Author Produced

הפקה של חילוץ העובר צ'יק לגידול Murine בתאי גזע עצביים קרסט

* These authors contributed equally
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

כדי לטפח גזע עצביים לפסגה תאים (NCSC) במבחנה, בינוני מיוחד (NCSCM) נדרשת. חלק חיוני של NCSCM הוא עובר אפרוח לחלץ (CEE). כאן אנו מתארים טכניקות מדויקות כדי לייצר כמות מוגדל של איכות CEE טהור גבוהה, כולל פרטים כמו בידוד, מסמוס, צנטריפוגה, תהליכי סינון.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Pajtler, K., Bohrer, A., Maurer, J., Schorle, H., Schramm, A., Eggert, A., Schulte, J. H. Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells. J. Vis. Exp. (45), e2380, doi:10.3791/2380 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

הרכס העצבי נובעת האאקטודרם נוירו במהלך embryogenesis ואת נמשכת רק באופן זמני. ניסויים מוקדמים כבר proofed ובתאים pluripotent להיות חלק אינטגרלי של הרכס העצבי 1. Phenotypically, בתאי גזע עצביים לפסגה (NCSC) מוגדרים בו זמנית על ידי הבעת p75 (נמוך המאוחד גורם גדילה עצבי קולטן, LNGFR) ו SOX10 במהלך הנדידה שלהם מן הרכס העצבי 2,3,4,5. אלה ובתאים יכולים להתמיין לתאי שריר חלק, chromaffin התאים, נוירונים ותאי גלייה, כמו גם מלנוציטים, סחוס ועצם 6,7,8,9. כדי לטפח NCSC במבחנה, גזע מיוחד הרכס העצבי בינוני תא (NCSCM) נדרש 10. החלק המורכב ביותר של NCSCM היא הכנת תמצית חומוס העובר (CEE) המייצג מקור חיוני של גורמי גדילה עבור NCSC כמו גם עבור סוגים אחרים של explants עצביים. מרכיבים אחרים NCSCM ליד CEE זמינים מסחרית. הפקת CCE באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי יש חשיבות גבוהה לדעת את הפרטים מאתגר כמו בידוד, מסמוס, צנטריפוגה, תהליכי סינון. בפרוטוקול זה אנו מתארים טכניקות מדויקות כדי לייצר כמות מוגדל של איכות CEE טהור גבוהה.

Protocol

המדינה המחברים כי ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם הקהילות האירופיות Council Directive (86/609/EEC), בעקבות הנחיות של NIH לגבי טיפול השימוש בבעלי חיים הפרוצדורות והתקנות שנקבעו על ידי בעלי חיים המוסדי טיפול השתמש הוועדה (IACUC) באוניברסיטת דואיסבורג-אסן (גרמניה).

חלק 1: הגדרת (לא מוצג על וידאו)

והכנת חומר ופתרונות (לפני נטילת הביצים מן האינקובטור)

  • הביצים צריכים להיות מודגרות בתוך חממה humidified 11 ימים ב 37 ° C (100 ° F).
  • תרסיס אתנול 70%, צלחות נקיות, מלקחיים נקי ומדויק, 4 ° C (40 ° F) קר סטרילי DMEM על קרח 60 מ"ל מזרקים סטריליים
  • 50 מ"ל צינורות סטרילי קורנינג צריך להיות חצי מלא 4 ° C קר DMEM לערבב את העוברים macerated ביחס של 1:1 (מסה macerated: DMEM). ברגע ביצים נלקחים מתוך לנתיחה בחממה של עוברי אפרוח צריך להיות נכתבו.
  • לעקר כלי לנתיחה ב החיטוי או ביום לנתיחה, לטבול את הכלים באתנול 70% במשך 20 דקות.

חלק 2: Dissection של עוברים צ'יק (הפגינו וידאו)

  1. להרטיב את הביצים מודגרות עם תרסיס אתנול 70% לפחות במשך 30 שניות ויבש אותם בקפידה נקי עם מגבות נייר רך ואילו לא רועדות הביצים מוגזם.
    הערה: אנו ממליצים שלא לנתח יותר מ -60 עוברי אפרוח בו זמנית.
  2. פתח את הביצים בקפידה על ידי נמרץ כנגד הקצה חדה ולהוציא את העובר בזהירות לא להרוס את שק חלמון או עובר אפרוח עצמו.
  3. חיפוש בתחילת חבל הטבור במהירות לפתוח את העטיפה ברור מבלי להרוס את שק חלמון או כל כלי קטן. ואז לנתח את חבל הטבור עם מלקחיים נקי ומדויק.
  4. קחו את העובר מתוך שק החלמון.
    הערה: עוברים צריך להיות ערופה במהירות (לא רואים בסרט).
  5. אסוף את העוברים בתווך חיוני מינימלי ב 4 ° C.

חלק 3: מסמוס של עוברים צ'יק

  1. קח את הבוכנה מתוך מזרק סטרילי 60 מ"ל.
  2. העברת כ -10 עוברי לתוך מזרק 60 מ"ל one.
  3. מכניסים את הבוכנה חזרה לתוך המזרק בזהירות, כדי לא להסתכן באובדן החומר macerated.
  4. מרוכך על ידי לחיצה על הבוכנה כלפי מטה.
  5. איסוף המוני של צינורות macerated מוכן קורנינג חצי מלא DMEM ביחס של 1:1 (מסה macerated: DMEM). באמצעות 10 עוברי נפח של כ 25 מ"ל מיוצר.
  6. מניחים את התערובת על שייקר 45 דקות ב 4 ° C.

חלק 4: צנטריפוגה של העובר צ'יק - השעיה DMEM

  1. העברת העובר חומוס - השעיה DMEM לתוך צינורות צנטריפוגה.
  2. הוסף hyaluronidase סטרילית בריכוז של 1 מ"ג ל 25 מ"ג של העובר.
  3. טרה צנטריפוגה צינורות מאוד דווקא.
    הערה: שלב זה צריך להתבצע בזהירות כמו צנטריפוגה היא לרוץ לעבר הכוח גרם נזק גבוהה מאוד של חומר או צנטריפוגה יכול להתרחש אם באמצעות צינורות מאוזן. עם דיוק גבוהה במשקל בהתאם מכונת לגבי שלוש עמדות לאחר הנקודה העשרונית עבור צינורות כל צריך להתקבל על ידי התאמת הסכום החסר עם DMEM.
  4. מנמיכים את הטמפרטורה של צנטריפוגות עד 4 ° C.
    הערה: גם הרוטור צנטריפוגה יש לאחסן בתא הקירור או במקרר למשך הלילה.
  5. צנטריפוגה 6 שעות לפחות 180.000 xgx ח הערה: לקבלת תוצאות משופרות לגבי ההפרדה בין שלבי יחיד להשתמש 266.000 xgx ח במידת האפשר, להשתמש התאמת ואקום.

חלק 5: סינון של חלץ את העובר צ'יק

לאחר צנטריפוגה, שלושה שלבים יכול להיות לב: השלב העליון נוזל מלוכלך עם שברי שומן, השלב נוזל שקוף באמצע ואת גלולה בתחתית הצינור צנטריפוגה. הערה: טלטול או העברה מהירה של התערובת centrifuged יש להימנע לחלוטין, כמו זה יהרוס את התוצאה של השלב על ידי צנטריפוגה לאבד את השלב ברור נוזלי המרכזית.

הערה: כל השלבים הבאים חייב להתבצע בתנאים סטריליים באמצעות זרימת אוויר למינרית ספסל:

  1. פיפטה השלב נוזל שקוף לתוך מערכת סינון עם נקבוביות של 0.45 מיקרומטר. ואז לעבור על משאבת ואקום מחוברת.
    הערה: אל תיגע גלולה בתחתית. זה יוביל לזיהום של תמצית לבין חסימה של מערכת הסינון.
  2. העברת לחלץ מראש לתוך מערכת סינון עם נקבוביות של 0.22 מיקרומטר ולעבור על משאבת ואקום מחוברת שוב.
  3. Aliquot העובר הגיע לחלץ חומוסב סטרילי 15 צינורות מ"ל קורנינג.
  4. מהר לחנות aliquots ב -80 ° C (-62 ° F). הערה: CEE להימשך עד שנתיים אם המאוחסן ב -80 ° C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מבוסס על שינויים של נהלים אשר תוארו 10,11 האחרונות. בנוסף לפרסומים לשעבר אנחנו כאן להראות את השלבים השונים של תהליך אישי מורחב יותר. זו תומכת הנסיין עם פרטים חשובים להבטחת ההליכים הנכונים תוצאות אמינות. יתר על כן, כאשר תהליך הניתוח הוא חלק חיוני להפקת CEE אנו מתארים את התהליך של נטילת עוברים מתוך שק החלמון בכל פרט. ישנן מספר נקודות חשובות לציין כמפורט להלן.

דיסקציה של עוברי אפרוח יש להתחיל מוקדם ככל האפשר לאחר דגירה הסתיים. עוברים להיות מת לפני לנתיחה לא אמור לשמש עבור כל השלבים של פרוטוקול זה כמו הפעלת האנזימטית פירוק חלבונים עלול להשפיע לרעה על התוצאה.

לפני שתתחיל כמה יד על האימונים יש לבצע כמו כל השלבים של תהליך הניתוח צריך להתבצע במהירות ובאופן מדויק. חשוב להצלחת ההליך כולו, כדי למנוע זיהום עם חלמון ביצה אשר לוותה סכום ראוי לציין לרעה של חלבונים להתערב. לאחר עוברים הוצאו שקי חלמון הם צריכים להיות ערופה במהירות (לא רואים בסרט).

טמפרטורה כמו גם מהירות של הרוטור חשובים מאוד, מדי. על מנת למנוע הפעלת האנזימטית ירידה של האיכות והכמות של הגורמים הדרושים NCSCM את הטמפרטורה של הצנטריפוגות ואת הרוטור יש לצמצם עד 4 ° C. לאחר השלב צנטריפוגה השלב ברור נוזלי המרכזי הוא לחלץ מראש חשוב המכיל את גורמי גדילה החיוניים NCSCM. כדי להשיג הפרדה ניכרת של שברים שונים העשרה של הגורמים הדרושים אנו ממליצים על מהירות לא נמוך מ 180.000 xgx ח

כמו ההבדל בין צפיפות בשלב נוזל שקוף ואת השלב נוזל מלוכלך בחלק העליון של הצינור צנטריפוגה אינה מונעת remixing של שני חלקי רועד כל יש להימנע. הרכיבים של השלב נוזל מזוהם לא ניתן filtrated דרך מערכת 0.45 מיקרומטר לסנן, כמו חלקים של שומן זה היה מהר מאוד להוביל לסתימה של מערכת הסינון. גם גלולה בתחתית של צנטריפוגות לא צריך להיות נגע בכלל, כמו חלקים ממנה יוביל לסתימה של מערכת הסינון.

בצעד הסופי את הפוטנציאל של CEE לגידול של NCSCs יש תוקף. אוכלוסייה זו חולפת multipotent בתאי גזע מאבד את הכדאיות שלו במהירות בתקשורת מבלי הוסיף CEE המיוצר הולם. לכן קו עכבר מהונדס (JoMa1), המבטא סמנים NCSC מוקדם באופן transgene פעילות תלוי ומשמש ללמוד ביולוגיה NCSC מעובד אחראי לכל המתקבלים החדשים של CEE 10. גידול מוצלח של NCSCs מהווה אימות המתאימה של CEE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgements

התמיכה והייעוץ של מרקוס Pajtler ורוברט Bohrer היו שלא יסולא בפז עבור להדמיה של פרוטוקול זה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
11 days incubated chicken eggs Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH
Alcoholic disinfection spray Schülke Mayr GmbH
DMEMGlutamax GIBCO, by Life Technologies
Syringe sterile (60 ml) BD Biosciences
Tubes sterile (50; 15 ml) Greiner Bio-One
Pipet tips sterile Starlab GmbH
Hyaluronidase typeIV-S Sigma-Aldrich
Milipore stericups sterile (0.45; 0.22 μl) Fisher Scientific
Pipettes sterile (25; 10; 5 ml) Greiner Bio-One
Centrifuge L5-50 Rotor type Ti-45

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. Cell lineage analysis reveals multipotency of some avian neural crest cells. Nature. 335, 161-164 (1988).
  2. Stemple, D. L., Anderson, D. J. Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest. Cell. 71, 973-985 (1992).
  3. Rao, M. S., Anderson, D. J. Immortalization and controlled in vitro differentiation of murine multipotent neural crest stem cells. J Neurobiol. 32, 722-746 (1997).
  4. Paratore, C., Goerich, D. E., Suter, U., Wegner, M., Sommer, L. Survival and glial fate acquisition of neural crest cells are regulated by an interplay between the transcription factor Sox10 and extrinsic combinatorial signaling. Cell. 128, 3949-3961 (2001).
  5. Kim, J., Lo, L., Dormand, E., Anderson, D. J. SOX10 maintains multipotency and inhibits neuronal differentiation of neural crest stem cells. Neuron. 38, 17-31 (2003).
  6. Anderson, D. J., Groves, A., Lo, L., Ma, Q., Rao, M., Shah, N. M., Sommer, L. Cell lineage determination and the control of neuronal identity in the neural crest. Review Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 62, 493-504 (1997).
  7. Dorsky, R. I., Moon, R. T., Raible, D. W. Environmental signals and cell fate specification in premigratory neural crest. Review Bioessays. 22, 708-716 (2000).
  8. Sieber-Blum, M. Factors controlling lineage specification in the neural crest. Int Rev Cytol. 197, 1-33 (2000).
  9. Dupin, E., Real, C., Ledouarin, N. The neural crest stem cells: control of neural crest cell fate and plasticity by endothelin-3. Int Rev Cytol. 73, 533-545 (2001).
  10. Maurer, J., Fuchs, S., Jäger, R., Kurz, B., Sommer, L., Schorle, H. Establishment and controlled differentiation of neural crest stem cell lines using conditional transgenesis. Differentiation. 75, 890-891 (2007).
  11. Wu, Y. Y., Mujtaba, T., Rao, M. S. Isolation of stem and precursor cells from fetal tissue. Methods Mol Biol. 198, 29-40 (2002).

Comments

2 Comments

  1. Has anyone systematically tested CEE from different ages of embryo, and dŒs this effect cell behaviour in any major way?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 1, 2011 - 8:07 PM
  2. Dear Dr. Newgreen,

    thank you for your comment!
    We have regularly obtained CEE from eggs being incubated for 11 days. Subsequent cultivation of NCSCs mostly confirmed a successful preparation of CEE. However, we have not systematically tested CEE from different ages of embryo.
    Kind regards
    Kristian

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 3, 2011 - 6:39 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics