Isolering av makrofager subsets och stromaceller från Human-och mus-Myokarprover

Hjärtat innehåller heterogena populationen av immunceller som spelar avgörande roller i hjärtinflammation samt reparation. För att förstå heterogeniteten hos immunceller och få ytterligare insikt i deras funktion är det viktigt att ha en metod som gör det möjligt för återhämtning av dessa celler från hjärtat. Denna teknik kan hjälpa avslöja immun samt nonimmune cell mångfald som finns i friska eller ett sjuka hjärta.

Det finns tre huvudsakliga fördelar med denna teknik. Först är det ett enkelt enda arbetsflöde som leder till generering av encellsupphängning av olika celltyper inom tre timmar efter tid. För det andra leder det till hög återhämtning av livskraftiga immun- och nonimmune-cellpopulationer.

Och för det tredje, det är en mycket mångsidig metod och kan tillämpas på hjärtvävnader i andra arter också. Att uppmärksamma mängden vävnad som används för en enda matsmältningsreaktion är viktigt. Använd steril sax, dissekera vävnadsprov från den apikala eller laterala väggen i den vänstra ventrikeln i kall saltlösning eller HBSS.

Dissekera försiktigt ut epissiellt fett och chordae tendineae från exemplaret. Med hjälp av ett sterilt blad eller sax, dissekera vävnaden bitar i bitar som väger cirka 200 milligram. Efter att du har avlivat musen öppnar du brösthålan med hjälp av vassa saxar.

Använd trubbig hemostats för att lyfta hjärtat uppåt. Genomsyra hjärtat med kall PBS med hjälp av en 25 gauge nål fäst på en fem milliliter spruta. Genomsyra tills hjärtat verkar blancherat i färg.

Ta bort hjärtat och placera det i en steril Petriskål på is. Placera 200 milligram av mänskliga hjärtvävnad bitar eller murine hjärta i en steril Petriskål. Finhacka vävnaden med hjälp av ett sterilt blad eller en sax.

För att ställa in matsmältningar, i en 15 milliliter koniska rör, förbereda en slutlig matsmältningsvolym på tre milliliter för varje mänsklig hjärtvävnad bit eller en murine hjärta med enzymer kollagenas I, DNase I, och hyaluronidase i koncentrationer av 450, 60 och 60 enheter per milliliter. Tillsätt 2,5 milliliter DMEM i röret. Med hjälp av rena tlycper placerar du den finhackade vävnaden i varje reaktionsrör.

Blanda väl genom mild virvelning. Smält i en timme vid 37 grader Celsius i en skakande inkubator inställd på en låg till medelhög agitation hastighet. Efter en timmes matsmältning, ta rören ut från inkubatorn och placera på is.

Ställ in 50 milliliter koniska rör med en 40 mikron cell sil på toppen. Blöt filtren med två milliliter enzymavaktiverande buffert. Därefter inaktiverar du digestionsenzymerna genom att lägga till åtta milliliter enzym som avaktiverar buffert till varje matsmältningsrör.

Häll sedan de resulterande 13 milliliter av total blandning genom 40 mikron cell sil i 50 milliliter koniska rör. Överför de filtrerade proverna tillbaka i färska 15 milliliter koniska rör. Snurra proverna på 400 gånger g i sex minuter vid fyra grader Celsius.

Kassera supernatanten som lämnar 0,5 milliliter media. Resuspend cell pelleten genom skonsam pipettering och tillsätt en milliliter av ACK lysbuffert. Försiktigt virvla röret och inkubera i rumstemperatur i fem minuter för att utföra röda blodkroppar lys.

Efter fem minuter i ACK-buffert lägger du till nio milliliter DMEM i provet. Sätt tillbaka locket på rören och försiktigt invertera rören för att blanda. Filtrera genom en 40 mikron cell sil och samla filtratet i 15 milliliter koniska rör.

Centrifugera rören vid 400 gånger g i sex minuter och kassera supernatanten. Tillsätt en milliliter FACS-buffert och återanvänd pelleten. Överför sedan den till ett 1,5 milliliter mikrocentrifugrör.

Centrifugera igen vid 400 gånger g i fem minuter. Kassera supernatanten och resuspend pelleten i 100 mikroliter av FACS-buffert. En enda cell suspension är nu redo för antikropp färgning.

Lägg till en typisk human antikroppspanel till hjärtproverna vid en till 50 utspädning. Använd olika antikroppar för stromal celler och murin hjärta makrofager. Inkubera i 30 till 40 minuter vid fyra grader Celsius i mörkret.

Tillsätt en milliliter FACS buffert, försiktigt virvel och centrifug vid 400 gånger g i fem minuter. Upprepa detta tvättsteg en andra gång. Sedan resuspend provet i 350 mikroliter av FACS buffert och tillsätt DAPI att nå en slutlig koncentration av en mikromolar.

Proverna är nu klara för FACS-analys. I detta protokoll uppnåddes isolering av makrofager från mus och humant myokardium. Denna figur visar obearbetade och bearbetade mänskliga LVAD kärna.

Gating systemet för flödet sortering av CCR2 negativa och CCR2 positiva mänskliga makrofager från mänskliga hjärtmuskeln samt för CD45 negativa stromal celler från mänskliga skandinaviska kardiomyopati presenterades. Bilderna av Wright färgade FACS sorterade CD45 positiva och CD45 negativa celler visar intakt cellmembranet indikerar lönsamhet. Den gating system för att sortera makrofager från en mus hjärta var också framgångsrik.

Vikt av vävnaden som används för enzymatisk reaktion är avgörande för effektiv matsmältning. Använd inte mer än 200 milligram vävnad för de enzymkoncentrationer som anges i protokollet. Efter denna metod kan celler odlas för in vitro-stimuleringsanalyser.

Celler kan sorteras för bulk RNA-sekvensering eller enkelcellssekvensering. Denna metod har fungerat som en ovärderlig teknik för att upptäcka den tidigare okända makrofagheterogenitet som finns i friska eller sjuka mänskliga hjärtat. Med denna metod följt av single cell sekvensering, studier pågår för att avslöja hur olika immun och nonimmune celler varierar från sjuka hjärtat kontra det friska hjärtat.