A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Isolatie van rat vetweefsel Mesenchymale stamcellen voor differentiatie in insulineproducerende cellen
Chapters
Summary August 29th, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vetweefsel-afgeleide mesenchymale stamcellen (Ad-MSC's) kunnen een potentiële bron zijn van MSC's die differentiëren in insulineproducerende cellen (IPC's). In dit protocol bieden we gedetailleerde stappen voor de isolatie en karakterisering van epididymale Ad-MSC's bij ratten, gevolgd door een eenvoudig, kort protocol voor het genereren van IPC's van dezelfde rat Ad-MSC's.
Transcript
Het algemene doel van dit protocol is om rood vetweefsel, gedroogde mesenchymale stamcellen te isoleren en te karakteriseren en te differentiëren naar insulineproducerende cellen met behulp van eenvoudige methoden. Mesenchymale stamcellen hebben de wegen gevonden op het gebied van genetica. Ze kunnen worden geïsoleerd uit verschillende bronnen zoals beenmerg, vetweefsel en perinataal weefsel.
Ze accepteren uitstekende culturele kenmerken. Ze zijn multi-potent en kunnen mogelijk verschillende ziekten behandelen. Vetweefsel biedt een rijke bron van mesenchymale stamcellen.
Deze vetachtige MSC's kunnen gemakkelijk worden geïsoleerd uit lipo-aspiraten met een hoge opbrengst in vergelijking met andere bronnen zoals beenmerg. En ze kunnen een goede bron zijn voor zowel autologe als allogene transplantatie. In deze video presenteren we een eenvoudig protocol voor isolatie en karakterisering van vet mesenchymale stamcellen uit rattenepidemaal vet.
Deze procedure is een eenvoudige, zeer efficiënte methode voor isolatie. Na isolatie zullen we de differentiatie van deze vet mesenchymale stamcellen in insulineproducerende cellen doorstaan met behulp van een eenvoudig, relatief kort protocol. We zullen beginnen met isolatie van vet mesenchymale stamcellen door collageenachtige vertering van epididymal vet om een sterkere vasculaire fractie te verkrijgen.
Dan zullen mesenchymale stamcellen worden gekenmerkt door hun plastic hechting, evenals expressie van CD-markers en differentiatie in meerdere mesodermale afstammingslijnen. Anesthiseer het dier en euthanaseer vervolgens met behulp van cervicale dislocatie. Spray over het hele lichaam met 70% ethanol en begin met excisie van de huid en de spieren aan de onderkant van de buik.
Stel vervolgens de teelballen bloot met het epididymale vet. Snijd voorzichtig het epididymale vet. Pas op dat je de bloedvaten niet doorsnijdt met de vetten.
Snijd in een bioveiligheidskast het vetweefsel in kleine stukjes met behulp van een tang en scalpel. Breng het vetweefsel over in een centrifugebuis met 10 milliliter steriel PBS. Begin met wassen door de Falcon-buis gedurende 45 seconden te kantelen.
Houd de buis vervolgens vijf minuten staan om in twee lagen te scheiden. Verwijder de infranated PBS met een spuit van 10 milliliter. Herhaal deze wasstappen vier tot vijf keer totdat PBS duidelijk is.
Na het wassen, suspensieer vetweefsel opnieuw in collageenoplossing en incubeer vervolgens in schudwaterbad totdat het weefsel bijna homogeen is. Vortex daarna het weefselcollageenmengsel gedurende 15 seconden en centrifugeer daarna gedurende vijf minuten. Na centrifugatie heb je drie lagen.
Gooi het supernatant voorzichtig weg over de stromale vasculaire fractie. Gooi eerst de olielaag aan de bovenkant voorzichtig weg, gevolgd door de echolaag zonder de stromale vasculaire fractiekorrel te verstoren. Suspensie de stromale vasculaire fractie opnieuw in steriel BSA en centrifugeer gedurende vijf minuten opnieuw.
Hele centrifugatie, plaats complete DMEM F-12 media in een vierkante kolf van 25 centimeter. Gooi na centrifugatie het supernatant weg en suspensie de stromale vasculaire pellet opnieuw in volledige DMEM F-12-media. En overhevel naar de kweekfles.
Plaats in 37 graden 5% kooldioxide incubator. Verwijder de volgende dag niet-losse cellen en vervang de media door nieuwe media. Vanaf de volgende dag van isolatie zullen de fibroblastachtige cellen beginnen te verschijnen.
Geleidelijk aan naarmate de tijd verstrijkt, zullen ze in aantal en grootte toenemen. Door passaging worden cellen homogener. Deze cellen vertonen alle mesenchymale stamcelkarakteriseringscriteria.
Deze cellen werden gedifferentieerd naar insulineproducerende cellen met behulp van dit eenvoudige protocol dat nicotinamide bèta-mercaptoethanol en Exendin-4 bevat. Tijdens de differentiatiestappen beginnen de cellen hun fibroblastische vorm te verliezen en ik denk clusterachtige morfologie. Wanneer gebruikte insulineproducerende cellen positieve karmozijnrode disithone-kleuring vertonen, waarna gebruikte insulineproducerende cellen verschillende bètacelmarkers tot expressie brengen, zoals Pdx-1, mafA en insuline.
Bovendien scheiden geïnduceerde insulineproducerende cellen hogere niveaus van insuline in het supernatant af wanneer ze worden uitgedaagd met een hogere glucoseconcentratie. We hebben een gedetailleerd, stapsgewijs protocol verstrekt voor isolatie en karakterisering van vetmensachtige mesenchymale stamcellen. We bieden hier ook een relatief kort, eenvoudig en efficiënt protocol voor differentiatie van vet mesenchymale stamcellen in insulineproducerende cellen.
Dit biedt een toegangspoort voor onderzoekers om het veld van mesenchymale stamcellen te betreden en hun differentiatie in insulineproducerende cellen te bestuderen.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
