Neuroscience
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ऑर्गानोटिपिक सेरिबेलर स्लाइस संस्कृतियों में पुरकिंजे सेल सर्वाइवल
Chapters
Summary December 18th, 2019
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ऑर्गानोटिक स्लाइस संस्कृतियां न्यूरोडेवलपमेंटल या अपक्षयी/पुनर्योजी प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हैं । यहां, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो माउस सेरिबेलर स्लाइस संस्कृतियों में पुरकिंजे कोशिकाओं की न्यूरोडेवलपमेंटल डेथ को मॉडल करता है। इस विधि से न्यूरोप्रोटेक्टिव ड्रग डिस्कवरी में शोध को फायदा हो सकता है।
Transcript
ऑर्गेनोटिपिक स्लाइस संस्कृति न्यूरोडेवलपमेंटल और अपक्षयी या पुनर्योजी प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। इस तकनीक का उपयोग उम्मीदवार अणुओं को उनकी न्यूरोप्रोटेक्टिव क्षमता के लिए तेजी से स्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है। यह विधि विवो स्थितियों में बारीकी से नकल करती है, अलग प्राथमिक सेल संस्कृतियों की तुलना में, ऊतक सेट वास्तुकला और देशी सेल-सेल कनेक्शन वर्गों के विमानों के भीतर संरक्षित हैं।
यहां हम विकासशील सेरिबैलम में पुरकिंजे सेल डेथ के अध्ययन को प्रदर्शित करते हैं। लेकिन ऑर्गेनोटिपिक स्लाइस संस्कृति लगभग हर केंद्रीय तंत्रिका तंत्र क्षेत्र में मॉडल न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के लिए समान रूप से उपयुक्त है। जेनिफर Rakotomamonjy के साथ प्रक्रिया का प्रदर्शन शॉन मैकडरमॉट, मेरी प्रयोगशाला से एक तकनीशियन होगा ।
सेरिबेलर स्लाइस की कटाई से पहले, एक निष्फल जैव सुरक्षा कैबिनेट में, वैक्यूम-फ़िल्टर संस्कृति माध्यम के एक मिलीलीटर के साथ छह अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट के प्रत्येक कुएं को भरें, और उपचार कुओं में ब्याज के औषधीय एजेंट को जोड़ें, और नियंत्रण कुओं में वाहन की बराबर मात्रा। बाँझ संदंश का उपयोग करके, प्रत्येक झिल्ली और माध्यम के इंटरफ़ेस पर बुलबुले से बचने के लिए देखभाल करते हुए, प्रत्येक कुएं में एक 0.4-माइक्रोमीटर पोर आकार पीएफई झिल्ली फिल्टर डालें, और दो घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर में माध्यम को बराबर करें। सेरिबैलम को फसल करने के लिए, नाक से पिल्ला सिर को समझने के लिए सीधे ड्रेसिंग संदंश का उपयोग करें, और पीछे के अंत से मध्य रेखा तक खोपड़ी को खोलने के लिए सीधे आंखों की कैंची का उपयोग करें।
कट एक ही तरीके से खोपड़ी खुला, कैंची युक्तियों जावक की ओर इशारा करते हुए सेरिबैलम हानिकारक से बचने के लिए, और एक स्पैटुला का उपयोग करने के लिए एक ६० मिलीमीटर ठंड एचबीएसएस और ग्लूकोज के मिलीलीटर प्रति मिलीलीटर युक्त पकवान के लिए मस्तिष्क हस्तांतरण । सेरिबैलम को सावधानीपूर्वक विच्छेदन करने के लिए सीधे ड्रेसिंग संदंश का उपयोग करें, और ऊतक हेलिकॉप्टर की काटने की मेज पर ऊतक को प्लास्टिक डिस्क पर रखने के लिए बाँझ घुमावदार ठीक संदंश का उपयोग करें। पैरासिटाल्टल वर्गों के अधिग्रहण की अनुमति देने के लिए ऊतक को उन्मुख करने के लिए कटिंग टेबल घुमाएं, और टेबल रिलीज घुंडी को काटने की मेज को तब तक स्थानांतरित करने के लिए खींचें जब तक कि ब्लेड ऊतक के किनारे पर तैनात न हो जाए।
फिर स्लाइस मोटाई को 350 माइक्रोमीटर और ब्लेड की गति को मध्यम करने के लिए समायोजित करें, और हेलिकॉप्टर शुरू करें। जब पूरे सेरिबैलम को कटा हुआ हो, तो चॉपर बंद कर दें। बाँझ संदंश का उपयोग करना, एक नए ६० मिलीमीटर पकवान पर डिस्क पकड़ो ।
डिस्क पर एचबीएस के अलावा ग्लूकोज फ्लश करने के लिए ट्रांसफर पिपेट का इस्तेमाल करें ताकि स्लाइस डिश में गिर जाएं । फिर, नमूनों को यथासंभव कम से कम छूते हुए, स्लाइस को अलग करने के लिए माइक्रोप्रोब का उपयोग करें। छह-अच्छी प्लेट में व्यक्तिगत सेल संस्कृति सम्मिलित करने पर वर्मिस के करीब सेरिबैलम के वर्गों का चयन करने के लिए स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करें, और स्लाइस को प्रत्येक डालने के केंद्र में रखने के लिए माइक्रोप्रोब का उपयोग करें।
जब स्लाइस के सभी रखा गया है, ध्यान से किसी भी अतिरिक्त HBSS प्लस ग्लूकोज aspirate, और सेल संस्कृति इनक्यूबेटर के लिए थाली वापस । इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला करने के लिए, प्रत्येक अच्छी तरह से सुपरनैंट को हटा दें, और पीबीएस के साथ आवेषण धोएं। प्रत्येक डालने के कुएं में ठंडे 4% पैराफॉर्मल्डिहाइड के एक मिलीलीटर के साथ स्लाइस को ठीक करें, और प्रत्येक डालने के शीर्ष पर 500 माइक्रोलीटर एक घंटे के लिए।
निर्धारण के अंत में, प्रत्येक डालने के तहत ताजा पीबीएस के एक मिलीलीटर के साथ 10 मिनट के लिए चार बार आवेषण धोएं और प्रत्येक डालने के शीर्ष पर ताजा पीबीएस के 500 माइक्रोलीटर एक कक्षीय शेखर पर प्रति वॉश डालें। पीबीएस-टीबी के 500 माइक्रोलीटर के साथ 24-अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं को पूर्व-भरें, और प्रत्येक सेल संस्कृति से सेरिबेलर स्लाइस को स्थानांतरित करने के लिए एक तूलिका का उपयोग करें 24-अच्छी प्लेट के व्यक्तिगत कुओं में डालें। एक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर स्लाइस को पार करें और ब्लॉक करें।
इनक्यूबेशन के अंत में, कक्षीय शेखर पर चार डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस-टीबी प्रति अच्छी तरह से रातोंरात पतला ब्याज की प्राथमिक एंटीबॉडी के २०० माइक्रोलीटर के साथ कोशिकाओं लेबल । अगली सुबह, स्लाइस को 10 मिनट के लिए चार बार धोएं और शेकर पर प्रति वॉश ताजा पीबीएस के 500 माइक्रोलीटर, उपयुक्त फ्लोरोफोर-कंजूज्ड माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ नमूनों को लेबल करने से पहले, शेकर पर कमरे के तापमान पर दो घंटे के लिए, प्रकाश से संरक्षित। इनक्यूबेशन के अंत में, कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए अच्छी तरह से एक उपयुक्त परमाणु दाग के ५०० माइक्रोलीटर के साथ वर्गों का मुकाबला करें, जो प्रकाश से संरक्षित है ।
और ग्लास स्लाइड पर स्लाइस माउंट करने के लिए एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करें। फिर पीबीएस के साथ रिहाइड्रेटिंग से पहले वर्गों को पूरी तरह से सूखने दें और बढ़ते माध्यम के लगभग 80 माइक्रोलीटर के साथ लेपित कवरस्लिप के साथ ऊतकों को बढ़ते हैं। एक बार बढ़ते माध्यम ठीक हो जाने के बाद, सेरिबेलर वर्गों को चित्रित करने के लिए तैयार होते हैं।
प्रसवोत्तर दिन छह में, Purkinje सेल अस्तित्व नियंत्रण नमूनों में कम है, उनके ज्ञात भेद्यता खिड़की के अनुरूप । जीवित रहने के रूप में दाता जानवर बड़े बढ़ता है और इस महत्वपूर्ण अवधि से बाहर निकलता है । पोटेशियम क्लोराइड की उच्च एकाग्रता के साथ सेरिबेलर स्लाइस के उपचार के परिणामस्वरूप उनके depolarization और अस्तित्व के सफल प्रेरण होते हैं।
लगातार और प्रजनन योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए, स्वस्थ सेरिबेलर वर्गों का चयन करना और संस्कृति सेटअप को यथासंभव कुशलतापूर्वक करना महत्वपूर्ण है। संस्कृति के बाद के अनुप्रयोग इम्यूनोफ्लोरेसेंस से परे जाते हैं। ऑर्गेनोटिपिक स्लाइस का उपयोग जीनोम प्रोटीन अभिव्यक्ति अध्ययन के लिए और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और कैल्शियम लाइव इमेजिंग का उपयोग करके न्यूरोनल सर्किट गतिविधि की निगरानी के लिए किया जा सकता है।
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