Login processing...

JoVE Journal
Biology
Author Produced

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Biology

En bakteriell oral fôringsanalyse med antibiotikabehandlede mygg

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Journal (Biology)

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

MRM Microcoil Performance Calibration and Usage Demonstrated on Medicago truncatula Roots at 22 T

Journal (Biology)

MRM Microcoil Performance Calibration and Usage Demonstrated on Medicago truncatula Roots at 22 T

Click here for the English version

En bakteriell oral fôringsanalyse med antibiotikabehandlede mygg

Article DOI: 10.3791/61341-v

September 12th, 2020 •

Xinyi Liu^1,2, Si Wu^1,2, Wenqian Li^1,2, Meihong Zhang^1,2, Yan Wu^1,2, Ning Zhou³, Pa Wu^1,2

¹Hunan Provincial Key Laboratory of Animal Intestinal Function and Regulation, College of Life Science, Hunan Normal University, ²State Key Laboratory of Developmental Biology of Freshwater Fish, Hunan Provincial Key Laboratory for Microbial Molecular Biology, College of Life Science, Hunan Normal University, ³Department of Infectious Diseases, the Second Xiangya Hospital, Central South University

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

September 12th, 2020

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Denne artikkelen presenterer en protokoll for å undersøke effekten av individuelle myggtarmet bakterier, inkludert isolasjon og identifisering av mygg midgut kulterbare mikrober, antibiotikauttømming av myggtarmbakterier og gjeninnføre en bestemt bakterieart.

Transcript

Mygg midgut har et komplekst fellesskap av mikrober som påvirker vertens metabolisme, reproduksjon, fitness og veterinærkompetanse. Med hver tarmmibe er en annen effekt. Denne videoen introduserer prosedyren for å studere den respektive rollen til hver bakteriestamme eller vertsfysiologi.

For å skaffe seg en kultur av tarmbakterielle kolonier, dissekere myggmidgut under steril tilstand. Jord den dissekere midgut, serotologinate, og spredt over agar plate. Velg enkeltkolonier fra platen, og identifiser bakteriearten via deres 16 SRNA gensekvens.

Mate myggene med COD Emboss som inneholder antibiotika i påfølgende tre dager for å fjerne tarmmikrobiota. Effektiviteten av antibiotikabehandling kan bekreftes ved å dissekere midgut av aseptisk mygg for kolonidannende enhetsanalyse før påfølgende ekstremister. Deretter gjeninnfører spesifikke bakteriearter som tidligere isolert fra myggtarm via oral fôringsanalyse.

Effekten av bakterier på vertsfysiologi kan evalueres ved å sammenligne de ubehandlede myggene, antibiotikabehandlede mygg og myggene gjeninnført spesifikk tilbakeholdenhet. Midgut disseksjon og dyrkingbare bakterier isolasjon. Til å begynne med, samle myggene i buret med en aspirator og celle myggene i samlingsboksen.

Bedøve myggene ved å utsette en temperatur på 4 grad i tre til fem minutter. Hold myggene bedøvet ved å plassere dem i en iskald petriskål. Desinfiser benken, dissekere mikroskop og tang ved å sprøyte 75% etanol for å unngå forurensning av bakterier fra miljøet.

Overflaten steriliserer myggen ved å teipe og riste dem i 75% etanol i tre minutter og skyll to ganger med PBS-buffer. Bisect myggen separat på en steril glasssklie som inneholder din dråpe PBS. Fjern forsiktig bena, vingene og myggens hode ved hjelp av tang.

Klem myggens bryst og den siste delen av magen var tang og trekk fra hverandre for å isolere fordøyelseskanalen. Bruk tang for å fjerne avlingen og mispighianrøret fra fordøyelseskanalen. Avlingen er plassert på pnterior av midgut og buler etter inntak av sukkervann.

Malpighian rør er gruppe av slanke ekskresjonsrør i krysset mellom midgut og bakgut. Plasser den dissekerte sminken i EP-røret med 200 mikroliter steril PBS-buffer og slip den med den sterile slipepastoren i den rene benken. Korn for å laste homogenatet til tre tempo vrangforestillinger på 50 mikroliter av hver vrangforestilling til LB agar plate og desperat plate.

Inkuber platen som 37 grader i en til to dager til enkeltkolonier er mulige. Plukk enkeltkolonier i en 150 milliliter konisk kolbe som inneholder 50 milliliter lb BH-er medium. riste bakteriene på 37 grader over natten.

Identifikasjon av arter. Trekk ut TOTO DNA med bakteriell genomisk DNA-konstruksjonssett og forsterke 16 SRDNA av PCR. Gjenoppretting og rensing av DNA-fragmenter fra PCR-produkter av Ambrose gel elektroforese og kjørte utvinning kit.

Utførte DNA-sekvensering på de rensede DNA-fragmentene for å ha en oppnådd bakteriekjedesekvenser. Kjør blast søk til en spørring 16 SRNA gensekvens av identifisere bakterier mot bakterier og arkaea og database. Identifikasjon til artsnivået ble definert som større enn eller lik 99%16 SRDNA sekvens likhet med nærmeste team bank oppføring.

Isolatet ble tildelt den til den tilsvarende slekten når det er 16 SRDNA-sekvens, likheten var mindre enn 99%og større enn eller lik 95% antibiotikabehandling og bakteriereintroduksjon. veie den nødvendige mengden sukrose penicillin og streptomycin for å forberede oss 10% sukrose løsning, inkludert å prøve 20 enheter penicillin og 20 mikrogram streptomycin per milliliter. Infiltrer bomullsballene i sukroseløsningen som inneholder antibiotika og legg den over toppen av papirkoppen som inneholder mygg.

Dekk bomullsdotten med en 10 centimeter petriskål for å hindre at en vannkanten fordamper. Erstatt bomullsballene to ganger om dagen og mat myggen i påfølgende tre dager. Mygg er delt inn i to grupper.

Den første gruppen ble plassert i en myggkopp uten behandling, noen bomullballer lege med 10%Så kors ble gitt daglig. Den andre gruppen ble behandlet med antibiotika og tjener i tre dager. I hver gruppe ble Sergei mygg dissekert.

Mika ble ekstrahert for total DNA-ekstraksjon og QPCR ble utført ved hjelp av universelle bakterier primere, figur en viser uttrykket av 16 SRNA i kontrollgruppen og antibiotika behandlingsgruppen. Resultatene viser at kostnaden eller realiseringen av penicillin og streptomycin var vellykket. forberede bakteriell løsning, måler en bakterieløsning i viruset med et spektrofotometer, tilsett en OT bakterier suspensjon i EP-rør.

Sentrifuger suspensjonen ved 5.000 RCA i fem minutter ved fire grader Kast supernatanten, vask bakteriepallforsøkene med steril PBS-buffer. Re-suspender bakteriepallen med 200 mikroliter steril PBS buffer Tilsett 600 mikroliter, 10% sukroseløsning, 200 mikroliter ATP og 200 mikroliter bakteriell suspensjon i et nytt AP-rør og bland godt. Alternativt kan bakteriene henges på nytt i varme for å aktivere blodet ditt.

Fremstilling av oppvarming aktivert blod. koagulerende friskt blod med antikoagulantrør, ta to til tre milliliter friskt blod. sentrifuge ved 1000 i 10 minutter ved fire grader for å skille plasma og blodceller.

Samle plasmaet i et nytt EP-rør og heraktiver aktivert i en 56 graders i en time. Vask Blast huset gjennom tidene dine med steril PBS buffer. Skyll suspendert blast hus med oppvarming aktivert plasma.

Monter membran og fôringssystem. Trekk filmsyken til det maksimale. fikse med plastringen og arbeidsplassen parafilm for å unngå lekkasje sakte legge forberedt bakteriell løsning til materenheten, til maksimal lommebok.

For å unngå at boblen falt fra en retning og forsegler materenheten. Koble til strømforsyningen. Vent til temperaturen når 37 grader Installert materenheten med bakterieløsning på materen.

Før fôring bakterier mygg bør stoppes i 24 timer for å metabolisere antibiotika. For mateenheten på papirkoppen med mygg, la det mate i 90 minutter. Fullt oppmuntret mygg kunne plukkes ut for videre studier.

Representative resultater. Figur to viser oss den gjennomsnittlige anerkjennelsen per mygg. Etter plottfôring av antibiotika behandlet myggene ser vi meningosepticum.

Figur tre viser uttrykket for en variant utviklingsrelaterte gener 24 timer etter blodmåltid som inneholder C meningosepticum. Resultatene viser at det ikke er noen vesentlig endring i eggproduksjonen til kontrollgruppen og falmingsgruppen. Takk for din interesse for bakterier eller et fôringsessay med antibiotikabehandlet mygg.

X

Simple Hit Counter