En bakteriel oral fodring assay med antibiotika-behandlede myg

Mosquito midgut havne et komplekst fællesskab af mikrober, der påvirker værten stofskifte, reproduktion, fitness, og dyrlægen kompetence. Med hver tarm mikrobe er en anden effekt. Denne video introducerer proceduren for at studere den respektive rolle hver bakterie stamme eller vært fysiologi.

At erhverve en kultur af gut bakterielle kolonier, dissekere myg midgut under steril tilstand. Jord dissekere midgut, serotologisk, og spredt over agar plade. Vælg enkelte kolonier fra pladen, og identificer bakteriearten via deres 16 SRNA-gensekvens.

Fodre myg med COD Prægning indeholdende antibiotika i træk på tre dage for at fjerne tarm mikrobiota. Effektiviteten af antibiotikabehandling kan bekræftes ved at dissekere midgut af aseptiske myg for koloni danner enhed analyse forud for efterfølgende ekstremister. Derefter genindføre specifikke bakterier arter, der tidligere isoleret fra myg tarmen via oral fodring assay.

Effekten af bakterier på vært fysiologi kunne evalueres ved at sammenligne de ubehandlede myg, antibiotika-behandlede myg, og myg genindført specifik tilbageholdenhed. Midgut dissektion og dyrkes bakterier isolation. Til at begynde med, indsamle myg i bur med en aspirator og celle myg i indsamling boksen.

Bedøve myg ved at underkaste en temperatur på 4 grader i tre til fem minutter. Hold myg bedøvet ved at placere dem i en iskold petriskål. Desinficere bænken, dissekere mikroskop, og snævring ved at sprøjte 75% ethanol for at undgå forurening med bakterier fra miljøet.

Overflade sterilisere myg ved tape og ryste dem i 75% ethanol i tre minutter og skyl to gange med PBS buffer. Bisect myg separat på en steril glas dias, der indeholder din dråbe PBS. Fjern forsigtigt benene, vingerne og hovedet af myg ved hjælp af sniver.

Clamp myg bryst og den sidste del af maven var stænde og trække fra hinanden for at isolere fordøjelseskanalen. Brug vices til at fjerne afgrøden og malpighian rør fra fordøjelseskanalen. Afgrøden er placeret ved pnterior af midgut og buler efter indtagelse af sukker vand.

Malpighian rør er gruppe af slanke ekskrekulerende rør på krydset af midgut og hindgut. Placer den dissekerede makeup i EP-rør med 200 mikroliters sterile PBS buffer og male det med den sterile slibning præst i den rene bænk. Korn til at indlæse homogene til tre tempo vrangforestillinger på 50 mikroliter af hver vrangforestilling til LB agar plade og desperate plade.

Inkuber pladen som 37 grader i en til to dage, indtil enkelte kolonier er mulige. Pluk enkelte kolonier i en 150 milliliter konisk kolbe, der indeholder 50 milliliter lb bh’er medium. ryste bakterierne ved 37 grader natten over.

Identifikation af arter. Uddrag TOTO DNA ved bakteriel genomisk DNA konstruktion kit og forstærke 16 SRDNA ved PCR. Genopretning og rensning af DNA-fragmenter fra PCR-produkter af Ambrose gelelektrophorsis og det kørte recovery kit.

Udført DNA sekventering på de rensede DNA fragmenter at have en opnået bakterier kæde sekvenser. Kør blast søgning til en forespørgsel de 16 SRNA gensekvens af identificere bakterier mod bakterier og archaea og database. Identifikationen af artsniveauet blev defineret som større end eller lig med 99%16 SRDNA-sekvensligheden til den nærmeste holdbankpost.

Isolatet blev tildelt det til den tilsvarende, slægt, når er 16 SRDNA sekvens, lighed var mindre end 99% og større end eller lig med 95% antibiotika behandling og bakterie genintroduktion. den nødvendige mængde saccharose penicillin og streptomycin til at forberede os 10% saccharose opløsning, herunder forsøger 20 enheder af penicillin og 20 mikrogram streptomycin per milliliter. Infiltrere vatkugler i saccharose opløsning, der indeholder antibiotika og placere den over toppen af papiret kop, der indeholder myg.

Dæk vat med en 10 centimeter petriskål for at forhindre en havnefront i at fordampe. Udskift vatkugler to gange om dagen og fodre myg i træk på tre dage. Myg er opdelt i to grupper.

Den første gruppe blev placeret i en myg kop uden nogen behandling, enhver vatkugler læge med 10%Så cross blev givet dagligt. Den anden gruppe blev behandlet med antibiotika og tjene i tre dage. I hver gruppe blev Sergei myg dissekeret.

Mika blev udvundet for total DNA-ekstraktion og QPCR blev udført ved hjælp af universelle bakterier primere, figur en viser udtrykket af 16 SRNA i kontrolgruppen og antibiotika behandling gruppe. Resultaterne viser, at omkostningerne eller realiseringen af penicillin og streptomycin var en succes. forberede bakteriel løsning, måler en bakterieopløsning i virus med et spektrofotometer, tilsæt en OT bakterier suspension i EP rør.

Centrifuge suspensionen ved 5, 000 RCA i fem minutter ved fire graders Kassér supernatanten, vask bakteriepallen forsøger med steril PBS buffer. Re-suspendere bakteriel palle med 200 microliters sterile PBS buffer Tilføj 600 mikroliter, 10% saccharose opløsning, 200 mikroliter ATP og 200 microliter bakteriel suspension i en ny AP rør og bland godt. Alternativt kan bakterierne igen suspenderes i varme i aktivere dit blod.

Forberedelse af opvarmning aktiveret blod. blodprop med antikoagulerende rør, skal der gå to til tre milliliter frisk blod. centrifuge ved 1000 i 10 minutter ved fire grader for at adskille plasma og blodlegemer.

Opsaml plasmaet i et nyt EP-rør, og aktiver heri aktiveret ved en 56 grader i en time. Vask Blast hus gennem dine tider med sterile PBS buffer. Skyl suspenderet blast hus med varme aktiveret plasma.

Saml membran- og fodringssystem. Træk filmsyge til det maksimale. fastgør med plastringen og arbejdsparafilmen for at undgå, at den lækkende langsomt tilsættes den forberedte bakterieopløsning til fødeenheden, til den maksimale tegnebog.

For at undgå, at boblen faldt fra én retning, forsegles fødeenheden. Tilslut strømforsyningen. Vent, indtil temperaturen når 37 grader Installeret foderenheden med bakterieopløsning på fødeautomaten.

Før fodring bakterier myg bør stoppes i 24 timer at metabolisere antibiotika. For foderenheden på papirkoppen med myg, så lad fodring i 90 minutter. Fuldt opmuntret myg kunne plukkes ud til yderligere undersøgelser.

repræsentative resultater. Figur to viser os den gennemsnitlige anerkendelse pr myg. Efter plot fodring af antibiotika behandlet myg ser vi meningosepticum.

Figur tre viser udtrykket af en variant udvikling relaterede gener 24 timer efter blodmåltid, der indeholder C meningosepticum. Resultaterne viser, at der ikke er nogen væsentlig ændring i kontrolgruppens og den falmende gruppes ægproduktion. Tak for din interesse i bakterier eller en fodring essay med antibiotika behandlet myg.