो प्रोटीन असेंबली के कम-रिज़ॉल्यूशन मॉडल के निर्माण के लिए सीसीएस मूल्यों का उपयोग करने की पुष्टि करता है।
सीआईयू और KEcom विश्लेषण से पता चलता है कि डीएनए बाध्य हेरा-NurA डीएनए मुक्त परिसर की तुलना में अधिक स्थिर है । सीआईयू एमएस विश्लेषण और संबंधित एटीपी बाइंडिंग राज्यों से पता चलता है कि चार एटीपी गामा एस बाध्य राज्य गैस चरण में जटिल स्थिरता को कम करता है । हालांकि, छह एटीपी गामा एस बाध्य राज्य जिसमें सभी साइटों पर कब्जा कर रहे हैं, सबसे स्थिर देखा जाता है ।
एक अक्षुण्ण परिसर के आणविक द्रव्यमान का सटीक माप जैव अणु लक्षण वर्णन में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। हम जटिल असेंबली रास्तों, प्रोटीन ओलिगोमेराइजेशन और लिगांड बाइंडिंग के बारे में जानकारी प्राप्त कर सकते हैं। यह सब जानकारी के संयोजन कार्यात्मक जैविक विधानसभाओं के विस्तृत मॉडल उत्पन्न करने के लिए अनुमति देता है।
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