En bakteriell oral utfodring assay med antibiotikabehandlade myggor

Mosquito midgut hamnar en komplex gemenskap av mikrober som påverkar värdmetabolism, reproduktion, fitness, och veterinär kompetens. Med varje gut mikrob är en annan effekt. Denna video introducerar förfarandet för att studera respektive roll för varje bakterie stam eller värd fysiologi.

För att förvärva en kultur av tarmbakteriella kolonier dissekerar mygga midgut under sterilt tillstånd. Jorda dissekt midgut, serotologinate, och sprids över agar plattan. Plocka enstaka kolonier från plattan, och identifiera bakteriearter via deras 16 SRNA-gensekvens.

Mata myggorna med COD Emboss som innehåller antibiotika i på varandra följande av tre dagar för att ta bort tarmfloran. Effektiviteten av antibiotikabehandling kan bekräftas genom att dissekera midgut av aseptiska mygga för kolonibildande enhet assay före efterföljande extremister. Sedan återinföra specifika bakterier arter som tidigare isolerats från mygga gut via oral utfodring assay.

Bakteriernas inverkan på värdfysiologin skulle kunna utvärderas genom att jämföra de obehandlade myggorna, de antibiotikabehandlade myggorna och myggorna återinförde specifik återhållsamhet. Midgut dissekering och de odlingsbara bakterier isolering. Till att börja med samlar myggorna i bur med en aspirator och cell myggorna i uppsamlingslådan.

Bedöva myggorna genom att utsätta för en temperatur på 4 grader i tre till fem minuter. Håll myggorna sövda genom att placera dem i en iskall Petriskål. Desinficera bänken, dissekera mikroskop, och tlyktor genom att spruta 75%etanol för att undvika kontaminering av bakterier från miljön.

Ytbehandla myggan sterilisera genom tejpning och skakning dem i 75%etanol i tre minuter och skölj två gånger med PBS buffert. Bisekt myggan separat på en steril glasrutschbana som innehåller din droppe PBS. Ta försiktigt bort benen, vingarna och huvudet på myggan med hjälp av tsnare.

Kläm myggans bröst och den sista delen av buken var tämpningar och dra isär för att isolera matsmältningskanalen. Använd forceps för att ta bort grödan och det malpighian röret från matsmältningskanalen. Grödan är placerad vid pnterior av midgut och utbuktningar efter intagande av socker vatten.

Malpighian rör är grupp av slanka utsöndringsrör på korsningen av midgut och hindgut. Placera den dissekerade makeupen i EP-röret med 200 mikroliters steril PBS-buffert och slipa den med den sterila slippastoren i den rena bänken. Spannmål för att ladda homogenatet till tre tempo vanföreställningar vid 50 mikroliter av varje villfarelse till LB agar plattan och desperat platta.

Inkubera plattan som 37 grader i en till två dagar tills enstaka kolonier är genomförbara. Plocka enstaka kolonier i en 150 milliliter konisk kolv som innehåller 50 milliliter lb behåar medium. skaka bakterierna i 37 grader över natten.

Artidentifikation. Extrahera TOTO DNA genom bakteriell genomisk DNA konstruktion kit och förstärka 16 SRDNA av PCR. Återvinning och rening av DNA-fragment från PCR-produkter av Ambrose gelelektrofores och den drösåtervinningssatsen.

Utförde DNA-sekvensering på de renade DNA-fragmenten för att ha en uppnådd bakterie kedjar ordnar. Kör blast sökning till en fråga 16 SRNA gensekvens identifiera bakterier mot bakterier och arkéer och databas. Identifiering till artnivån definierades som större än eller lika med 99%16 SRDNA-sekvenslikhet med närmaste lagbankpost.

Isolatet tilldelades den till motsvarande, släkte när är 16 SRDNA sekvens, likhet var mindre än 99%och större än eller lika med 95%antibiotika behandling och bakterien återintroduktion. väga den erforderliga mängden sackaros penicillin och streptomycin för att förbereda oss 10%sackaroslösning, inklusive att försöka 20 enheter penicillin och 20 mikrogram streptomycin per milliliter. Infiltrera bomullstussarna i sackaroslösningen som innehåller antibiotika och placera den över toppen av pappersmuggen som innehåller mygga.

Täck bomullstussen med en 10 centimeter Petriskål för att förhindra att en vattnet avdunstar. Byt ut bomullstussarna två gånger dagen och mata myggan i på varandra följande tre dagar. Myggor är indelade i två grupper.

Den första gruppen placerades i en myggkopp utan någon behandling, någon bomullstuss läkare med 10%Så kors gavs dagligen. Den andra gruppen behandlades med antibiotika och servera i tre dagar. I varje grupp dissekerades Sergei myggor.

Mikan extraherades för total DNA-extraktion och QPCR utfördes med hjälp av universella bakterieprimrar, figur ett visar uttrycket av 16 SRNA i kontrollgruppen och antibiotikabehandlingsgruppen. Resultaten visar att kostnaden eller förverkligandet av penicillin och streptomycin var framgångsrik. förbereda bakteriell lösning, mäter en bakterie lösning i viruset med en spektrofotometer, tillsätt en OT bakterier suspension i EP-röret.

Centrifugera suspensionen vid 5, 000 RCA i fem minuter i fyra grader Kassera supernatanten, tvätta bakteriepallen försöker med steril PBS-buffert. Åter upphäva bakteriell pall med 200 mikroliters steril PBS buffert Lägg 600 microliter, 10%sackaroslösning, 200 microliter ATP och 200 microliter bakteriell suspension i en ny AP-röret och blanda väl. Alternativt kan bakterierna åter suspenderas i värme i aktivera ditt blod.

Förberedelse av uppvärmning aktiverat blod. koagulera färskt blod med antikoagulantia röret, ta två till tre milliliter färskt blod. centrifug vid 1000 i 10 minuter i fyra grad för att separera plasma och blodkroppar.

Samla in plasman i ett nytt EP-rör och häri aktiveras aktiveras i 56 grader i en timme. Tvätta Blast hus genom dina tider med steril PBS buffert. Skölj suspenderat spränghus med uppvärmning aktiverad plasma.

Montera membran och utfodring system. Dra filmsjukan maximalt. fixera med plastringen och arbetsplatsens parafilm för att undvika att läcka långsamt tillsätter den beredda bakterielösningen till matarenheten, till maximal plånbok.

För att undvika att bubblan föll från en riktning och försegla matarenheten. Anslut strömförsörjningen. Vänta tills temperaturen når 37 grader Monterat matarenheten med bakterielösning på mataren.

Innan utfodring bakterier myggor bör stoppas i 24 timmar för att metabolisera antibiotika. För matarenheten på papperskoppen med myggor, låt sedan utfodring i 90 minuter. Fullt uppmuntras myggor skulle kunna plockas ut för vidare studier.

Representativa resultat. Figur två visar oss den genomsnittliga utmärkelsen per mygga. Efter tomt utfodring av antibiotika behandlas myggorna vi ser meningosepticum.

Figur tre visar uttrycket av en variant utveckling relaterade gener 24 timmar efter blod måltid som innehåller C meningosepticum. Resultaten visar att det inte sker någon betydande förändring i kontrollgruppens och fadinggruppens äggproduktion. Tack för ditt intresse för bakterier eller en utfodring uppsats med antibiotika behandlade myggor.