Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Purkinje-celoverleving in Organotypische cerebellaire segment culturen
Chapters
Summary December 18th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Organotypische segment culturen zijn een krachtig hulpmiddel om neuroontwikkelingsof degeneratieve/regeneratieve processen te bestuderen. Hier beschrijven we een protocol dat de neuroontwikkelingsdood van Purkinje-cellen in muizen cerebellaire segment culturen modelheeft. Deze methode kan profiteren van onderzoek in neuroprotectieve Drug Discovery.
Transcript
Organotypic slice cultuur is een krachtig instrument voor het bestuderen van neuroontwikkeling en degeneratieve of regeneratieve processen. Deze techniek kan worden gebruikt om snel kandidaat moleculen screenen op hun neuroprotectieve potentieel. Deze methode bootst in vivo omstandigheden nauw na, in vergelijking met gescheiden primaire celculturen, omdat de weefselsetarchitectuur en inheemse celcelverbindingen binnen de vlakken van de secties worden bewaard.
Hier tonen we de studie van Purkinje celdood in het zich ontwikkelende cerebellum. Maar organotypic slice cultuur is even geschikt om neurodegeneratieve ziekten model in bijna elk centraal zenuwstelsel regio. Het aantonen van de procedure met Jennifer Rakotomamonjy zal Sean McDermott, een technicus van mijn laboratorium.
Voor het oogsten van de cerebellar plakjes, in een gesteriliseerde bioveiligheid kabinet, vul elke put van een zes-put cultuur plaat met een milliliter van vacuüm gefilterde cultuur medium, en voeg de farmacologische agent van belang aan de behandeling putten, en een gelijk volume van het voertuig aan de controle putten. Met behulp van steriele tangen, plaats een 0,4-micrometer porie grootte PTFE membraan filter invoegen in elke put, waarbij ervoor wordt gezorgd dat bellen op de interface van elk membraan en het medium te voorkomen, en equilibrate het medium in een 37 graden Celsius en 5% kooldioxide incubator voor twee uur. Om het cerebellum te oogsten, gebruik je rechte dressingforceps om het hoofd van de pup bij de neus te grijpen en gebruik je rechte oogschaar om de hoofdhuid van het achterste uiteinde zijdelings naar de middellijn te snijden.
Snijd de schedel open op dezelfde manier, wijzen de schaar tips naar buiten om te voorkomen dat beschadiging van het cerebellum, en gebruik een spatel om de hersenen over te dragen aan een 60-millimeter schotel met koude HBSS en vijf milligram per milliliter glucose. Gebruik de rechte dressing tangen om zorgvuldig ontleden van de cerebellum, en gebruik steriele gebogen fijne tangen om het weefsel te plaatsen op een plastic schijf op de snijtafel van een weefsel chopper. Draai de snijtafel om het weefsel te oriënteren om de verwerving van parasagittale secties mogelijk te maken en trek de tafelaftrekknop naar rechts om de snijtafel te verplaatsen totdat het blad aan de rand van het weefsel is geplaatst.
Stel vervolgens de plakdikte aan op 350 micrometer en de bladsnelheid op medium en start de chopper. Wanneer het hele cerebellum is gesneden, zet u de helikopter uit. Houd de schijf met behulp van steriele tangen over een nieuwe schaal van 60 millimeter.
Gebruik een transfer pipet om HBSS plus glucose over de schijf te spoelen, zodat de plakjes in de schaal vallen. Vervolgens, het aanraken van de monsters zo minimaal mogelijk, gebruik maken van een microsonde om de plakjes te scheiden. Gebruik de overdracht pipet om delen van het cerebellum dicht bij de vermis te selecteren op individuele celcultuur inserts in de zes-put plaat, en gebruik de microprobe om de plakjes positie in het midden van elke insert.
Wanneer alle plakjes zijn geplaatst, zorgvuldig aspirate eventuele overtollige HBSS plus glucose, en de plaat terug te keren naar de cel cultuur incubator. Voor immunofluorescentie kleuring, verwijder de supernatant uit elke put, en was de inserts met PBS. Bevestig de plakjes met een milliliter koude 4%paraformaldehyde in de put van elke insert, en 500 microliter op de top van elke insert voor een uur.
Aan het einde van de fixatie, was de inzetstukken vier keer gedurende 10 minuten met een milliliter verse PBS onder elke insert en 500 microliter verse PBS op de top van elke insert per wasbeurt op een orbitale shaker. Vul elke put van een 24-put plaat voor met 500 microliters PBS-TB en gebruik een penseel om de cerebellar-plakjes van elke celcultuur over te brengen in afzonderlijke putten van een 24-putplaat. Doordringt en blokkeer de plakjes op kamertemperatuur gedurende een uur.
Aan het einde van de incubatie, etiketteren de cellen met 200 microliters van de primaire antilichaam van belang verdund in PBS-TB per goed 's nachts op vier graden Celsius op de orbitale shaker. De volgende ochtend was je de plakjes vier keer gedurende 10 minuten en 500 microliters verse PBS per wasbeurt op de shaker, voordat je de monsters labelt met de juiste fluorofoforische secundaire antilichamen gedurende twee uur bij kamertemperatuur op de shaker, beschermd tegen licht. Aan het einde van de incubatie, tegensmet de secties met 500 microliters van een geschikte nucleaire vlek per put gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.
En gebruik een transfer pipet om de plakjes op glazen platen te monteren. Laat vervolgens de secties lucht volledig drogen voordat ze hydrateren met PBS en de weefsels monteren met coverslips bedekt met ongeveer 80 microliters van montagemedium. Zodra het montagemedium is uitgehard, zijn de cerebellar secties klaar om in beeld te worden afgebeeld.
Op postnatale dag zes, Purkinje cel overleving is laag in de controle monsters, in overeenstemming met hun bekende kwetsbaarheid venster. De overleving neemt toe naarmate het donordier ouder wordt en deze kritieke periode verlaat. De behandeling van cerebellar-plakjes met een hoge concentratie kaliumchloride resulteert in een succesvolle inductie van hun depolarisatie en overleving.
Om consistente en reproduceerbare resultaten te verkrijgen, is het van cruciaal belang om gezonde cerebellar-secties te selecteren en de cultuuropstelling zo efficiënt mogelijk uit te voeren. Post-cultuurtoepassingen gaan verder dan immunofluorescentie. Als organotypic plakjes kunnen worden gebruikt voor genoom eiwit expressie studies, en voor het toezicht op neuronale circuit activiteit met behulp van elektrofysiologie en calcium live imaging.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
