Enda synaps indikatorer på glutamat release och upptag i akut hjärnskivor från normala och Huntington Möss

Högupplöst bildbehandling av enstaka synapser som uttrycker en snabb glutamatsensor möjliggör en detektering av lokal obalans mellan sändare release och upptag. När det gäller sjukdom kan denna metod användas för att identifiera dysfunktionella synapser. För autofluorescenskorrigering, placera först en hjärnskiva från musen av intresse i inspelningskammaren av ett fotonmikroskop.

Submerge skivan i syresatt, konstgjord cerebrospinalvätska och använda 20x vatten-nedsänkning mål att lokalisera dorsala striatum. Fixa skivorna med ett nylongaller på en platinaharpa för att minimera vävnadsrörelsen och byt till 63x-vattenbadsmålet. Med hjälp av ett högpassfilter vid 510 nanometer, förvärva en bild av den autofluorescerande och glutamat sensor positiva strukturer tillsammans.

Med hjälp av ett högpassfilter vid 600 nanometer, skaffa en andra bild av de autofluorescerande strukturerna ensam. Om du vill definiera området använder du de medelintensiteter som de 10 ljusaste och 10 mörkaste pixlarna ger när du vill skala de röda och gula bilderna. Sedan utför en subtraktion av den gula minus röda bilden och skala om den subtraherade bilden för att generera en vanlig 8-bitars TIFF-fil för bekväm visualisering av bouton av intresse.

För att göra en sökning efter responsiva boutons behöver du en lämplig mikropipette av glas för elektrisk stimulering. Använd en mikropipette puller för att producera stimuleringspipetter från borosilikatglas kapillärer med inre spetsdiametrar på cirka en mikrometer. För att undersöka för åtgärdspotential beroende frisättning av glutamat från en uppsättning kandidat boutons, välj en 63x förstoring och en 510 nanometer utsläppsfilter.

Ladda den subtraherade bilden för att tillåta placering av en glasstimuleringselektrod bredvid en fluorescerande varicositet, undvika närheten till ytterligare axoner. I vad varicosities associerade med en maximal bifurkation eller allokering inom djupare del av segmentet. Placera stimuleringselektroden nära bouton av intresse och släck ljuset, eftersom inspelningarna måste utföras i fullständigt mörker.

Sedan slår du på flerkanalsbad applikationssystemet, med en kanal leverera standard badlösningen och de andra kanalerna leverera nödvändiga blockerare av jonkanaler, transportörer, eller membranreceptorer, inklusive tetrototoxin för att blockera åtgärder potentiella generering. Styr flödet på platsen för inspelningen och slå på stimulatorn för att leverera depolariserande strömpulser på två till 10 mikroamar till stimuleringspipetten. Utgåvan aktiveras nu genom direkt kalciumtillströmning genom spänningsgrindkanaler.

För att visualisera glutamatfrisättning i clearance, med hjälp av mikroskopet X, Y-enheter, placera den testade glutamatsensorns positiva bouton nära viewfield-centret. Efter att ha stoppat förvärvet, klicka på bilden med vänster musknapp för att bestämma X, Y position av vilande bouton centrum. Den X, Y koordinater av den inställda markören kommer att visas.

Beräkna med hjälp av kalibreringsdata koordinaterna för den plats där laserstrålen ska skickas för excitation av glutamatsensorns fluorescens med hjälp av formlerna enligt angivan. Om du vill skapa en enpunktssekvens i laserkontrollprogramvaran väljer du punkt i rutan Lägg till i sekvens på sekvenssidan för laserkontrollprogramvaran och ställer in körningen och körfördröjningen till noll, och sekvensen som ska köras vid TLL. Klicka sedan på startsekvens.

I programvaran för kamerakontroll väljer du lämpliga bildtagningsparametrar och väljer extern start för utlösningsläget. Klicka på ta signal i programvaran kamerakontroll. Initiera sedan det experimentella protokoll som fastställts för utlösarenheten och implementera försöksförsöket för experimentella protokoll med lämplig tidslinje, så att kameran kommer att förvärva 400 bildrutor med en frekvens på 2,48 kilohertz under en försök, med en 0,1 hertz eller lägre repetitionsfrekvens.

För att identifiera patologiska synapser, slå på höjdrutinerna och beräkna fluorescensintensiteten, medelvärdet och standardavvikelsen för den valda intresseregionen i vila. Bestäm och rutan området upptas av pixlar med en fluorescens intensitet i vila större än medelvärdet plus tre standardavvikelser, och bestämma en virtuell diameter i mikrometer förutsatt en cirkulär form av den översta tröskelområdet. Plotta fluorescensintensiteten mot tiden, eftersom skillnaden mellan det faktiska fluorescensintensitetsvärdet och fluorescensintensitetsvärdet i vila dividerat med fluorescensintensitetsvärdet i vila.

Bestäm toppamplituden för fluorescenssvaret. Utför en monoexponential montering för sönderfallet från toppen av fluorescens svaret, och bestämma tidskonstanten av förfall, TauD. För att uppskatta maximal amplituden vid en given synaps väljer du pixeln med den högsta förändringen i fluorescensintensitet, vilket är den bästa indikatorn för glutamatbelastningen som presenteras för synapsens clearancemaskineri.

Enkel synaps imaging kan användas för att identifiera två klasser av corticostriatal synapser med hjälp av storlek och paras puls förhållandet kriterier. Vid stimulans intervall 20 till 50 millisekunder, de mindre interenterochephalic terminalerna är benägna att parade puls depression, medan de större pyramidal tract terminaler visade parade puls underlättande. Tester på motoriskt beteende som utförs på möss av vildtyp och möss som uttrycker en Huntington-fenotyp, avslöjar en signifikant positiv coorelation mellan de resultat som erhållits för den totala banan som körs i det öppna fältet och steget över latens.

Vidare visar enstaka synapse glutamat imaging att symptomatiskt Huntington möss uppvisade ett underskott i hastigheten på juxtasynpatisk glutamat förfall som återspeglas i TauD värdena av glutamat svaren på enda synaps stimulering. Hos djur av vild typ observerades sådan förlängning först efter applicering av en selektiv, icke transportabel hämmare av glutamatupptag. Utvärdering av sannolikheten för förekomst av ett givet TauD-värde i skivor från möss av vildtyp, och möss som uttrycker symptomen på Huntingtons sjukdom, visade att hos vilda djur överstiger TauD aldrig 15 millisekunder.

Vid symptomatisk Huntingtons sjukdom uppvisar dock 40%av synapserna TauD-värden mellan 16 och 58 millisekunder, trots en tendens till en minskning av mängden frisläppt glutamat. Därför kan TauD betraktas som en biomarkör för dysfunktionella synapser vid Huntingtons sjukdom, och kan vidare användas för att verifiera funktionell återhämtning i experiment som riktar sig mot astrocytisk glutamattransport. Detta protokoll för glutamat övervakning vid enskilda corticostriatal synapses kan bidra till att klargöra rollen av glutamat upptag brist i patogenesen vid neurodegenerativa sjukdom.

Enda synaps imaging är särskilt användbart för att utforska pre-synaptiska platser av retande synapser.