مناهج رسم الخرائط الكيميائية لدراسة عدوى المثقبيات

يمكن استخدام هذا البروتوكول لبناء نماذج 3D من الأيض وتوزيع الطفيليات. هذا يمكن أن يساعد في فهم العلاقة بين اضطراب التمثيل الغذائي للأنسجة المحلية ، وتوزيع الطفيليات ، وأعراض الأمراض السريرية. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها تمكن من رسم خرائط حية عبر الأعضاء لتوزيع الأيض مقابل توزيع مسببات الأمراض وتحليلها الإحصائي.

من الناحية النظرية ، يمكن لرسم الخرائط الكيميائية استكشاف تطور المرض وتأثيره على المضيف من خلال الفحص المباشر للمستقلبات المسؤولة عن التسبب في المرض وآثار العلاج. ابدأ بوزن الأنابيب ووضع العلامات عليها. قسم الأنسجة بشكل منهجي مع قسم واحد لكل أنبوب.

وزن الأنابيب التي تحتوي على عينات الأنسجة لتحديد وزن العينة وتسجيل الوزن. لإجراء التجانس القائم على الماء لعينات الأنسجة ، أضف حبة فولاذ مقاوم للصدأ واحدة من عيار خمسة ملليمترات إلى أنبوبي الطرد المركزي الدقيق بالملليلتر اللذين يحتويان على عينات من الأنسجة. اصنع أنبوبا فارغا واحدا يحتوي على ماء LCMS الصف.

قم بتكوين الحجم إلى 500 ميكرولتر لكل 50 ملليغرام من العينة عن طريق إضافة ماء LCMS مبرد ، ثم تجانس العينات عند 25 هرتز لمدة ثلاث دقائق. يجب أن تكون العينات متجانسة تماما. جمع 1/10 من حجم التجانس لاستخراج الحمض النووي والتحليلات الأخرى.

أضف الميثانول البارد LCMS مع أربعة ميكرومولار من السلفاكلوروبيريدازين إلى المتجانس. تجانس العينات في مجانس الأنسجة عند 25 هرتز لمدة ثلاث دقائق، تليها الطرد المركزي لمدة 10 دقائق. اجمع كمية متساوية من المواد الفائقة في صفيحة بئر 96 واحتفظ ببقايا صلبة على الجليد أثناء جمع المواد الفائقة.

جفف السوبرنات استخراج المائية تماما باستخدام السرعة القصوى وبدون تسخين. قم بإجراء استخراج عضوي عن طريق إضافة 1000 ميكرولتر من ميثانول ثنائي كلورو الميثان المبرد مسبقا مع اثنين من السلفاكلورو ثنائي المولات الدقيقة لكل 50 ملليغرام من عينة البقايا الصلبة. تجانس العينات عند 25 هرتز لمدة خمس دقائق، تليها الطرد المركزي لمدة 10 دقائق.

جمع حجم متساو من supernatant في لوحة بئر 96. التقط صورة للجهاز محل الاهتمام. انقر فوق ملف، ثم استيراد في برنامج SketchUp لاستيراد صورة للأجهزة ذات الاهتمام.

انقر على أداة الخطوط وحدد الخيار المجاني. استخدم أداة القلم الرصاص لتتبع ورسم الخطوط العريضة للأجهزة ذات الاهتمام. حدد أداة الدفع / السحب واسحب المنطقة المظللة لتحويل الرسم من 2D إلى 3D.

تصدير الملف بتنسيق dae بالنقر فوق تصدير الملف ثم نموذج 3D. لتحسين واقعية النموذج، قم باستيراد النموذج إلى برنامج MeshLab عن طريق تحديد ملف، ثم النقر فوق استيراد شبكة. حدد Wireframe في القائمة العلوية ، ثم حدد الفلاتر ، وانقر فوق إعادة دمج التبسيط وإعادة الإنشاء ، ثم على نقطة منتصف التقسيم الفرعي للأسطح.

اترك جميع القيم افتراضية وحدد تطبيق مرتين. قم بتصدير النموذج بتنسيق sdl بالنقر فوق ملف ، ثم على تصدير شبكة باسم ، ثم تحديد تنسيق ملف SDL في القائمة المنسدلة نوع الملفات. احفظ هذا وحدد موافق في القائمة المنبثقة التالية.

افتح برنامج Meshmixer واستورد ملف sdl الذي تم إنشاؤه في الخطوة السابقة. استخدم أدوات النحت والفرش ونحت التنين والفرش وأدوات التضخيم لسحب أسطح النماذج التي تحتاج إلى تقريبها. احفظه بتنسيق sdl بمجرد أن يكون للنموذج المظهر المطلوب بالنقر فوق ملف وتصدير.

قم بتسمية الملف حسب الرغبة ، وحدد تنسيق SDL الثنائي واحفظه. افتح نموذج 3D في برنامج MeshLab. انقر فوق موافق في النافذة المنبثقة للمعالجة المفتوحة للمنشور.

احصل على إحداثيات X و Y و Z لكل بقعة أخذ عينات عن طريق تحديد أداة نقاط الانتقاء ثم انقر بزر الماوس الأيمن على فترات متباعدة بانتظام عبر سطح نموذج 3D. بمجرد تحديد جميع الإحداثيات المطلوبة ، انقر فوق الزر “حفظ” العلوي في النافذة المنبثقة للنموذج. في برنامج جداول البيانات ، افتح ملف pp الذي تم إنشاؤه في الخطوة السابقة.

اضبط عرض البيانات بالنقر فوق نص البيانات إلى أعمدة، ثم تحديده. انقر فوق التالي ثم حدد مسافة وانقر فوق إنهاء. أعد التنسيق بحيث تبقى القيم الرقمية فقط في خلايا جدول البيانات عن طريق تحديد الصفحة الرئيسية بحث وتحديد استبدال.

في المربع البحث عن أي ، أدخل معطف متساو Y واترك مربع الاستبدال فارغا. انقر فوق استبدال الكل ثم فوق موافق. كرر ذلك ل X معطف متساو و Z معطف متساو وللطبقة المائلة أكبر من. في جدول برامج جداول البيانات، تتوافق الصفوف مع كل موضع والأعمدة مع البيانات.

الصق البيانات الوصفية المناسبة ووفرة ميزة الأيض في أعمدة جدول البيانات اللاحقة. في عمود نصف القطر، أدخل الحجم المطلوب لبقع أخذ العينات المراد تصورها على النموذج. حدد قيم نصف القطر تجريبيا واحفظ الملف بتنسيق CSV.

انتقل إلى برنامج ELI Plot، وحدد Surface، ثم اسحب نموذج 3D الذي تم إنشاؤه وأفلته في نافذة المتصفح. اسحب جدول الميزات الذي تم إنشاؤه وأفلته في نافذة المتصفح نفسها. استخدم وسيلة الإيضاح في الزاوية السفلية اليسرى لعرض عمود البيانات المطلوب على نموذج 3D.

حدد على التوالي كل عمود بيانات لتقييم توزيع ميزة المستقلب هذه على نموذج 3D. أدى هذا التحليل إلى جدول من 5،502 الميزات وتصورها في 3D. يتيح هذا النهج تصور ميزات الأيض في الحيوانات الفردية التي تكون عالية في موقع الحمل الطفيلي العالي ، والمستقلبات ذات التوزيع التفاضلي عبر مناطق الأنسجة وميزات الأيض التي توجد بمستويات مماثلة عبر الأمعاء الدقيقة والغليظة.

من المهم أن تتذكر استخدام مذيبات LCMS فقط وجمع جميع الأنسجة المجاورة واستخراج المستقلبات لجميع العينات التي تم جمعها لتجنب الفجوات في الخرائط المكانية. يمكن استخدام هذه التقنية لاستكشاف متطلبات المغذيات لاستعمار الأنسجة بواسطة طفيليات Trypanosomatid لفهم التسبب في المرض من خلال مقارنة خرائط توزيع الأيض 3D عند الإصابة.