الفحص وحة لنوروفيروس الفئران

Immunology and Infection
 

Summary

نحن هنا وصف طريقة لتحديد جزيئات معدية من نوروفيروس الفئران (MNV)، والذي هو الوحيد الذي يعيد نوروفيروس بكفاءة في الثقافة الخلية. الفحص وحة يستفيد من tropism MNV لالضامة الفئران ويمكن تكييفها للاستخدام مع العينات البيولوجية أو البيئية التي تحتوي على MNV.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Gonzalez-Hernandez, M. B., Bragazzi Cunha, J., Wobus, C. E. Plaque Assay for Murine Norovirus. J. Vis. Exp. (66), e4297, doi:10.3791/4297 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

نوروفيروس الفئران (MNV) هو العضو الوحيد من جنس نوروفيروس التي تنمو بكفاءة في مجال زراعة الأنسجة 1 و 2. تحلل الخلايا وتأثير الاعتلال الخلوي (CPE) لوحظ خلال MNV 1-العدوى من الخلايا الجذعية أو الفئران الضامة 1. ويمكن استخدام هذه الخاصية من MNV-1 لقياس عدد الجسيمات المعدية في عينة معينة عن طريق إجراء فحص لوحة 1. لوحة الفحص يعتمد على قدرة MNV-1 لليز الخلايا وتشكيل ثقوب في الخلايا متموجة أحادي الطبقة، والتي تسمى لويحات 3.

ويمكن استخدام تقنيات متعددة للكشف عن العدوى الفيروسية في مجال زراعة الأنسجة، والأنسجة حصاد والسريرية، والعينات البيئية، ولكن ليس كل قياس عدد جزيئات معدية. (على سبيل المثال QRT-PCR) طريقة واحدة لقياس الجزيئات الفيروسية المعدية هو إجراء فحص لوحة 3 التي سيتم وصفها في التفاصيل أدناه. الاختلاف على فحص لوحة MNV هو فلوريescent مقايسة التركيز، حيث يتم immunostained MNV مستضد في الخلية monolayers 4. يمكن هذا الفحص يكون أسرع، لأن التعبير مستضد الفيروسية تسبق تشكيل اللوحة. ومن المفيد أيضا للفيروسات قادر المعايرة لتشكل لويحات. ومع ذلك، فإن الفحص يتطلب التركيز الفلورسنت موارد إضافية تتجاوز تلك من مقايسة لوحة، مثل الأجسام المضادة والمجهر لحساب التركيز تشكيل وحدة. ويمكن أيضا أن MNV المعدية عن طريق تحديد كمية زراعة الأنسجة 50٪ الجرعة المعدية (TCID 50) 3. هذا الاختبار يقيس كمية الفيروس اللازمة لإنتاج CPE في 50٪ من تلقيح خلايا الأنسجة عن طريق المعايرة نقطة النهاية 5. ومع ذلك، الحد الأقصى للكشف هو أعلى بالمقارنة مع لوحة 4 مقايسة.

في هذه المقالة، ونحن تصف بروتوكول فحص اللوحة التي يمكن استخدامها بشكل فعال لتحديد عدد الجسيمات الموجودة في MNV المعدية العينات البيولوجية أو البيئية 1 و 4 و 6. هذا الأسلوب هو على درجة البكالوريوسالحوار الاقتصادى الاستراتيجى على اعداد من 10 أضعاف التخفيفات مسلسل المحتوية على عينات MNV، والتي تستخدم لتطعيم أحادي الطبقة من الخلايا الإباحية (RAW 264،7 خلايا البلاعم الفئران). يسمح الفيروس لإرفاق أحادي الطبقة الخلية لفترة معينة من الزمن ومن ثم يستنشق قبل تغطي الخلايا بمزيج من الاغاروز وسائل الإعلام والثقافة الخلية. وأجار تمكن من انتشار سلالة الفيروسية للخلايا المجاورة بينما تحد من انتشاره إلى الخلايا تقع بعيدة. وبناء على ذلك، فإن الخلايا المصابة هي lysed والثقوب النموذج في أحادي الطبقة المعروفة باسم لويحات. على انتشار فيروس كافية من لويحات تصبح مرئية تلطيخ التالية من الخلايا مع الأصباغ، مثل الأحمر محايدة، زرقة الميثيلين، أو البنفسجي الكريستال. في التخفيفات المنخفضة، كل لوحة تنبع من الجسيمات الفيروسية المعدية 1 وآله، والتي امتدت إلى الخلايا المجاورة. وهكذا، عد عدد من اللوحات يسمح احد لحساب البلاك تشكيل وحدات (PFU) الموجودة في العينة غير مخفف 3.

Protocol

1. زراعة من البلاعم خط خلية RAW 264،7

  1. الحفاظ على خلايا RAW 264،7 (ATCC، وأنواع # TIB-71) في وسائل الإعلام-10 DMEM، الذي يتألف من DMEM ارتفاع نسبة الجلوكوز بنسبة 10٪ (V / V) منخفضة الذيفان الداخلي مصل بقري جنيني (<10 EU / مل)، 10 ملم HEPES ، 100 U / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين، 1 ملم غير الأحماض الأمينية الأساسية، 2 مم L-الجلوتامين. يتم الاحتفاظ عادة الخلايا في 175 سم 2 القوارير زراعة الأنسجة التي تحتوي على 35 مل من وسائل الإعلام في قارورة وحضنت عند 37 ° C و 5٪ CO 2 في الأنسجة حاضنة الثقافة. ومع ذلك، يمكن استخدام أي قارورة الحجم مع حجم وسائل الإعلام غير مناسبة لحجم القارورة.
  2. لتقسيم الخلايا: نضح قبالة سائل الإعلام القديمة، إضافة 10 مل من وسائل الإعلام الطازجة-10 DMEM إلى الخلايا، ومن ثم تتخلص الخلايا من الجزء السفلي من القارورة باستخدام مكشطة الخلية. المقبل، إعادة تعليق الخلايا في حل متجانسة عن طريق وضع الخلايا في ماصة 10 مل والضغط بقوة الخلايا من خلال العلاقات العامة تلميح ماصةessed ضد الجزء السفلي من القارورة. كرر هذا الإجراء على الأقل 3 مرات حتى لم تعد الخلايا تتجمع معا. تحقق من المجهر الضوئي التي تم إنشاؤها تعليق خلية واحدة. ثم نقل 1 مل (أو التخفيف 1:10 ~ الخلايا 1x10 7) - 2 مل (1:5 أو التخفيف ~ الخلايا 2X10 7) من التعليق خلية إلى 175 قارورة جديدة 2 سم، وتقديم الحجم النهائي من وسائل الإعلام تصل إلى 35 مل.
  3. انقسام الخلايا عندما تكون متموجة ما يقرب من (8 خلايا 1x10 ~ total/175 سم 2 القوارير): كل ثلاثة أيام إذا بدءا من التخفيف 1:10، أو كل يومين إذا بدءا من تخفيف 01:05. استخدام المجهر الضوئي لفحص الخلايا قبل مورفولوجيا الخلايا تقسيم. يجب أن معظم الخلايا تبدو مستديرة وتنشيط لا. الخلايا المنشطة لها حبيبات و / أو الممتدة، مورفولوجيا طويل ضعيف مع الزوائد. لا تدع خلايا اكتسى وهذه الخلايا لا تشكل عادة لويحات. تتبع عدد والبدء في كثير من الأحيان مرور أكثر من الذوبان في قسامة من مرور أقل الخلايا. (نحن نستخدم مرور 30 ​​على أنه خارج قطع).

2. تصيب خلايا 264،7 RAW مع اللقاح MNV

  1. البذور RAW 264،7 الخلايا في 6 لوحات جيدا (3.5 سم القطر) في كثافة خلايا قابلة للحياة 1x10 6 / مل في وسائل الإعلام-10 DMEM، وإضافة 2 مل من هذا التعليق إلى كل بئر. من المهم أن توزيع الخلايا بالتساوي في الآبار إما عن طريق هزاز لوحات باليد لا يقل عن 10 مرات أو باستخدام جهاز هزاز ل10 دقيقة ~. لا عباب لوحات لأن هذا سوف يتسبب في الخلايا لمجموعة في وسط البئر. لوحات المكان إلى الأنسجة حاضنة الثقافة (عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2). تسمح الخلايا ليلة وضحاها أو إرفاق ما لا يقل عن 4 ساعات في C. ° 37 يجب أن تكون الخلايا 60 - 80٪ متموجة لفحص اللوحة وتوزع بالتساوي في جميع أنحاء البئر.
  2. في اليوم التالي، وإعداد اللقاح الفيروس، التي يمكن أن تكون من MNV المصابين الخلايا في زراعة الأنسجة أو من الأنسجة أو عينات البراز المتجانس من MNV المصابين الفئران. عند استخدام عينات الأنسجة، وبحجم حبة البازلاء بيواللجنة الاقتصادية لأوروبا من النسيج المتجانس في 2 أنابيب المسمار غطاء مل تحتوي على السيليكا الخرز العقيمة في 1 مل من DMEM-10 باستخدام الخالط الأنسجة (مثل MagnaLyser؛ روش). لعينات البراز، ينبغي المتجانس لا يزيد عن 3 الكريات برازي في وسائل الإعلام 1 مل. ثم يتم تجميد جميع العينات (C ° في -80) وإذابة مرة واحدة قبل تنفيذ الاختبار الصفائحي.
  3. إعداد 10-أضعاف التخفيفات من اللقاح الفيروس في كامل المتوسطة-5 DMEM، الذي يتألف من DMEM / ارتفاع نسبة الجلوكوز بنسبة 5٪ (V / V) المنخفضة سم داخلي المنشأ الجنينية المصل البقري (<10 EU / مل)، HEPES ملي 10، 100 U / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين، 1 ملم غير الأحماض الأمينية الأساسية، 2 مم L-الجلوتامين.
  4. يتم إعداد عشرة أضعاف التخفيفات المسلسل في 24 لوحات جيدة: يستخدم ماصة مكرر على الاستغناء 1،35 مل سائل الإعلام في آبار متعددة، يتم إجراء التخفيف 10 -1 عن طريق خلط 1،35 مل من وسائل الاعلام و 0.15 مل من الفيروس التي تحتوي على العينة، و ثم يتم إضافة 0.15 مل من التخفيف 10 -1 إلى 1.35 مل من وسائل الإعلام لجعل 10 -2 dilutioن وهلم جرا. من المهم تغيير نصائح كل مرة تقوم فيها بإجراء التخفيف جديدة. ويمكن استخدام ماصة الأقنية لجعل التخفيفات من عينات متعددة في وقت واحد مع اثنين من نصائح المناسب في واحدة جيدا من لوحة 24 أيضا نقل وإجمالي قدره 0.15 مل لكل بئر (انظر الشكل 3A).
  5. وهناك مجموعة نموذجية لتخفيف الخليط الأنسجة والبراز هو محتويات 10 -1 إلى 10 -3. ومع ذلك، لويحات من هذه العينات تميل إلى أن تكون أصغر حجما مقارنة مع تلك العينات من زراعة الأنسجة. وعلاوة على ذلك، في بعض الحالات لا بد من التخفيف من العينات البرازية 1:100 لتمييع بما فيه الكفاية أي مكونات سامة من البراز التي قد تعطل أحادي الطبقة الخلية، مما يعيق القدرة على العد لويحات. مجموعة تخفيف لست] زراعة الأنسجة يعتمد على نقطة زمنية ذات الاهتمام خلال دورة الحياة الفيروسية. قد تكون هناك حاجة التخفيفات التي تصل إلى 10 -9 في ذروة العدوى.
  6. بعد إعداد التخفيفات المسلسل، تسمية لوحة 6 جيدا ق تحتوي على RAW 264،7 monolayers (من القسم 2.1) مع اسم العينة والتخفيفات يجري مطلي. لوحة واحدة في وقت واحد، وإزالة جميع وسائل الإعلام من قبل عبها بها أو الشفط ذلك. فورا بعد ذلك إضافة 0.5 مل من عينة المخفف إلى بئر، ثم كرر مع تكرار جيدا، قبل الشروع في تخفيف المقبل. مرة واحدة تم إضافة جميع التخفيفات 3 إلى لوحة لوحة واحدة الخيمة، ذهابا وإيابا من جهة لضمان أن تتم تغطية جميع الخلايا. التعامل مع لوحة واحدة في وقت واحد لضمان أن الخلايا لن تجف.
  7. بعد إضافة 0.5 مل من التخفيفات إلى كل بئر، كومة لوحات تستقيم لهم واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. لأن الصوت تضاف إلى كل بئر ليست كافية لتغطية أحادي الطبقة تماما، لوحات تحتاج إلى إمالة بلطف ذهابا وإيابا من جهة كل 10-15 دقيقة أو وضعها على جهاز هزاز (~ 18 التذبذبات في دقيقة). هذا يمنع الخلايا من الجفاف.

3. انخفاض ذوبان نقطة الاغاروز (SeaPlaque) تراكب إعداد

ق = "jove_content"> ملاحظة: إعداد فإنه من المستحسن أن يكون مع عدة زجاجات تعقيمها SeaPlaque الاغاروز في وقت مبكر. ويمكن إعادة الاغاروز ذاب في الميكروويف قبل الاستخدام.

  1. حساب كمية تراكب اللازمة لإجمالي حجم لوحات قبل الحضانة 1 ساعة كاملة. حجم المطلوب هو 2 مل / جيد أو 12 لوحة ml/6-well. إعداد الاغاروز (انظر القسم 3.2) وسائل الإعلام (انظر القسم 3.3) بشكل منفصل.
  2. لإعداد الاغاروز، تعليق 3 غرام من الاغاروز SeaPlaque في إجمالي حجم 100 مل من الماء المقطر (3٪ ث / ت) في زجاجة. الأوتوكلاف لمدة 20-30 دقيقة. (إذا أعدت بالفعل الاغاروز قبل اليد، وإعادة ذوبان الاغاروز في الميكروويف.) ومن المهم أن تتوازن SeaPlaque الاغاروز إلى 42 درجة مئوية في حمام مائي قبل الاستخدام لأنه إذا كان الاغاروز حار جدا، وسوف تقتل الخلايا. تأكد من مستوى الماء يساوي أو أعلى من مستوى الاغاروز لتجنب التصلب غير مرغوب فيها.
  3. لإعداد وسائل الإعلام: جعل 100 مل من MEM 2X وسائل الإعلام، والتي تتكون من2X MEM، 10٪ (V / V) المنخفضة سم داخلي المنشأ الجنينية المصل البقري (<10 EU / مل)، HEPES ملي 10، 100 U / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين، 4 مم L-الجلوتامين. تتوازن وسائل الإعلام إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي.
  4. خلط كل من الاغاروز SeaPlaque وسائل الإعلام MEM 2X معا في زجاجة معقمة في نسبة 1:1 مباشرة قبل تتراكب على monolayers الخلية المصابة. إذا كانت هناك حاجة أكثر من 200 مل تراكب، حجم الانقسام في زجاجات متعددة والحفاظ في 37 ° C حمام مائي حتى جاهزة للاستخدام.
  5. في نهاية الحضانة ساعة 1 (انظر القسم 2.7)، ونضح اللقاح الخروج من كل بئر. إضافة ببطء 2 مل من تراكب إلى حافة كل بئر من خلال وضع تلميح ماصة ضد الجدار من كل جانب. يمكن التعامل معها تصل إلى 5 لوحات الخلايا في وقت واحد دون جفاف.
  6. السماح للتراكب لترسيخ ما يقرب من 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل وضع لوحات تستقيم في الأنسجة حاضنة الثقافة. احتضان لوحات لمدة 48 ساعة في C ° 37 في 5٪ CO 2.
  7. بعدفترة الحضانة، لوحات مرئية بصوت ضعيف للعين المجردة، حتى تحقق لوحات غير ملوثين لحضور لويحات. إذا لم ويحات واضحة، لاحتضان ساعة 4 إضافية والتحقق مرة أخرى. ومع ذلك، ينبغي أن فترة حضانة لا تتجاوز الحد الأقصى 72 ساعة.

4. تصور اللوحات من قبل تلوين الأحمر متعادلة

  1. تصور اللوحات، على استعداد محايدة حل تلطيخ الأحمر بإضافة 3 مل من الأحمر محايدة (0.33٪ W / V في DPBS؛ سيغما، وأنواع # N2889) لكل مل PBS 1X 97 من (نسيج الصف الثقافة، المغنيسيوم 2 + -، كاليفورنيا 2 + - الحرة؛ Gibco، وأنواع # 10010). حساب حجم محايدة حل تلطيخ الحمراء اللازمة لتجربة: يطلب 12 مل محايدة حل تلطيخ حمراء لكل لوحة 6 أيضا. ثم، إضافة 2 مل إلى كل بئر. ورغم أن بعض البروتوكولات فحص اللوحة تتطلب إزالة المكونات الاغاروز من الآبار، في هذا البروتوكول يتم إضافة محايدة حل تلطيخ حمراء مباشرة على تراكب.
  2. بعد ساعة واحدة فيcubation في C ° 37، تحقق مما إذا ويحات واضحة مع محايدة حل تلطيخ حمراء لا يزال في الآبار. إذا لم تكن لويحات جلية واضحة، تسمح للتلطيخ أن يستمر لمدة ساعة أخرى. مواصلة احتضان حتى لويحات واضحة. (ملاحظة: تلوين لأكثر من 3 ساعة ليست الأمثل، وإذا لم ويحات واضحة في العينة الضابطة إيجابية بعد 3 ساعة من تلطيخ، وفحص لوحة لا يعمل بشكل صحيح) بعد اكتمال تلوين، نضح في حل محايدة تلطيخ الأحمر ، وضمان المكونات الاغاروز غير منزعجة، ثم انتقل إلى عد لويحات.
  3. عد لويحات من خلال وضع لوحة رأسا على عقب على ضوء مربع ووضع العلامات على نقطة تحسب لويحات لتجنب اتهامات مكررة. اختيار التخفيف من الاعتماد ويحات في الآبار حيث يتم فصل واضح لويحات (أي لا يوجد دليل مرئي لويحات الصمامات معا). إذا كان ذلك ممكنا، عد لويحات على اثنين من التخفيفات. من المهم أن نلاحظ أن حجم اللوحة قد تختلف بين سلالات MNV، وفيروس اللقاح، ويعتمد علىحالة من الخلايا 264،7 RAW خلال فحص اللوحة.
  4. إذا لم ويحات واضحة في بئر، إما عدم وجود الفيروس الموجود في العينة أو كمية الفيروس كان تحت حد الكشف عن لوحة الفحص. في هذه الحالة، وصمة عار الآبار الأحمر مع اللون مشابهة لوحة الآبار التي تحتوي على أخرى. بدلا من ذلك، لوحظ أيضا عدم وجود لويحات عندما يكون هناك عدد كبير جدا من الجسيمات الفيروسية موجودة في التخفيف معين. هذا يؤدي إلى تحلل كامل للأحادي الطبقة والآبار تظهر البرتقال / أصفر اللون.
  5. حساب التتر الفيروسية. إضافة عدد من اللوحات في كل من الآبار حتى التخفيف واحد ومضاعفة من قبل عامل تخفيف (أي 1 مل إذا يصاب 2 الآبار مع 0.5 مل). وسوف تسفر هذه الوحدات كمية وحة التشكيل (PFU) في حجم اللقاح الخاص من 1 مل. على سبيل المثال، في الشكل 4 في التخفيف 10 -2، واحدة أيضا (وضع علامة "II") لديها 14 لويحات وغيرها إضافة إلى (وضع علامة "V") لديه 17 لويحات. وهكذا، فإن عيار الفيروسية هو 14X10 2 + 2 = 17x10 3100 (3.1x10 3) PFU / مل.

5. ممثل النتائج

يمكن كميا المعدية MNV-1 الجزيئات باستخدام مقايسة لوحة على النحو المبين في الشكل 1 تخطيطي. 2A الشكل يظهر بشكل جيد مع أحادي الطبقة من الخلايا 264،7 RAW فقط قبل للإصابة، في حين 2B الشكل يظهر ثلاثة لويحات واضحة تدل عليه الأرقام الرومانية I، II والثالث في بئر. وصفت الخطوات الفردية للفحص في أرقام 3A من خلال الشكل 3A يظهر F. إعداد سلسلة التخفيف يساوي 10-fold لعينة المحتوية على الفيروس. الشكل 3B يظهر نقل التخفيفات لتكرار آبار لوحة 6 أيضا. الشكل 3C يظهر جهاز هزاز يستخدم لاحتضان خلايا 264،7 RAW مع اللقاح في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة الشكل 3D يبين أن الخلايا مضافين مع SeaPlaque: MEMالخليط. الشكل 3E يظهر لوحة في درجة حرارة الغرفة للسماح للتراكب لترسيخ، بينما يوضح الشكل 3F يجري ملطخة الخلايا الحمراء مع محايدة 0.01٪ في وقت لاحق 48 ساعة الحل. بعد تلطيخ الخلايا للموارد البشرية 1-3 و الشفط ومحايدة حل تلطيخ الأحمر، لويحات واضحة ويمكن الاعتماد (الشكل 4).

الشكل 1
الشكل 1. التخطيطي للمقايسة MNV بروتوكول البلاك.

الشكل 2
الشكل 2. الصور ممثل بئر أحادي الطبقة قبل وبعد الإصابة تشكيل لويحات. تم زراعة A) 264،7 RAW ليلة وضحاها والخلايا المصورة تحت المجهر ضوء في 20X التكبير. B) كانت ملطخة الخلايا بمحلول 0.01٪ الحمراء محايدة بعد 48 ساعةتصور ص العدوى وتحت المجهر ضوء في التكبير 4X. الأرقام الرومانية I، II، III وتحديد ثلاث لوحات مرئية.

الشكل 3
الشكل 3. صور الممثل من الخطوات لوحة الفحص المختلفة. A) مستعدة MNV-1 اللقاح في 10 أضعاف التخفيفات. B) يضاف إلى اللقاح monolayers خلية في الآبار مكررة. C) يتم تحضين الخلايا واللقاح بواسطة هزاز ل1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. D) وخلايا مضافين مع خليط 1:1 من الاغاروز SeaPlaque وسائل الإعلام 2X MEM. E) يتم تحضين لمدة 10 دقيقة لوحات في درجة حرارة الغرفة للسماح للتراكب لترسيخ. F) تلوين الخلايا مع حل تلطيخ الحمراء محايدة 48 ساعة بعد العدوى.

الشكل 4
الشكل 4. MNV-1 لويحات في أشكال الخلايا monolايرز. المبين هنا هو فحص لوحة ممثل لوحة 48 ساعة بعد الإصابة، والتي تبين لويحات ملطخة محايدة حل تلطيخ حمراء بعد 1 ساعة من الحضانة. لوحة تظهر الآبار مكررة من التخفيفات 10-أضعاف الثلاثة. الآبار الرومانية التي تحمل أرقام الأول والرابع تتوافق مع التخفيف 10-1؛ الثاني والخامس تتوافق مع التخفيف 10-2؛ الثالث والسادس تتوافق مع التخفيف 10-3. يشار إلى عيار الفيروسية من العينة أدناه (انظر القسم 4.5 للحصول على تفاصيل العملية الحسابية).

Discussion

طريقة الفحص لوحة MNV-1 المقدمة هنا هو وسيلة لقياس الجسيمات المعدية MNV. وذلك باتباع الخطوات الفحص موضح في الشكل 3، يمكن للمرء الحصول على التتر الفيروسية استنساخه. الحد من الكشف عن الفحص يعتمد على التخفيف بدءا المستخدمة. عندما بدءا من التخفيف من العينة 1:10 كما هو موضح أعلاه، والحد من الكشف عن لوحة الفحص هو 10 PFU (أي، 1 لوحة مرئية في التخفيف -1 10). لأن كل لوحة تمثل فيروس واحد، ويمكن أيضا أن الفحص البلاك تستخدم في تنقية السكان نسيلي من MNV عن طريق التقاط لوحات معزولة والترويج لها كما هو موضح سابقا 1. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا أن تستخدم لوحة التنقيات لفصل السكان عن فيروس فرد من السكان الفيروس المختلط. وجود قيود من استخدام لوحة فحص للكشف عن الإصابة MNV هو أن ليس كل سلالات MNV تشكل لويحات 4. ومع ذلك، قد يكون من الممكن التغلب على inabiliTY بعض سلالات MNV، معزولة عن الحيوانات، لتشكل لويحات من الركض متسلسل هذه الفيروسات في زراعة الأنسجة 7. بديلا لوحة الفحص هو قياس الجسيمات المعدية عن طريق تقنية 50 TCID 3 و 4. هذا الاختبار الكمي كمية الفيروس اللازمة لإنتاج CPE في 50٪ من تلقيح خلايا الأنسجة بعد التخفيفات نقطة النهاية ويأخذ 1 أسبوع لإكمال لMNV 4. بالإضافة إلى كونه أبطأ من فحص اللوحة، وفحص 50 TCID هي أيضا ليست حساسة (حد الكشف = 200 TCID 50 / مل) نتيجة لسمية عينات الأنسجة إلى خلايا 264،7 RAW 4.

على الرغم من أن وصفت الخطوات الحاسمة في إطار بروتوكول طوال البروتوكول، القسم التالي ملخصا لتسهيل حل المشاكل. الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول هو ضمان أن تبقى الخلايا RAW 264،7 قابلة للحياة في جميع أنحاء مقايسة لدعم تكاثر الفيروس. يمكن هذايمكن رصدها في كل مرحلة من مراحل الفحص عبر المجهر الضوئي. ويكفل بقاء الخلية بطريقتين. أولا، ينبغي الحرص على عدم السماح لتجف الخلايا أثناء التعامل مع لوحات. وهكذا، يتم تلقيح لوحات في وقت واحد، هز خلال الفترة العدوى، ويجب أن تبقى مغلقة كلما أنها لا يجري التعامل معها. ثانيا، ينبغي أن حلول أضاف على خلايا تكون معايرتها إلى ~ 37 ° C. وعلاوة على ذلك، من المهم جدا للمحافظة على الصحة العامة للخلايا 264،7 RAW للحفاظ عليها في وسائل الإعلام التي تحتوي على مصل منخفضة الذيفان الداخلي (<10 EU / مل)، مما يحد من تفعيل الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، لاحظنا ارتفاع معدل فشل الفحص عند استخدام لوحة الخلايا من مرور 30 ​​أو أعلى. ورغم أن هذا سوف تختلف من مختبر إلى المرجح المختبر، من المهم أن تشمل السيطرة الايجابية (على سبيل المثال، مع عينة فيروسية المعروفة عيار) لضمان التتر استنساخه، خاصة عند استخدام الممر أعلى RAW 264،7 الخلايا. للحد من استخدام الخلايا أعلى المرور، فإنه من المستحسن أن تجميد قارورة من أوائل باساجنرال الكتريك الخلايا من الخلايا عند استلام 264،7 RAW وبدء ثقافة جديدة من قوارير المجمدة في كثير من الأحيان. والبدء من جديد مع مرور منخفض مزارع الخلايا يكون من المفيد أيضا عندما تظهر خصائص الخلايا تغييرها، مثل عدم الالتزام، والتغيرات في شكل الخلية (على سبيل المثال من جولة إلى طويل ضعيف وانتشرت)، أو عندما تم الكشف عن تلوث الميكوبلازما. نقطة أخرى المهم أن تولي اهتماما لهو التأكد من أن يتم تغيير نصائح ماصة بين العينات وخلال التخفيفات. وهذا يضمن التخفيفات المسلسل دقيقة ومنع انتقال التلوث بين العينات. خطوة واحدة في البروتوكول حيث يمكن استخدام غيض ماصة هو نفسه مرة أخرى عند إضافة التخفيفات المسلسل لنفس العينة من الآبار. في هذه الحالة، ينبغي للمرء أن يبدأ من اللقاح تضعف معظم لأقل، وماصة صعودا وهبوطا بقوة عند وضعه التخفيف جديدة.

بروتوكول فحص اللوحة هي قابلة للتعديل لعدة تعديلات. واحد التي يمكن تعديلها إلا عندما رهنا لا يكفي لتحصين خلايا الآبار في تكرار لتطعيم فقط هو بئر واحد لكل التخفيف. ومع ذلك، منذ حجم اللقاح هو 0.5 مل، وعدد من اللوحات يحتاج بعد ذلك إلى أن تتضاعف بمعامل من 2 إلى PFU لتطبيع / مل. ويمكن أيضا الفحص وحة تكييفها للاستخدام مع أي خط الخلية تمسكا الأخرى التي هي قادرة على دعم تكرار MNV، ولقد وصفت هذه للخط دبقية الفئران BV-2 الخلية 8. التعديلات الأخرى التي يمكن تنفيذها هي التعديلات التي تم وصفها لبروتوكولات الفحص للبحث عن الفيروسات وضعت لوحة أخرى. في حالة MNV، وقد تم بالفعل إجراء التعديلات التالية نفذت بنجاح، واستخدام السليلوز الميثيل بدلا من البلاك البحر الاغاروز وتلطيخ الخلايا مع البنفسجي الكريستال أو الميثيلين الأزرق بدلا من الأحمر محايدة 10 و 11.

وعموما، يمكن بسهولة أن تتكيف هذا البروتوكول حسب الحاجة لقياس الأخرى المكونة للوحة الفيروسات أو استخدامها لأوراسكوم تليكوم القابضةإيه الفيروسات التي تسبب التهابات في الخلايا التحللي 264،7 RAW، مما يجعلها أداة مفيدة لقياس الجزيئات الفيروسية المعدية بشكل عام.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نشكر أعضاء المختبر Wobus للتعليقات والاقتراحات الهامة. وقد تم تمويل العمل في مختبر CEW من بدء الأموال من جامعة ميشيغان، منحة التطوير الوظيفي من مركز NIH / NIAID إقليمي للتميز في الدفاع والحيوية الناشئة بحوث الأمراض المعدية (RCE) برنامج، منطقة V 'العظمى البحيرات 'RCE (NIH 1-U54 جائزة-AI-057153) وNIH R01 AI080611. MBG-H. بتمويل من المناعة التجريبية (NIH T32 A1007413-16) والآليات الجزيئية الميكروبية في إمراض (NIH T32 A1007528) منح تدريبية لجامعة ميتشيغان. وقد تم تمويل JBC بواسطة دي دي Coordenação Aperfeiçoamento Pessoal فخمة NIVEL دي (CAPES)، برازيليا، البرازيل.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/ High glucose Hyclone SH30243.02
2x MEM Gibco 11935
100x Penicillin and streptomycin Hyclone SV30010
10 mM Non-essential amino acids Hyclone SH30238.01
1M HEPES Hyclone SH30237.01
200 mM (100x) L-glutamine Hyclone SH30034.01
Fetal Bovine Serum Gibco, Hyclone 10437, SH30070.02
Sea Plaque Agarose Lonza 50100
Neutral Red 0.33% Sigma N2889
1x PBS Gibco 10010
1.0 mm Zirconia/Silica beads BioSpec Products 11079110z
Model 35 Speed Rocker Labnet S2035
Magna Lyser Instrument Roche 03358968001
Raw 264.7 cell line ATCC TIB-71
Tissue culture incubator Sanyo MCO-18AIC

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wobus, C. E. Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages. PLoS Biol. 2, e432 (2004).
  2. Wobus, C. E., Thackray, L. B., Virgin, H. W. Murine norovirus: a model system to study norovirus biology and pathogenesis. Journal of virology. 80, 5104-5112 (2006).
  3. Condit, R. C. Ch. 2. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. 1, Lippincott Williams & Wilkins. 25-58 (2007).
  4. Thackray, L. B. Murine noroviruses comprising a single genogroup exhibit biological diversity despite limited sequence divergence. Journal of virology. 81, 10460-10473 (2007).
  5. Reed, L. J., Muench, H. A simple method for estimating 50% endpoints. American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1932).
  6. Chachu, K. A. Antibody is critical for the clearance of murine norovirus infection. Journal of virology. 82, 6610-6617 (2008).
  7. Barron, E. L. Diversity of murine norovirus strains isolated from asymptomatic mice of different genetic backgrounds within a single U.S. research institute. PLoS ONE. 6, e21435 (2011).
  8. Cox, C., Cao, S., Lu, Y. Enhanced detection and study of murine norovirus-1 using a more efficient microglial cell line. Virology journal. 6, 196 (2009).
  9. Cooper, P. D. The plaque assay of animal viruses. Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).
  10. Hyde, J. L. Mouse norovirus replication is associated with virus-induced vesicle clusters originating from membranes derived from the secretory pathway. Journal of virology. 83, 9709-9719 (2009).
  11. Simmonds, P. Bioinformatic and functional analysis of RNA secondary structure elements among different genera of human and animal caliciviruses. Nucleic acids research. 36, 2530-2546 (2008).

Comments

2 Comments

  1. I am very happy to read your paper   here I have a question about Low Melting Point Agarose (SeaPlaque) Overlay Preparation   DMEM medium was used in RAW²64.7 cell culture and ²*MEM was used in overlay   why   Thank you!

    Reply
    Posted by: Shengnan T.
    April 22, 2013 - 10:52 PM
  2. Hi,
    I'm having a bit of trouble titering my virus. The virus is lysing the cells during the infection process but when I go to do plaque assay I have no plaques. Any suggestions?

    Reply
    Posted by: Thomas Y.
    August 27, 2013 - 12:06 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics