A subscription to JoVE is required to view this content.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Isolatie van embryonale weefsels en vorming van kwartel-kip chimeer organen met behulp van het voorbeeld van de Thymus
Chapters
Summary
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Dit artikel bevat een methode voor het isoleren van pure embryonale weefsels van kwartel en kip embryo's die kunnen worden samengevoegd tot ex vivo chimeer organen.
Transcript
Het algemene doel van deze procedure is om een geoptimaliseerde experimentele aanpak te presenteren om embryonale weefsels te isoleren van de kwartel- en kippenembryo's. Met deze techniek verkrijgen we zuivere embryonale weefsels die kunnen worden gebruikt in genexpressiestudies en functionele testen. Weefsels van kwartel en kippenembryo's worden geïsoleerd door microchirurgie en onderworpen aan in vitro enzymatische spijsvertering met behoud van de biologische eigenschappen.
Na isolatie kunnen de driedimensionale geconserveerde weefsels worden gebruikt voor analyse van topografische genexpressiepatronen met hoge resolutie. Deze aanpak is vooral nuttig voor het detailleren van in situ genexpressie in embryonale gebieden die anders ontoegankelijk zijn door conventionele methoden. Bovendien kunnen transcriptome-analysebenaderingen ook worden toegepast in geïsoleerde weefsels zonder dat genetische markers nodig zijn, terwijl een weefselspecifieke hoge doorvoeromputanalyse wordt geboden.
Als alternatief kunnen de geïsoleerde weefsels van beide soorten gedurende 48 uur worden geassocieerd in een in vitro organotypic test. Deze aanpak maakt het mogelijk om weefsels interacties te bestuderen, omdat kwartel en kippencellen kunnen worden gediscrimineerd door verschillende nucleaire kenmerken en moleculaire markers. De capaciteit van de kweekweefsels om organen te vormen kan verder worden getest door in ovo-test.
Deze methode is daarom een nuttig hulpmiddel voor het bestuderen van complexe weefselinteracties in ontwikkelingsprocessen met zeer dynamische ruimtelijke modificaties en kan ook helpen om het potentieel van specifieke embryonale gebieden aan de vorming van organen te onthullen. Als voorbeeld wordt hierin de vorming van kwartelkip chimerische thymus uit geïsoleerde embryonale weefsels beschreven. Ten eerste, de endoderm van de derde en vierde faryngeale zakjes, de toekomstige thymische rudiment is geïsoleerd van de faryngeale regio van kwartel embryo's met drie dagen van ontwikkeling.
Vervolgens wordt dit weefsel geassocieerd met een mesenchyme dat in staat is de ontwikkeling ervan te ondersteunen, het somatopleura mesoderm. Ten slotte is de heterospecifieke associatie van weefsels gekweekt in vitro en in ovo om een chimerische thymus te vormen. Voer alle eimanipulatieprocedures uit in steriele omstandigheden met behulp van een horizontale laminaire stroomkap en gesteriliseerde instrumenten en materialen.
Bevruchte kwarteleieren werden geïncubeerd met de luchtkamer naar boven gericht. Om te beginnen, verwijder de kwarteleieren uit de couveuse. Bereid een grote borosilicaat glazen kom gevuld met koude PBS.
Met een gebogen schaar, tik en snijd een cirkelvormig gat in de schelp van een kwartelei met drie dagen van incubatie. Maak het gat in de andere kant van het ei stomp, en breng de dooier naar de kom met koude PBS. Verwijder het embryo uit de dooier door het vitelline membraan extern te snijden naar extraembryonische vaten.
Breng het embryo met behulp van dunne tangen over op een kommetje gevuld met koude PBS en verplaats het embryo vervolgens naar een petrischaaltje met zwarte basis met een skimmer. Verwijder de faryngeale regio met de derde en vierde faryngeale zakjes zoals beschreven in de vorige Jove SPA ligatie. Breng vervolgens het derde en vierde faryngeale booggebied over op een glas dat een uur lang is gevuld met koude pancrea en incubeer, op ijs, voor enzymatische spijsvertering.
Merk op dat de incubatietijd van enzymatische spijsvertering afhankelijk is van het ontwikkelingsstadium. Plaats de glazen schaal onder de stereomicroscoop en isoleer het endoderm van het derde en vierde faryngeale booggebied, met behulp van twee micro-scalpel in een houder. Plaats eerst het faryngeale gebied met de rugzijde omhoog, die intern het endoderm en ectoderm in de externe oppervlakte toont.
Observeer het ectoderm, endoderm, mesenchyme, hartbuis en ventrale gedeelte van de neurale buis. Verwijder de neurale buis en het mesoderm aan het dorsale oppervlak van het faryngeale endoderm. Observeer de endoderm van de keelholte, de vierde en derde faryngeale zakjes en de hartbuis.
Met de rugzijde omhoog, voorzichtig los en verwijder de mesenchyme tussen de faryngeale bogen en bloot de faryngeale zakjes. Voer deze procedure uit aan de andere kant van het faryngeale gebied. Verwijder de mesenchyme bevestigd aan het meest achterste deel van het endoderm en observeer het vierde faryngeale zakje.
Met achterste kant omhoog, observeren zowel links als rechts vierde faryngeale zakjes. Ga verder door het verwijderen van de mesenchyme bevestigd aan het meest achterste deel van het endoderm en aan de tweede zak. Verwijder de hartbuis en de mesenchyme rond de binnenzakjes.
Met de ventrale kant omhoog, observeer de keelholte endoderm, en de rechterkant van de tweede faryngeale boog. In dit stadium moet het endoderm van de schildklier rudiment zichtbaar zijn. Maak de ectoderm van de tweede en derde faryngeale bogen los en verwijder voorzichtig het mesenchyme van de bogen.
Observeer de verwijdering van het mesenchyme van de tweede faryngeale boog aan de rechterkant. Let op de locatie van de vierde en derde zakjes en schildklier rudiment. Verwijder de resten aan mesenchymale cellen die aan de keelholtezakjes worden vastgehefd.
Let op de derde en vierde zak van de rechterkant en het vierde zakje aan de linkerkant. Herhaal de mesenchyme detachement van de linkerkant. Let nu op het derde zakje van de linkerkant.
Observeer mesenchyme detachement van de tweede boog aan de linkerkant. Houd er rekening mee dat alle oppervlakken en oplossingen tijdens deze procedure koud moeten worden gehouden. Verander in een nieuwe koude pancreatine oplossing en schotel in het geval van het nemen van een lange tijd om de weefsels te ontleden.
Tot slot, maak een transversale snede tussen de tweede en derde faryngeale zakjes om de tweede zakjes en de schildklier rudiment te verwijderen. Op dit punt bestaat het geïsoleerde endoderm uit de derde en vierde faryngeale zakjes en het achterste puntje van de keelholte. Verwijder de resten los mesenchyme met behulp van twee micro-scalpels.
Breng het geïsoleerde endoderme over in een glazen schaal gevuld met koud foetaal runderserum en houd het tijdens de bereiding van de in vitro-test op ijs. Eieren werden geplaatst in horizontale positie en de bovenzijde gemarkeerd voor het gebruik van een houtskool. Om te beginnen, verwijder de eieren uit de couveuse.
Met een gebogen schaar, open een klein gaatje in de schelp, steek een naald, en aspirate twee milliliter albumine met een 10 milliliter spuit. Open een cirkelvormig gat in het gemarkeerde gebied van de schelp en snijd het vitelline membraan extern naar de extra embryonale vaten terwijl u het embryo met dunne tangen vasthoudt. Plaats het embryo onder een stereomicroscoop in een petrischaaltje met zwarte basis met koude PBS.
Gebruik vier insectenspelden om het embryo op de bodem van de plaat te houden. Plaats de pinnen in het extraembryonische gebied dat een vierkante vorm vormt. Voer twee sneden uit tussen de somites 19 en 24 transversaal naar de embryo-as en het oversteken van het embryo.
Laat deze sectie los door de marginale embryonale randen te snijden. Observeer de laterale plaat, neurale buis en somites. Aspirate en breng de weefsels naar een glazen schaal gevuld met koude pancreain.
Incubeer gedurende 30 minuten op ijs voor enzymatische spijsvertering. Onder de stereomicroscoop isoleert u het mesoderme van de omliggende weefsels met behulp van twee microscals in houders. Observeer de somatopleura mesoderm, de splanchnopleura, neurale buis, en ectoderm.
Verwijder eerst het ectoderm aan het oppervlak. Observeer de somatopleura mesoderm gescheiden van het ectoderm. Maak vervolgens voorzichtig de ventrally splanchnopleura los van de somatopleura.
Observeer de juiste laterale mesoderm van de somatopleura. Laat het los door het in een parallelle beweging naar de neurale buis te snijden. Houd er rekening mee dat alle oppervlakken en oplossingen tijdens deze procedure koud moeten worden gehouden.
Verander in een nieuwe koude pancreatine oplossing en schotel in het geval van het nemen van een lange tijd om de weefsels te ontleden. Observeer de linker laterale mesoderm van de somatopleura, somites, neurale buis, en ectoderm. Herhaal de mesoderm release van deze kant.
Maak langzame bewegingen met de micro-scalpel. De blootgestelde extracellulaire matrix eiwitten zitten door weefsels en instrumenten, het voorkomen van vloeiende bewegingen. Snijd de somatopleura voorzichtig in een parallelle beweging naar de neurale buis.
Breng het geïsoleerde mesoderme over in een glazen schaal gevuld met koud foetaal runderserum en houd het op ijs tijdens de bereiding van in vitro test. Plaats een fijn gemeshed metalen rooster in een petrischaaltje en vul met cultuurmedium. Verwijder de overtollige vloeistoffen om het medium oppervlak te nivelleren met de bovenkant van het rooster.
Met behulp van dunne tangen dompelt u een membraanfilter in het kweekmedium en plaatst u het voorzichtig op de bovenkant van het rooster om een oppervlak met haar in contact te hebben. Breng onder de stereomicroscoop het geïsoleerde endoderm van de glazen schaal naar het membraanfilter door voorzichtig te glijden met behulp van spatel en dunne tangen. Herhaal deze procedure voor het geïsoleerde mesoderm.
Met behulp van een micro-scalpel, meng de weefsels om het associatie te maximaliseren. Plaats de bijbehorende weefsels voorzichtig in een bevochtigde couveuse op 37 graden met 5% CO2 gedurende 48 uur. Na de incubatietijd, graf de kweekweefsels op het coriolan type membraan en laat het zich ontwikkelen in ovaal voor verdere 10 dagen om orgaanvorming te voltooien zoals eerder beschreven.
Hier is de reticulaire methode die het mogelijk maakt de isolatie van aviaire embryonale weefsels worden gebruikt in verschillende experimentele benaderingen. Als voorbeeld, de expressie van genen waarvan bekend is dat betrokken zijn bij de vorming van de faryngeale zakjes werden ook geëvalueerd een geïsoleerd endoderm met de tweede, derde en vierde faryngeale zakjes van kippen embryo's op embryonale dag drie en een half door hele mount in situ hybridisatie. De uitdrukking van Sonic Hedgehog werd gedetecteerd in het endoderm van de centrale keelholte en uitgesloten van de zakjes, terwijl BMP7 werd uitgedrukt in de endoderm van de tweede en derde faryngeale zakjes en uitgesloten van de centrale farynx en vierde faryngeale zak.
Geïsoleerde weefsels kunnen ook worden vitro specifiek geassocieerd in vitro voor 48 uur, graft op de coriolan type membraan, en mag ontwikkelen voor verdere 10 dagen. Explants kunnen worden geanalyseerd door conventionele histologie en immunohistochemie. Enkele representatieve resultaten van de associatie van kwartel endoderm uit de derde en vierde faryngeale zakjes met kip somatopleura mesoderm zijn de volgende-Grafts toonde een volledig gevormde chimerische thymus met kwartel afgeleid thymische epitheliale cellen positief voor QCPN en kip lymfecellen.
Bovendien vertoonde cytokeratine positief thymisch epitheel normale morfologische kenmerken, met een typische reticulaire architectuur. Na het bekijken van deze video, moet u een goed begrip hebben hoe kwartel en kip embryonale weefsels die kunnen worden gebruikt in genexpressie studies te isoleren en door de vorming van chimeric organen kan ook helpen ontcijferen van de complexiteit van orgaan genetica.
Tags
Ontwikkelingsbiologie kwestie 144 embryonaal weefsel isolatie 3D-bewaarde weefsels in vitro organotypic assay kwartel-kip chimeer orgel zwezerikRelated Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
