Summary
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Hier wordt een eenvoudig protocol gepresenteerd voor de gerichte differentiatie van hemogene endotheelcellen van menselijke pluripotente stamcellen in ongeveer 1 week.
Transcript
Dit protocol beschrijft een methode om een goed gekarakteriseerde populatie van menselijke hemogene endotheelcellen te genereren. Deze cellen kunnen worden gebruikt om de moleculaire regulatie en endotheel-naar-hematopoietische overgang te bestuderen. Begin met het kweken van menselijke embryonale stamcellen gedurende vier dagen om ze te differentiëren in primordiale endotheelcellen.
Op dag vijf aspirateer je het medium boven de cellen. Was de cellen vervolgens voorzichtig met één milliliter DMEM/F-12 per putje. Voeg één milliliter vers bereid hemogeen endotheelceldifferentiatiemedium per put toe en incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.
Vervang op dag zes en dag zeven het medium boven de cellen door één milliliter vers bereid homogeen homogeen endotheelceldifferentiatiemedium per put en incubeer de cellen nog eens 24 uur. Op dag acht. na het losmaken en wassen van de cellen, verdeel ze gelijkmatig in microcentrifugebuizen op ijs, elk met minimaal 600 microliter cellen met een dichtheid van 1 keer 10 tot de 5e cellen per milliliter.
Voeg antilichamen toe aan de buizen die cellen bevatten en incubeer op ijs beschermd tegen licht gedurende 30 minuten. Pelleteer de cellen door centrifugeren op 1000 keer G en 4 graden Celsius gedurende vijf minuten. Verwijder het supernatant en resuspenseer de pellets in 600 microliter ijskoude sorteerbuffer.
Zeef de monsters door de mesh filterdop van vijf milliliter FACS-buizen en sla de cellen op ijs beschermd tegen licht voor onmiddellijke celsortering. Om hemogene endotheelcellen te isoleren door FACS, moet eerst de CD45-negatieve celpopulatie worden afgesloten. Dan binnen de CD45-negatieve populatie, gate de CD31-positieve cellen.
Volgende binnen de CD31-positieve populatie, poort voor de VE-cadherine-negatieve celpopulatie. En dan binnen de VE-cadherine-negatieve populatie, poort voor de c-Kit-positieve cellen. Van de c-Kit-positieve populatie, poort de CD34-positieve celpopulatie.
En ten slotte van de CD34-positieve celpopulatie, identificeer en verzamel de KDR-positieve cellen. Na het zaaien van hemogene endotheelcellen in een op methylcellulose gebaseerd medium geformuleerd voor groei van hematopoëtische voorlopercellen, worden kolonievormende unit-erytroïde kolonies en blastvormende eenheid-erytroïde kolonies geteld op dag acht. Kolonievormende eenheid-granulocyt-macrofaag en kolonievormende eenheid-granulocyt, erytroïde, macrofaag en megacaryocyt.
Multipotente hematopoëtische voorloperkolonies worden geteld op dag 14. Per 1000 hemogene endotheelcellen die worden geplateerd, worden ongeveer 20 kolonievormende eenheden gegenereerd. Cellen met endotheelcelmorfologie zijn ook zichtbaar in de culturen.
Dit zijn de hemogene endotheelcellen die aanleiding geven tot multilineaire hematopoëtische voorlopercellen op eencellig niveau. Dit protocol is een 2D-serum en murine feeder-vrij kweeksysteem dat menselijke hemogene endotheelcellen in ongeveer een week kan genereren.
Tags
Ontwikkelingsbiologie
Nummer 169
pluripotente menselijke stamcellen
menselijke endotheelcellen
hemogene endotheelcellen
arteriële endotheelcellen
celkweekprotocol
gerichte differentiatie
