7,597 Views
•
07:25 min
•
December 17, 2019
DOI:
Hjerte indeholder heterogene population af immunceller, der spiller afgørende roller i hjertebetændelse samt reparation. For at forstå heterogeniteten af immunceller og få yderligere indsigt i deres funktion, er det vigtigt at have en metode, der vil give mulighed for inddrivelse af disse celler fra hjertet. Denne teknik kan hjælpe afdække immun samt nonimmune celle mangfoldighed, der bor i det sunde eller en syg hjerte.
Der er tre store fordele ved denne teknik. For det første er det en simpel enkelt arbejdsgang, der fører til generering af en enkelt celle suspension af forskellige celletyper inden for tre timer. For det andet fører det til høj genopretning af levedygtige immun- og ikke-immune cellepopulationer.
Og for det tredje, det er en meget alsidig metode og kan anvendes på hjertevæv i andre arter samt. At være opmærksom på mængden af væv, der anvendes til en enkelt fordøjelse reaktion er vigtig. Brug steril saks, dissekere vævsprøve fra den apikale eller laterale væg af venstre hjertekammer i koldt saltvand eller HBSS.
Forsigtigt dissekere ud epicardial fedt og chordae tendineae fra prøven. Ved hjælp af en steril klinge eller saks dissekeres vævsstykkerne i stykker, der vejer ca. 200 mg. Efter euthanizing musen, åbne brysthulen ved hjælp af skarpe saks.
Brug stumpe hemostats til at løfte hjertet opad. Se hjertet med kold PBS ved hjælp af en 25 gauge nål fastgjort til en fem milliliter sprøjte. Se på, indtil hjertet ser ud blancheret i farver.
Fjern hjertet og læg det i en steril petriskål på is. Placer 200 milligram humant hjertevæv stykker eller murine hjerte i en steril petriskål. Hak vævet fint med en steril klinge eller saks.
At oprette fordøjelser, i en 15 milliliter konisk rør, forberede en endelig fordøjelse volumen af tre milliliter for hver humane hjertevæv luns eller en murine hjerte med enzymer kollagen I, DNase I, og hyaluronidase ved koncentrationer på 450, 60, og 60 enheder pr milliliter. Der tilsættes 2,5 milliliter DMEM i røret. Ved hjælp af rene snævninger anbringes det fint hakkede væv i hvert reaktionsrør.
Bland godt ved blid vortexing. Fordøje i en time ved 37 grader Celsius i en rystende inkubator indstillet til en lav til medium agitation hastighed. Efter en times fordøjelse, tage rørene ud fra rugemaskinen og sted på is.
Opsæt 50 milliliter koniske rør med en 40 mikron celle si på toppen. Våd filtrene med to milliliter enzymdeaktiveringsbuffer. Dernæst deaktivere fordøjelseen enzymer ved at tilføje otte milliliter enzym deaktivering buffer til hver fordøjelsesrør.
Hæld derefter de resulterende 13 milliliter af den samlede blanding gennem 40 mikrocellestingen i de 50 milliliter koniske rør. De filtrerede prøver overføres tilbage i friske 15 milliliter koniske rør. Drej prøverne ved 400 gange g i seks minutter ved fire grader Celsius.
Kassér supernatanten, der efterlader 0,5 milliliter medier. Resuspend cell pellet ved blid pipettering og tilsæt en milliliter ACK lysis buffer. Blid hvirvel røret og inkubere ved stuetemperatur i fem minutter til at udføre røde blodlegemer lysis.
Efter fem minutter i ACK-buffer tilsættes der ni milliliter DMEM til prøven. Sæt låget tilbage på rørene og forsigtigt vende rørene til at blande. Gennem en 40 mikrocelles si filtreres gennem og filtratet opsamler i 15 milliliter koniske rør.
Centrifuge rørene ved 400 gange g i seks minutter og kassér supernatanten. Tilsæt en milliliter FACS buffer og resuspend pellet. Derefter overføres det til et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør.
Centrifuge igen ved 400 gange g i fem minutter. Kassér supernatanten og opsplit pellet i 100 mikroliter af FACS buffer. En enkelt celle suspension er nu klar til antistof farvning.
Tilføj en typisk humant antistof panel til hjertet prøver på en til 50 fortynding. Brug forskellige antistoffer til stromale celler og murine hjerte makrofager. Inkubere i 30 til 40 minutter ved fire grader Celsius i mørke.
Tilsæt en milliliter FACS buffer, forsigtigt vortex og centrifuge ved 400 gange g i fem minutter. Gentag dette vasketrin en gang til. Derefter opslæmmes prøven i 350 mikroliter FACS-buffer, og DAPI tilsættes for at opnå en endelig koncentration af en mikromolar.
Prøverne er nu klar til FACS-analyse. I denne protokol blev der opnået isolering af makrofager fra mus og humant myokardi. Denne figur viser uforarbejdede og forarbejdede menneskelige LVAD kerne.
Gating ordningen for flow sortering af CCR2 negative og CCR2 positive menneskelige makrofager fra humant myokardi samt for CD45 negative stromale celler fra human iskæmisk kardiomyopati blev præsenteret. Billederne af Wright farves FACS sorteret CD45 positive og CD45 negative celler viser intakt cellemembran angiver levedygtighed. Gating ordningen for at sortere makrofager fra en mus hjerte var også en succes.
Vægten af det væv, der anvendes til enzymatisk reaktion, er afgørende for en effektiv fordøjelse. Brug ikke mere end 200 milligram væv til de enzymkoncentrationer, der er angivet i protokollen. Efter denne metode kan celler dyrkes til in vitro stimulation assays.
Celler kan sorteres til bulk RNA-sekvensering eller enkeltcellesekventering. Denne metode har tjent som en uvurderlig teknik til at opdage den tidligere ukendte makrofag heterogenitet, der er til stede i det sunde eller syge menneskelige hjerte. Ved hjælp af denne metode efterfulgt af enkelt celle sekventering, undersøgelser er i gang for at afdække, hvordan forskellige immun og ikke-immun celler varierer fra syge hjerte versus det sunde hjerte.
Præsenteret her er en protokol til at isolere forskellige undergrupper af makrofager og andre ikke-immunceller fra menneske og mus myokardiet ved at forberede en enkelt cellesuspension gennem enzymatisk fordøjelse. Gating ordninger for flow cytometri baseret identifikation og karakterisering af isolerede makrofager er også præsenteret.
Read Article
Cite this Article
Bajpai, G., Lavine, K. J. Isolation of Macrophage Subsets and Stromal Cells from Human and Mouse Myocardial Specimens. J. Vis. Exp. (154), e60015, doi:10.3791/60015 (2019).
Copy