Login processing...

JoVE Journal
Cancer Research

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Cancer Research

Far-Red Fluorescerende Senescence-Associated β-Galactosidase Probe for identifisering og anrikning av Senescent tumorceller ved flowcytometri

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Journal (Cancer Research)

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

Journal (Cancer Research)

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

Click here for the English version

Far-Red Fluorescerende Senescence-Associated β-Galactosidase Probe for identifisering og anrikning av Senescent tumorceller ved flowcytometri

Article DOI: 10.3791/64176-v

September 13th, 2022 •

Amy Flor¹, Joanna Pagacz¹, DeShawn Thompson¹, Stephen Kron¹

¹Department of Molecular Genetics and Cell Biology, University of Chicago

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

September 13th, 2022

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

En protokoll for fluorescerende, flowcytometrisk kvantifisering av senescent kreftceller indusert av kjemoterapi narkotika i cellekultur eller i murine tumor modeller presenteres. Valgfrie prosedyrer inkluderer co-immunostaining, prøvefiksering for å lette stor batch- eller tidspunktanalyse, og anrikning av levedyktige senescentceller ved flowcytometrisk sortering.

Transcript

Vår multiparameter flowcytometriprotokoll muliggjør rask og forbedret påvisning av terapiindusert senescens i tumorceller, som er en tilstand av pågående studier innen kreftbiologi og terapi. Vår flowcytometri senescence assay er raskere enn eksisterende mikroskopibaserte analyser. Vi bruker to markører, i stedet for bare en, for å identifisere senescentceller, noe som forbedrer analysens pålitelighet.

Celler kan være co-farget med fluorescerende antistoffer for å oppdage flere mål av interesse. Flowcytometri sortering kan brukes til å berike populasjoner av senescent celler for nedstrøms analyse. Analysen kan oppdage senescentceller i dyrkede kreftcellelinjer, eller i hele tumorprøver etter mild dissosiasjon.

Før du prøver denne teknikken, er det viktig å være kjent med de generelle operasjonsprosedyrene for flowcytometeret som brukes. Se teksten for anbefalte spesifikasjoner for flowcytometer. En dag før senescence induksjon av narkotika, høst kreftcellelinjekulturen med 0,25% trypsin EDTA.

Plasser cellene ved 37 grader Celsius i fem minutter for å aktivere trypsin, og løsne cellemonolaget. Når monolaget har synlig løsnet, nøytraliser trypsin ved å legge til et like stort volum av komplett kulturmedium. Overfør cellesuspensjonen til et sterilt konisk rør.

Tell cellene ved hjelp av standard hemocytometer metode, og ta opp celler per milliliter. Plateceller på en gang 10 til tredje til 10 ganger 10 til de tredje cellene per kvadratcentimeter i en standard seks-brønns plastkulturplate. Inkuber platen over natten ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid og fuktighet.

Neste dag, behandle cellene med senescence-inducing agent av interesse, slik som etoposid. Deretter inkuberer i fire dager for å tillate utbruddet av senescence. Undersøk cellene daglig under et lysmikroskop for forventede morfologiendringer.

Etter utbruddet av senescens, høst cellene ved å legge til trypsin EDTA i fem minutter ved 37 grader Celsius. Når cellene er dissosiert i suspensjon, nøytraliser trypsin med et likt volum av komplett medium. Overfør hver brønn med cellesuspensjon til et 1, 7 milliliter mikrocentrifugerør.

Tell cellene igjen og aliquot et likt antall celler per prøve i et nytt sett med rør. Sentrifuger rørene i fem minutter ved 1.000 g ved fire grader Celsius og fjern supernatanten. Juster først den lysosomale pH i dyrkede celleprøver ved å tilsette en løsning av en mikromolar bafilomycin A i DMEM til cellepelleten i en konsentrasjon på en gang 10 til de sjette cellene per milliliter, og pipetten blandes.

Inkuber i 30 minutter ved 37 grader Celsius på en rotator med lav hastighet. Deretter for å flekke for senescensassosiert beta-galaktosidase, tilsett DDAOG-stamløsning ved 10 mikrogram per milliliter til prøvene uten vask. Plasser på en rotator i 60 minutter beskyttet mot direkte lys.

Som før, sentrifuger rørene, fjern supernatanten og vask pelleten med en milliliter iskald 0,5% BSA i PBS. Tilsett deretter 300 mikroliter fortynnet Calcein Violet 450 AM-løsning til de vasket cellepellets. Inkuber i 15 minutter på is i mørket.

Overfør celleprøvene til flowcytometriinstrumentkompatible rør. I datainnsamlingsprogramvaren åpner du et fiolett kanalhistogram og et langt rødt kanal versus grønt kanalpunktplott. Start cytometerdatainnsamling ved lav inntakshastighet og plasser de positive kontrollprøvene farget med DDAOG på inntaksporten.

Begynn å hente eksempeldata. Juster kanalspenningene slik at mer enn 90% av hendelsene finnes i hvert plott. Når alle innstillingene er optimale, registrerer du 10 000 hendelser per prøve.

Plasser kontrollprøvene som kun er farget med DDAOG på inntaksporten. Start datainnsamling og registrer 10 000 hendelser per prøve. Se etter en økning i autofluorescens, eller AF, og DDAO-galaktosidsignal versus positiv kontroll.

Lagre eksempeldataene i fcs-filformat, og eksporter filene til en arbeidsstasjonsdatamaskin utstyrt med programvare for flowcytometrianalyse. Ved hjelp av cytometri dataanalyse programvare, laste fcs datafiler for alle prøver ervervet. Først, for å gate levedyktige celler, dobbeltklikk på prøvedataene for kjøretøyets eneste kontroll for å åpne datavinduet.

Visualiser dataene som et histogram for fiolett kanal. De levedyktige cellene som er farget, farget av CV 450, er basert på deres lysere fluorescens enn de døde cellene. Tegn en port ved hjelp av Single Gate Histogram-verktøyet for å inkludere bare levedyktige celler.

Navngi porten Levedyktig. Dra deretter Viable gate til de andre celleprøvene fra eksempeloppsettvinduet for å bruke porten jevnt. Åpne Oppsett-vinduet.

I vinduet Layout visualiserer du alle eksemplene som fiolette kanalhistogrammer. Kontroller at levedyktig cellegating er passende på tvers av prøver. Hvis ikke, juster etter behov.

Deretter, for å gate senescentceller, dobbeltklikker du på de inngjerdede levedyktige celledataene for kjøretøyets eneste kontroll for å åpne datavinduet. Visualiser deretter dataene som et punktdiagram for den langt røde kanalen kontra grønn kanal. Tegn en port ved hjelp av rektangel gating-verktøyet for å inkludere mindre enn 5 % av DDAO-positive og AF-positive celler fra kvadranten øverst til høyre.

Navngi porten som Senescent. Dra deretter Senescent-porten til det levedyktige delsettet av alle prøver fra eksempeloppsettvinduet for å bruke porten jevnt. Inn i layoutvinduet drar og slipper du alle levedyktige cellestyrte delmengder.

Visualiser alle levedyktige prøver som langt røde versus grønne kanalpunktplott, og observer resultatene. Sørg for at senescentporten er synlig på alle tomter, og at porten for kjøretøykontrollene viser mindre enn 5% senescentceller. Analysen er nå fullført.

Data kan nå eksporteres etter ønske i grafisk format og tabellformat. Sammenlignet med ubehandlede celler viste senescent B16-F10 melanomceller indusert av etoposid forstørret morfologi og blå farging på grunn av spaltning av X-gal ved forhøyet senescensassosiert beta-galaktosidase. Farging av etoposidbehandlede celler med fluorescerende C12FDG, eller DDAOG viste sammenlignbare fargemønstre og intensitetsvariasjoner med X-gal.

Imidlertid ble cellulær autofluorescens overlappende med grønn C12FDG-utslipp vist å akkumulere i ufargede senescentceller. I motsetning til dette var autofluorescens vanligvis ubetydelig i det langt røde utslippsområdet for DDAOG. Oppsett for datainnsamling for strømningscytometer for spredningsplott, fem-topp kommersielle regnbuefluorescerende kalibreringsmikrosfærer og enkanals fluorescensdata fra fargede celler er vist her.

DDAOG flowcytometer senescence assay data for B16-F10 melanomceller viste at Therapy-Induced Senescence, eller TIS, indusert av etoposid forekom i 35% av levedyktige celler, og det senolytiske middelet ABT-263 eliminerte nesten TIS-celler. I A549 lungekreftceller reduserte bleomycinindusert TIS i 66% av levedyktige celler og ABT-263 prosentandelen til 15. ABT-263 alene var ikke giftig for ubehandlede prolifererende celler.

I en antistoff-kofargeanalyse viste et histogram av PE-kanaldata at 42% av etoposidbehandlede celler var positive for senescensmarkøren DPPP4-positive. Videre indikerte visualisering med todimensjonale prikkplott at 44% av etoposidbehandlede celler var dobbelt positive for DDAOG og DPP4 versus 4% av kjøretøyceller. Fiksering av DDAOG-fargede celler ble deretter evaluert.

Sammenlignet med ufikserte kontrollprøver viste faste prøver en litt høyere bakgrunn i ubehandlede celler med en høyere prosentandel av celler som scoret som senescent i BLM-behandlede celler. Denne effekten ble også observert i faste prøver lagret over natten, og i en uke ved fire grader Celsius. Flowcytometri sortering og validering av berikede senescent cellepopulasjoner ved morfologi og proliferasjonsmarkører er vist.

Sorterte senescentceller viste forstørret morfologi, som forventet, visualisert ved å fargelegge aktin med fluorescerende phalloidin. En reduksjon i signal for spredningsmarkør Ki67 ble også observert ved immunfluorescerende farging. Endelig ble kvantifisering av senescens i svulster behandlet med kjemoterapi medisiner vurdert.

X-gal-farging i vev var relativt svak, men blåfarging var tydelig i svulster behandlet med doksorubicin, eller pegylert liposomalt doksorubicin, spesielt i svulster som også skåret positivt for senescens ved DDAO-galaktosidstrømningsanalyse. Som forventet viste saltvannssvulster ubetydelig senescens. Her, som med enhver levende celleanalyse, bør protokolltrinnene utføres effektivt, men forsiktig.

Langvarige fargeprosedyrer, eller inkubasjoner utover de nevnte tider, bør unngås. Hvis senescentceller er flowcytometrisk sortert, kan de plasseres tilbake i kultur for immunoassays, eller lyset, og behandles for omics analyse, inkludert transkriptomikk eller proteomikk. Denne teknikken har gjort det mulig for laboratoriet vårt og andre å identifisere nye egenskaper av senescent tumorceller, inkludert kvantifisering av DNA-skade, proteinuttrykk og endringer i metabolisme.

X

Simple Hit Counter