Isolatie van macrofaag subsets en stromale cellen van myocardiale monsters van mens en muis

Hart bevat heterogene populatie van immuuncellen die een cruciale rol spelen bij hartontsteking en reparatie. Om de heterogeniteit van immuuncellen te begrijpen en meer inzicht te krijgen in hun functie, is het belangrijk om een methode te hebben die het herstel van deze cellen uit het hart mogelijk maakt. Deze techniek kan helpen bij het ontdekken van de immuun-en niet-immuuncel diversiteit die zich in het gezonde of een zieke hart.

Er zijn drie belangrijke voordelen aan deze techniek. Ten eerste is het een eenvoudige enkele workflow die leidt tot het genereren van eencellige suspensie van verschillende celtypen binnen drie uur. Ten tweede leidt het tot een hoog herstel van levensvatbare immuun- en niet-immuuncelpopulaties.

Ten derde is het een zeer veelzijdige methode en kan het ook worden toegepast op hartweefsels in andere soorten. Aandacht besteden aan de hoeveelheid weefsel die wordt gebruikt voor een enkele spijsvertering reactie is belangrijk. Gebruik steriele schaar, ontleden weefsel monster van de apicale of laterale wand van de linker ventrikel in koude zoutoplossing of HBSS.

Zorgvuldig ontleden epicardial vet en chordae tendineae uit het monster. Met behulp van een steriel mes of schaar ontleed je de weefselbrokken in stukken van ongeveer 200 milligram. Na het euthanaseren van de muis, open de borstholte met behulp van een scherpe schaar.

Gebruik stompe hemostats om het hart omhoog te tillen. Doorspeil het hart met koude PBS met behulp van een 25-meter naald bevestigd aan een vijf milliliter spuit. Doorsnauw tot het hart geblancheerd in kleur lijkt.

Verwijder het hart en plaats het in een steriel petrischaaltje op ijs. Plaats 200 milligram menselijk hartweefsel brokken of murine hart in een steriele petrischaal. Maak het weefsel fijn met een steriel mes of schaar.

Voor het opzetten van digesties, in een 15 milliliter conische buis, bereiden een laatste spijsvertering volume van drie milliliter voor elke menselijke cardiale weefsel brok of een murine hart met enzymen collagenase I, DNase I, en hyaluronidase bij concentraties van 450, 60, en 60 eenheden per milliliter. Voeg 2,5 milliliter DMEM toe aan de buis. Plaats met behulp van schone tangen het fijngehakte weefsel in elke reactiebuis.

Meng goed door zachte vortexing. Verteren voor een uur op 37 graden Celsius in een schudden incubator ingesteld op een lage tot gemiddelde agitatie snelheid. Na een uur van de spijsvertering, neem de buizen uit de incubator en plaats op ijs.

Zet 50 milliliter conische buizen met een 40 micron cel zeef op de top. Maak de filters nat met twee milliliters enzymdeactiveren buffer. Schakel vervolgens de spijsverteringsenzymen uit door acht milliliter enzymdeactiverende buffer toe te voegen aan elke spijsverteringsbuis.

Giet vervolgens de resulterende 13 milliliter van het totale mengsel door de 40 micron cel zeef in de 50 milliliter conische buizen. Breng de gefilterde monsters terug in verse 15 milliliter conische buizen. Draai de monsters op 400 keer g gedurende zes minuten op vier graden Celsius.

Gooi de supernatant verlaten 0,5 milliliter media. Resuspend de cel pellet door zachte pipetting en voeg een milliliter van ACK lyse buffer. Voorzichtig wervelen de buis en uitbroeden bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten om rode bloedcel lyse uit te voeren.

Voeg na vijf minuten in de ACK-buffer negen milliliter DMEM toe aan het monster. Doe het deksel terug op de buizen en draai de buizen voorzichtig om om te mengen. Filtreer door een 40 micron celzeef en verzamel het filtraat in 15 milliliter conische buizen.

Centrifuge de buizen op 400 keer g gedurende zes minuten en gooi de supernatant. Voeg een milliliter FACS buffer toe en versuspen de pellet. Breng het vervolgens over op een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter.

Centrifuge opnieuw op 400 keer g gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant weg en verleg de pellet in 100 microliter facs-buffer. Een enkele cel suspensie is nu klaar voor antilichaam vlekken.

Voeg een typisch menselijk antilichaam paneel aan het hart monsters op een tot 50 verdunning. Gebruik verschillende antilichamen voor stromale cellen en murine hart macrofagen. Incubeer gedurende 30 tot 40 minuten bij vier graden Celsius in het donker.

Voeg een milliliter FACS buffer, voorzichtig vortex en centrifuge op 400 keer g gedurende vijf minuten. Herhaal deze wasstap een tweede keer. Vervolgens resuspend het monster in 350 microliters van FACS buffer en voeg DAPI om een definitieve concentratie van een micromolar te bereiken.

De monsters zijn nu klaar voor FACS analyse. In dit protocol werd isolatie van macrofagen van muis en menselijk myocardium bereikt. Deze figuur toont onbewerkte en verwerkte menselijke LVAD kern.

De gating regeling voor de stroom sorteren van CCR2 negatieve en CCR2 positieve menselijke macrofagen van menselijke myocardium evenals voor CD45 negatieve stromal cellen uit menselijke ischemische cardiomyopathie werden gepresenteerd. De beelden van Wright gekleurd FACS gesorteerd CD45 positieve en CD45 negatieve cellen tonen intact celmembraan aangeeft levensvatbaarheid. Het gatingschema om macrofagen uit een muizenhart te sorteren was ook succesvol.

Gewicht van het weefsel dat wordt gebruikt voor enzymatische reactie is van cruciaal belang voor een efficiënte spijsvertering. Gebruik niet meer dan 200 milligram weefsel voor de enzymconcentraties die in het protocol zijn aangegeven. Volgens deze methode kunnen cellen worden gekweekt voor in vitro stimulatietesten.

Cellen kunnen worden gesorteerd op bulkRNA-sequencing of single cell sequencing. Deze methode heeft gediend als een onschatbare techniek bij het ontdekken van de niet eerder erkende macrofaag heterogeniteit die aanwezig is in de gezonde of zieke menselijke hart. Met behulp van deze methode gevolgd door eencellige sequencing, studies zijn aan de gang om te ontdekken hoe verschillende immuun-en niet-immuuncellen variëren van zieke hart versus het gezonde hart.