Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Purkinje Cell выживания в органотипической церебеллярной части культур
Chapters
Summary December 18th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Органотипические срезные культуры являются мощным инструментом для изучения нейроразвития или дегенеративных / регенеративных процессов. Здесь мы описываем протокол, который моделирует нейроразвитие смерти клеток Purkinje в мыши мозжечковой культуры ломтик. Этот метод может принести пользу исследованиям в нейропротекторных открытий наркотиков.
Transcript
Органотипическая культура ломтика является мощным инструментом для изучения нейроразвития и дегенеративных или регенеративных процессов. Этот метод может быть использован для быстрого экрана молекул кандидата для их нейропротекторного потенциала. Этот метод тесно имитирует условия in vivo, по сравнению с диссоциированными культурами первичных клеток, так как архитектура тканей и родных клеточных соединений сохраняются в плоскостях секций.
Здесь мы демонстрируем изучение смерти клеток Пуркинье в развивающемся мозжечках. Но органотипическая культура ломтика одинаково подходит для моделирования нейродегенеративных заболеваний почти в каждом регионе центральной нервной системы. Демонстрацией процедуры с Дженнифер Ракотомамонджи будет Шон МакДермотт, техник из моей лаборатории.
Перед сбором мозжечковых ломтиков, в стерилизованный шкаф биобезопасности, заполнить каждый колодец из шести скважин культуры пластины с одним миллилитр вакуумной фильтрованной среды культуры, и добавить фармакологический агент интерес для обработки скважин, и равный объем транспортного средства для управления скважин. Используя стерильные тибры, поместите один 0,4-микрометровый поры размером PTFE мембранный фильтр вставить в каждую колодец, заботясь, чтобы избежать пузырьков на стыке каждой мембраны и среды, и уравночные среды в 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа инкубатор в течение двух часов. Чтобы собрать мозжечок, используйте прямые миппы для вязки, чтобы схватить щенка за нос, и использовать ножницы для прямых глаз, чтобы разрезать кожу головы от заднего конца боковой до средней линии.
Разрежьте череп таким же образом, указывая ножницами советы наружу, чтобы избежать повреждения мозжечка, и использовать шпатель для передачи мозга на 60-миллиметровое блюдо, содержащее холодный HBSS и пять миллиграммов на миллилитр глюкозы. Используйте прямые вязки соусом, чтобы тщательно вскрыть мозжечок, и использовать стерильные изогнутые тонкие миппы, чтобы поместить ткань на пластиковый диск на режущей таблице измельчителя ткани. Поверните режущие таблицы, чтобы сориентировать ткань, чтобы приобретение паразагиттальных секций, и потяните ручку выпуска стола вправо, чтобы переместить режущей стол, пока лезвие не будет расположено на краю ткани.
Затем отрегулируйте толщину ломтика до 350 микрометров, а скорость лезвия до средней, и запустите вертолет. Когда весь мозжечок будет разрезан, выключите вертолет. Используя стерильные типсы, держите диск над новым 60-миллиметровым блюдом.
Используйте передачу пипетки, чтобы промыть HBSS плюс глюкозу над диском, так что ломтики попадают в блюдо. Затем, касаясь образцов как можно меньше, используйте микропроб, чтобы отделить ломтики. Используйте передачу пипетки, чтобы выбрать разделы мозжечка близко к верме на отдельные вставки культуры клеток в шесть хорошо пластины, и использовать микропроб для позиционирования ломтиков в центре каждой вставки.
Когда все ломтики были помещены, тщательно аспирировать любые излишки HBSS плюс глюкоза, и вернуть пластину в инкубатор культуры клеток. Для окрашивания иммунофторесценции, удалить супернатант из каждого хорошо, и мыть вставки с PBS. Зафиксировать ломтики с одним миллилитров холодного 4%paraformaldehyde в хорошо каждой вставки, и 500 микролитров на верхней части каждой вставки в течение одного часа.
В конце фиксации, мыть вставки четыре раза в течение 10 минут с одним миллилитров свежего PBS под каждой вставкой и 500 микролитров свежего PBS поверх каждой вставки на стирку на орбитальном шейкере. Предварительно заполните каждый колодец 24-хорошо пластины с 500 микролитров PBS-TB, и использовать кисть для передачи мозжечковых ломтиков из каждой клеточной культуры вставить в отдельные колодцы 24-хорошо пластины. Permeabilize и блокировать ломтики при комнатной температуре в течение одного часа.
В конце инкубации, этикетка клеток с 200 микролитров первичного антитела интерес разбавленной в PBS-TB на ночь при четырех градусах по Цельсию на орбитальном шейкере. На следующее утро, мыть ломтики четыре раза в течение 10 минут и 500 микролитров свежего PBS на стирку на шейкере, прежде чем маркировать образцы с соответствующими фторфор-конъюгированных вторичных антител в течение двух часов при комнатной температуре на шейкере, защищенный от света. В конце инкубации счетчики с 500 микролитров соответствующего ядерного пятна на колодец в течение 10 минут при комнатной температуре, защищенные от света.
И использовать передачу пипетки для установки ломтиков на стеклянные горки. Затем дайте секциям полностью высохнуть перед регидратанием с помощью PBS и монтажом тканей с крышками, покрытыми примерно 80 микролитров монтажной среды. После того, как монтажная среда вылечилась, мозжечковые секции готовы к изображению.
На послеродовой шестой день выживаемость клеток Пуркинье низка в контрольных образцах, что соответствует их известному окну уязвимости. Выживаемость увеличивается по мере того, как животное-донор стареет и выходит из этого критического периода. Лечение мозжечковых ломтиков с высокой концентрацией хлорида калия приводит к успешной индукции их деполяризации и выживания.
Для получения последовательных и воспроизводимых результатов крайне важно выбрать здоровые мозжечковые секции и как можно более эффективно выполнять настройку культуры. Пост-культурные приложения выходят за рамки иммунофлуоресценции. Как органотипические ломтики могут быть использованы для исследования экспрессии белка генома, а также для мониторинга активности нейрональной цепи с использованием электрофизиологии и живой визуализации кальция.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
