Snabb isolering av vilda nematoder av Baermann Tratt

Caenorhabditis nematoder är riktiga djur, som lever i naturen. Genom att samla vilda nematoder kan vi studera gener och genom i deras naturliga sammanhang som avslöjar funktioner, som kan skymmas av labbets artificiella förhållanden. Denna teknik extraherar maskar, från bakterierika organiska substrat i fältet, och skapar rena kulturer på Petri-rätter, fångar en ögonblicksbild av varje population, vid den tidpunkt då den samlades in.

Dessa populationer är väl lämpade för ekologi, populationsgenetik eller metagenetikfrågor. Vilda stamkulturer är också värdefulla för kvantitativa genetiska studier. Denna teknik är enkel och lätt att utföra, även för en fältforskning nybörjare.

Men en framgångsrik insamlingsresa kräver tankeväckande förberedelse av material innan du reser. Identifiera ett bakterierikt substrat i fältet, såsom ruttande frukt, blommor, svampar, stjälkar av örtartade växter, jord eller lövskräp. Placera en liten volym av substratet i en märkt plastpåse.

Om ruttande material är sällsynt på fältsidan av intresse, placera lite frukt som bete. Lämna den att rocka, sedan hämta den, och alla maskar som har koloniserat den. Registrera prov-ID, latitud, longitud, datum och beskrivning av substratet.

Registrera alla andra lokala miljömätningar som är relevanta för försöket, såsom omgivnings- och substrattemperatur, substratförhållanden, insamlingstid och förekomst av substratassocierade makroverteber. Använd sax för att skära ett tre centimeter segment, av gummirör från varje tratt. Montera slangen över änden av en plasttratt.

Skjut en slangklämma över gummislangen och kläm fast den. För att göra en tratthållare, skär cirkulära hål, i mitten av en utfälld kartongflug avskyvärd bricka. Vänd kartongen, vik sidorna upp en gång och tejpa ihop dem.

Detta kommer att skapa ben, som höjer hålen ovanför bänken. Se till att slangklämmorna är i stängt läge och placera trattar i hålen. Häll sterilt vatten i varje tratt och fyll det ca tre centimeter under kanten.

Tryck på tratten för att frigöra eventuella fångade luftbubblor i slangen. Vik en luddfri torka i hälften, för att göra en kvadrat och placera den över tratten. Tryck sedan ner våtservetten för att sänka den i vattnet.

Bryt manuellt upp alla stora fasta bitar, av det naturliga substratet. Placera försiktigt en del av provet på våtservetten i tratten. Se till att inte punktera våtservetten eller lämna något prov som sticker ut ovanför fälgen.

Vik försiktigt hörnen av våtservetten, över provet, för att förhindra att vatten transporteras ut, över kanten av tratten. Märk tratten med prov-ID:t, motsvarande fältsamlingsanteckningar. Plocka ut alla aktiva insekter, eller andra djur, som kan resa och korsförorena prover.

Tillsätt mer vatten till varje tratt för att sänka hela provet. Medan du inkuberar vid rumstemperatur över natten kommer aktiva nematoder att vicka genom vävnaden och sjunka till botten av tratten. Skriv prov-ID för en tratt, på botten av en sex centimeter NGM maskplatta, sittande med en plats av OP50 E.coli-bakterier.

Ta bort locket från plattan, ta bort tratten, som innehåller provet från trattstället och håll det upprätt, ovanför den öppna maskplattan, med en hand. Släpp trycket på slangklämman med den andra handen och låt en eller två droppar vatten falla från slangen, på maskplattan bredvid bakteriegräsmattan. Så snart vattnet faller från tratten, kläm snabbt fast det igen för att förhindra översvämning av NGM-plattan.

För att städa upp, kasta ut innehållet i trattarna och tvätta dem med varmt vatten för efterföljande återanvändning. Observera de isolerade nematoderna under stereomikroskopet. Förutom nematoder kommer det ibland att finnas små, Oligo kit annelider, Tardigrades, rotifers och små kräftdjur.

För att fastställa ISO hermafrodit, eller ISO kvinnliga linjer, överför varje L4 hermafrodit eller parad vuxen kvinna, till en separat 3,5 centimeter NGM-platta, sittande med OP50. Sterilisera maskplockningen, före och efter varje överföring. Slutligen linda plattor noggrant för resor, med en paraffinfilm.

På Barro Colorado island Panama, 2018, bearbetades 131 substrat med denna metod. 99% av dem gav nematoder. 34% gav Caenorhabditis nematoder.

I Tjernobyl-uteslutningszonen Ukraina bearbetades 170 substrat under 2019 med denna metod. 56% av dem gav nematoder, varav ingen var Caenorhabditis. Denna metod fungerar eftersom nematoderna simmar genom våtservetten.

men substratet och andra djur håller sig på toppen. Många aspekter av ett protokoll kan ändras för att använda de resurser som finns tillgängliga på fältet. Prover som samlas in med denna metod gör det möjligt för forskare att ta itu med ett brett spektrum av populationsbiologiska frågor till etablerade kulturer för efterföljande laboratoriestudier.