A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Een bacteriële orale voedingstest met met antibiotica behandelde muggen
Chapters
Summary September 12th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Dit artikel presenteert een protocol om het effect van individuele muggendarmbacteriën te onderzoeken, inclusief isolatie en identificatie van muggenmuisculivable microben, uitputting van muggendarmen en herintroduceren van een specifieke bacteriesoort.
Transcript
Mosquito midgut herbergt een complexe gemeenschap van microben die invloed hebben op de gastheer metabolisme, reproductie, fitness, en dierenarts competentie. Bij elke darmmicrobe is een ander effect. Deze video introduceert de procedure om de respectieve rol van elke bacteriestam of gastheerfysiologie te bestuderen.
Om een cultuur van darmbacteriële kolonies te verwerven, ontleden de mug midgut onder steriele toestand. Bezoedelde de ontleed midgut, serotologinaat, en verspreid over de agar plaat. Kies enkele kolonies van de plaat en identificeer de bacteriesoorten via hun 16 SRNA-gensequentie.
Voer de muggen met COD-reliëfs met antibiotica voor opeenvolgende van drie dagen om darmmicrobiota te verwijderen. De effectiviteit van de behandeling met antibiotica kan worden bevestigd door de midgut van de aseptische mug te ontleden voor kolonievormende eenheidstest voorafgaand aan latere extremisten. Vervolgens herintroduceren specifieke bacteriën soorten die eerder geïsoleerd uit muggendarm via orale voeding test.
Het effect van bacteriën op de hostfysiologie kan worden geëvalueerd door de onbehandelde muggen, met antibiotica behandelde muggen en de muggen opnieuw specifieke terughoudendheid te vergelijken. Midgut dissectie en de cultiverbare bacteriën isolatie. Om te beginnen, verzamel de muggen in kooi met een aspirator en cel de muggen in de collectebus.
Verdoven de muggen door het onderwerpen aan een temperatuur van 4 graden gedurende drie tot vijf minuten. Houd de muggen verdoofd door ze in een ijskoud petrischaaltje te plaatsen. Desinfecteren de bank, ontleden microscoop, en tangen door het spuiten van 75%ethanol om besmetting door bacteriën uit het milieu te voorkomen.
Oppervlakte steriliseren de mug door ze drie minuten in 75% ethanol te tapsen en te schudden en spoel twee keer af met PBS-buffer. Doorsnijd de mug afzonderlijk op een steriele glazen glijbaan met uw druppel PBS. Verwijder voorzichtig de benen, vleugels en het hoofd van de mug met behulp van tangen.
Klem de borst van de mug en het laatste deel van de buik sforcept en trek uit elkaar om het spijsverteringskanaal te isoleren. Gebruik tangen om het gewas en de malpighian buis uit het spijsverteringskanaal te verwijderen. Het gewas wordt geplaatst bij de pnterior van midgut en uitstulpingen na het innemen van suikerwater.
Malpighian buizen zijn groep van slanke uitscheidingsbuizen op de kruising van midgut en hindgut. Plaats de ontleed make-up in EP buis met 200 microliters steriele PBS buffer en maal het met de steriele slijpen pastor in de schone bank. Granen om het homogenaat te laden tot drie tempo wanen bij 50 microliter van elke waan aan de LB agar plaat en wanhopige plaat.
Broed de plaat als 37 graden gedurende een tot twee dagen tot enkele kolonies haalbaar zijn. Pluk enkele kolonies in een 150 milliliter conische kolf met 50 milliliter lb bh's medium. schud de bacteriën op 37 graden 's nachts.
Identificatie van soorten. Haal TOTO DNA uit door bacteriële genomic DNA bouwkit en versterk 16 SRDNA van PCR. Herstel en de zuivering van DNA-fragmenten uit PCR-producten door Ambrose gel elektroforese en de drove recovery kit.
Uitgevoerd DNA sequencing op de gezuiverde DNA fragmenten om een bereikte bacteriën ketting sequenties hebben. Run blast zoeken naar een query de 16 SRNA gen sequentie van de bacteriën te identificeren tegen de bacteriën en de archaea en database. Identificatie van het soortenniveau werd gedefinieerd als groter dan of gelijk aan 99%16 SRDNA sequentie gelijkenis met de dichtstbijzijnde team bank entry.
Het isolaat werd toegewezen aan de overeenkomstige, geslacht wanneer is 16 SRDNA sequentie, gelijkenis was minder dan 99%en groter dan of gelijk aan 95% behandeling met antibiotica en bacterium re-introductie. wegen de vereiste hoeveelheid sacharose penicilline en streptomycine om ons 10% sacharose oplossing voor te bereiden, met inbegrip van het proberen van 20 eenheden penicilline en de 20 microgram streptomycine per milliliter. Infiltreren in de katoenen ballen in de sacharose oplossing met antibiotica en plaats het over de top van de papieren beker met mug.
Bedek de katoenen bal met een petrischaal van 10 centimeter om te voorkomen dat een waterkant verdampt. Vervang de katoenen ballen twee dagen en voer de mug voor opeenvolgende van drie dagen. Muggen zijn verdeeld in twee groepen.
De eerste groep werd geplaatst in een mug beker zonder enige behandeling, een katoenen ballen arts met 10%Zo kruis werd dagelijks gegeven. De tweede groep werd behandeld met antibiotica en drie dagen dienen. In elke groep werden Sergei muggen ontleed.
De Mika werd geëxtraheerd voor totale DNA-extractie en de QPCR werd uitgevoerd met behulp van universele bacteriën primers, figuur een toont de uitdrukking van 16 SRNA in de controlegroep en antibiotica behandeling groep. De resultaten tonen aan dat de kosten of realisatie van penicilline en streptomycine succesvol was. bereiden bacteriële oplossing, meet een bacterie oplossing in het virus met een spectrofotometer, voeg een OT bacteriën suspensie in EP buis.
Centrifuge de suspensie op 5.000 RCA gedurende vijf minuten op vier graden Gooi de supernatant, was de bacteriën pallet probeert met steriele PBS buffer. Schort de bacteriële pallet opnieuw op met 200 microliter steriele PBS-buffer Voeg 600 microliter, 10% sacharoseoplossing, 200 microliter ATP en 200 microliter bacteriële suspensie toe aan een nieuwe AP-buis en meng goed. Als alternatief kunnen de bacteriën opnieuw worden opgehangen in warmte in het activeren van uw bloed.
Bereiding van verwarming geactiveerd bloed. stolsel vers bloed met antistollingsbuis, neem twee tot drie milliliter vers bloed. centrifuge bij 1000 gedurende 10 minuten op vier graden om plasma en bloedcellen te scheiden.
Verzamel het plasma in een nieuwe EP buis en hierin activeren geactiveerd op een 56 graden gedurende een uur. Was Blast huis door je tijden met steriele PBS buffer. Spoel een zwevend blasthouse met verwarmd geactiveerd plasma.
Monteer membraan en voersysteem. Trek de filmziekte maximaal. met de kunststof ring en werkplekparafilm om te voorkomen dat het lekken langzaam de voorbereide bacteriële oplossing toevoegt aan de feeder unit, aan de maximale portemonnee.
Om te voorkomen dat de bel uit één richting viel en de feeder unit verzegelen. Sluit de voeding aan. Wacht tot de temperatuur 37 graden bereikt Geïnstalleerd de feeder unit met bacteriën oplossing op de feeder.
Voor het voeden van bacteriën moeten muggen 24 uur worden gestopt om antibiotica te metaboliseren. Voor de voereenheid op de papieren beker met muggen, laat dan 90 minuten voeden. Volledig aangemoedigde muggen kunnen worden uitgekozen voor verdere studies.
Representatieve resultaten. Figuur twee toont ons de gemiddelde lofbetuiging per mug. Na het uitzetten van met antibiotica behandelde de muggen zien we meningosepticum.
Figuur drie toont de expressie van een variant ontwikkeling gerelateerde genen 24 uur na bloedmeel met de C meningosepticum. De resultaten tonen aan dat er geen significante verandering is in de eiproductie van de controlegroep en de vervagende groep. Dank u voor uw interesse in bacteriën of een voeding essay met antibiotica behandelde muggen.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
