قوالب الطباعية عكس Thermoresponsive لإنشاء منقوشة الهلاميات المائية ثنائي مكون للثقافة الخلية 3D

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

تم استخدام bioprinter لخلق الهلاميات المائية منقوشة على أساس العفن فداء. تم ردم القالب بولوكسامير مع هيدروجيل الثاني، ثم مزال، وترك الفراغات التي كانت مليئة هيدروجيل الثالث. يستخدم هذا الأسلوب شطف سريع والقابليه جيدة من بولوكسامير لتوليد أبنية معقدة من البوليمرات الحيوية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Müller, M., Becher, J., Schnabelrauch, M., Zenobi-Wong, M. Printing Thermoresponsive Reverse Molds for the Creation of Patterned Two-component Hydrogels for 3D Cell Culture. J. Vis. Exp. (77), e50632, doi:10.3791/50632 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bioprinting هو التكنولوجيا الناشئة التي جذوره في صناعة النماذج الأولية السريعة. عمليات الطباعة المختلفة يمكن تقسيمها إلى bioprinting الاتصال 1-4 (البثق، وتراجع القلم والطباعة الحجرية الناعمة)، تماس bioprinting 5-7 (نقل إلى الأمام ليزر، ترسب الحبر النفاث) والتقنيات القائمة على الليزر مثل اثنين من الفوتون بلمرة ضوئية المنشأ 8. ويمكن استخدامه في العديد من التطبيقات مثل هندسة الأنسجة 9-13، 14-16 والتصنيع الدقيق جهاز الاستشعار البيولوجي كأداة للرد على أسئلة بيولوجية أساسية مثل التأثيرات من شارك في زراعة أنواع مختلفة من الخلايا 17. خلافا لأساليب الطباعة التصويرية أو لينة الطباعة الحجرية المشتركة، bioprinting قذف لديه ميزة أنه لا يحتاج إلى قناع منفصلة أو ختم. باستخدام CAD البرمجيات، وتصميم هيكل يمكن أن تتغير بسرعة وتعديلها وفقا لمتطلبات المشغل. هذا يجعل bioprinting أكثر مرونة من القائم الطباعة الحجريةالنهج.

نحن هنا لشرح الطباعة من العفن فداء لإنشاء بنية 3D متعددة المواد باستخدام مجموعة من الأعمدة داخل هيدروجيل كمثال على ذلك. هذه الركائز يمكن أن تمثل هياكل جوفاء لشبكة الأوعية الدموية أو الأنابيب داخل قناة دليل العصب. كانت المواد المختارة للقالب الذبيحه بولوكسامير 407، البوليمر thermoresponsive مع خصائص الطباعة ممتازة الذي يوجد سائلا عند 4 ° C ومادة صلبة فوق درجة حرارة دبق لها ~ 20 درجة مئوية لمدة 24.5٪ W / V حلول 18. هذه الخاصية تسمح للقالب الذبيحه المستندة إلى بولوكسامير إلى أن مزال على الطلب ولها مزايا أكثر من تفكك البطيء للمادة الصلبة وخاصة بالنسبة للهندستها الضيقة. وقد طبع بولوكسامير على الشرائح الزجاجية المجهر لإنشاء قالب فداء. كان pipetted الاغاروز في قالب ويبرد حتى دبق. بعد شطف من بولوكسامير في الماء البارد الجليد، وملئت الفراغات في القالب الاغاروز مع الجينات ميتاكريليت SPIKED مع FITC الفيبرينوجين المسمى. وبعد ذلك عبر ربط فراغات مملوءة الأشعة فوق البنفسجية وتم تصويرها في بناء مع مجهر برنامج التحصين الموسع ومضان.

Introduction

جعلت نهج هندسة الأنسجة تقدما كبيرا خلال السنوات الماضية فيما يتعلق تجديد الأنسجة والأعضاء البشرية 19،20. ومع ذلك، حتى الآن، والتركيز على هندسة الأنسجة كثيرا ما كان يقتصر على الأنسجة التي لديها بنية بسيطة أو أبعاد صغيرة مثل المثانة 21،22 أو الجلد 23-25. جسم الإنسان، ومع ذلك، يحتوي على العديد من الأنسجة معقدة ثلاثية الأبعاد حيث يتم ترتيب الخلايا والمصفوفة خارج الخلية بطريقة محددة مكانيا. لتصنيع هذه الأنسجة، مطلوب تقنية يمكن وضع الخلايا والسقالات المصفوفة خارج الخلية ضمن بناء ثلاثي الأبعاد في مواقع محددة. Bioprinting لديه القدرة على أن تكون هذه التقنية حيث الرؤية من تصنيع الأنسجة معقدة ثلاثية الأبعاد يمكن أن تتحقق 10،11،26-28.

يتم تعريف Bioprinting بأنها "استخدام عمليات نقل المواد عن الزخرفة وتجميع يختلط بيولوجياالمواد evant - الجزيئات والخلايا والأنسجة، والمواد الحيوية القابلة للتحلل -. مع منظمة المقررة لإنجاز واحد أو أكثر من الوظائف البيولوجية "4 وهو يشمل العديد من التقنيات المختلفة التي تعمل في مختلف القرارات وجداول الطول، بدءا من قرار اللجنة الفرعية ميكرون من اثنين سوف الفوتون البلمرة 29 إلى قرار من 150 ميكرون إلى 420 ميكرون للطباعة قذف 1،12،30. ليس مادة واحدة أو تركيبة المواد تلبية متطلبات كل طريقة 31. للطباعة البثق، المعلمات الرئيسية هي اللزوجة والوقت دبق 32، حيث اللزوجة العالية ودبق السريع ومرغوب فيه.

3D الطباعة هو الأسلوب الذي يسمح لخلق سهلة من قوالب فداء لخلق هندستها معقدة 30،33،34. ويستند هذا على عملية بناء قالب باستخدام تقنية النماذج الأولية السريعة مثل bioprinter قذف. يتم استخدام قالب الأضاحي إنشاؤهالتشكيل هياكل معقدة من المواد التي يصعب طباعتها بسبب اللزوجة المنخفضة وبطء وقت دبق. الطريقة المعروضة هنا ينطوي على إنشاء قالب الذبيحه التي تتكون من المواد التي يذوب بسرعة في درجة حرارة منخفضة ويمكن أن يكون مقذوف بدقة. كتلة كوبوليمر بولي (جلايكول الإثيلين) 99 بولي (البروبيلين جليكول) 67 بولي (جلايكول الإثيلين) 99 (المعروف أيضا باسم بلورونيك F127 أو بولوكسامير 407) يستوفي هذه المتطلبات. وقد تم بالفعل استخدامه في نسخة معدلة في الطباعة قذف ولكن على حد علمنا، لم يتم استخدامها لطباعة نسخة معدلة في لها بسبب عدم الاستقرار في البيئات السائلة. بولوكسامير 407 يظهر أيضا استجابة السلوك الحراري معكوس 18 أي أن يتحول من هلام لسول على التبريد. الأهم من ذلك، فإنه يمكن أن تكون مطبوعة في هياكل منحنية بشكل تعسفي معقدة مع الدقة العالية جدا. وهذا يسمح للإنشاء هيدروجيل منظم منمنخفض اللزوجة المواد، في هذه الحالة بطيء التبلور الاغاروز، من قبل pipetting الحل في القالب الذبيحه المطبوعة. مزيج من الطباعة القالب الذبيحه مع الدقة العالية وشطف سريع لها من هيدروجيل منظم مسبوكة يجعل من وسيلة سريعة ومرنة لإنشاء قوالب مع هندستها مختلفة دون استخدام قناع أو طابع بقدر ما هو مطلوب منها في أساليب الطباعة الحجرية. هيدروجيل منظم مسبوكة يمكن ملء مع مزيد من مادة أخرى غير مناسبة للطباعة قذف بسبب اللزوجة منخفضة. هذا هو في حالتنا الجينات اللزوجة المنخفضة حل ميتاكريليت. هنا نقدم طريقة thermoresponsive قوالب الذبيحه العكسي لتنميط هيدروجيل باستخدام المثال من مجموعة عمود.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد بولوكسامير 407 الحل

إذا كانت متوفرة، نفذ إعداد الحل بولوكسامير في غرفة باردة (4 ° C). إن لم تكن متاحة، ووضع زجاجة في كوب مملوء بالماء المثلج. عند ارتفاع درجات الحرارة في بولوكسامير سوف يكون فوق نقطة الجل ولن يحل بشكل صحيح.

  1. إضافة 60 مل من الجليد الباردة حل PBS في زجاجة زجاج ويقلب بقوة باستخدام محرك مغناطيسي.
  2. تزن 24.5 غرام من بولوكسامير وإضافتها بكميات صغيرة لPBS الباردة. الانتظار حتى يذوب بولوكسامير جزئيا قبل أن يضيف أكثر من ذلك.
  3. يحرك حل حتى يذوب كل بولوكسامير.
  4. إضافة برنامج تلفزيوني الباردة حتى يتم التوصل إلى الحجم النهائي من 100 مل. فإن تركيز النهائي يكون 24.5٪ ث / V.
  5. وقف التحريك الحل والسماح لها بقية في 4 درجات مئوية حتى الفقاعات والرغوة في حل اختفت. وسيتم نقل الفقاعات التي محاصرون داخل هلام لعخرطوشة rinter وسوف يؤدي إلى عيوب في قوالب الذبيحه المطبوعة.
  6. فلتر (مرشح 0.22 ميكرون) الحل مباشرة في خرطوشة الطباعة لإزالة أي جزيئات غير المرغوب فيها التي يمكن أن تسد إبرة. التصفية الخطوة يجب أن يؤديها في غرفة باردة (أو إن لم تكن متاحة مع نصائح تبريد، فلتر الخ) لتجنب التبلور من بولوكسامير في التصفية. الحفاظ على خرطوشة تحميلها في 4 درجات مئوية حتى 30 دقيقة قبل التجربة.

2. إعداد طابعة 3D

وكان الطابعة 3D المستخدمة في هذا العمل "BioFactory" من regenHU. الجزء قذف النظام يتكون من عدة أجزاء. وترد خرطوشة تحت الضغط في الجزء العلوي إلى موصل عن طريق محول لور للقفل. الموصل يسد فراغات بين مخرج من خرطوشة ومدخل صمام الملف اللولبي. عند مخرج للصمام الملف اللولبي، والإبر بأقطار مختلفة يمكن استخدامها. هذه المواد هي مقذوف على فرعيإستراتي الذي يقام لمرحلة الانتقال من فراغ. ويصور أجزاء رئيسية من النظام في الشكل 1. النظم القائمة على قذف الأخرى يمكن استخدامها لعملية الطباعة، ويحتاج إلى عملية التحسين الذي يتعين القيام به لكل نظام.

  1. وضع صمام الملف اللولبي (فوهة قطرها 0.3 مم) والإبرة (قطرها الداخلي 0.15 مم) في 1.5 مل أنابيب اختبار منفصلة مليئة الماء عالى النقاء ووضعها في حمام بالموجات فوق الصوتية لتنظيف ساخنة لمدة 30 دقيقة. شطف الصمامات تنظيفها مع الايثانول وتجفيفها بمسدس النيتروجين.
  2. تثبيت صمام وابرة في الطابعة وكذلك فارغة، خرطوشة نظيفة.
  3. تطبيق 3 بار ضغط على النظام وتفجير أي السوائل المتبقية من صمام تثبيت وإبرة مع الهواء المضغوط. لأقطار إبرة صغيرة، فمن المستحسن أن يكون لها مرشح (فلتر حقنة مشتركة، 0.45 ميكرومتر حجم المسام) مثبتة في الخروج من الهواء المضغوط لتجنب دخول الجسيمات الصغيرة التي يمكن أن تسد إبرة. تحويل الضغط وتثبيت خرطوشة محملة بولوكسامير. ينبغي أن تؤخذ في خرطوشة من الثلاجة حوالي 30 دقيقة قبل تركيب خرطوشة وبالتالي فإن بولوكسامير يمكن أن تصل إلى درجة حرارة الغرفة وهلام.
  4. تطبيق الضغط 3 بار للنظام والاستغناء بولوكسامير حتى يصل إلى رأس الإبرة ومقذوف في حبلا المستمر.

3. تعظيم الاستفادة من معلمات الطباعة

لإنشاء هياكل 3D دقيقة، عملية الطباعة يجب أن يكون الأمثل للمواد المختارة والتركيز. اعتمادا على اللزوجة ونظام الطباعة 3D سيكون لكل مادة تسفر عن حجم صرفها محددة وسماكة الخط لمجموعة ثابتة من المعلمات.

  1. مع برامج CAD مناسبة (قادرة على إنشاء ملفات ISO من الرسومات)، ورسم خط واحد حول نفس طول الهيكل الذي كنت تنوي طباعتها.
  2. وضع المجهر الشريحة الزجاجية 25 مم × 75 مم × 1مم أو أي الركيزة الأخرى في الطابعة وضمان الحصول عليها عن طريق تشغيل الفراغ.
  3. في برنامج الطابعة، قم بتعيين صمام الملف اللولبي إلى ارتفاع وتيرة 50 هرتز وضبط الضغط العالي من 3 بار.
  4. طباعة طبقة واحدة من خط واحد مع سرعة مرحلة من 300 مم / دقيقة.
  5. تقليل الضغط حتى يتم الوصول إلى عرض الخط المطلوب. يمكنك أيضا التحكم في وحدة التخزين التي هي مقذوف عبر الوقت الافتتاحية للصمام.
  6. الحد من وتيرة صمام حتى يمكن طباعة أي خط متواصل بعد الآن. اختيار تردد أعلى من هذه القيمة.

ملاحظة: بمجرد تحقيق عرض الخط المطلوب وخطوط المستمر، وتحديد الأمثل سرعة مرحلة وسمك طبقة أي رفع الإبرة بعد طبقة واحدة مطبوعة.

  1. طباعة عدة طبقات فوق بعضها البعض ومعرفة ما إذا كانت الإبرة في المكان المناسب فوق الطبقة السابقة بعد عدة طبقات المطبوعة. ضبط سمك طبقة (أسانسير إبرة ) بحيث يتم طباعة كل طبقة على رأس واحد القادم (الشكل 3).
  2. تقليل سرعة مرحلة من المراحل من 300 مم / دقيقة تدريجي بحيث طبقات مقذوف تبدأ وتنتهي في نفس المواقف السابقة ومنها (الشكل 4). سرعات مرحلة عالية جدا تتسبب في المرحلة أن تتحرك قبل المادة مقذوف وقد لمست الطبقة السابقة.
  3. لطباعة الهياكل دعامة اتبع الخطوات 3.1.-3.8.، ولكن بدلا من رسم خط واحد رسم نقطة واحدة. المعلمات إلى التركيز على عند الطباعة الركائز هي الضغط (ينظم سماكة طبقة وقطر عمود من بولوكسامير)، وهي المرة الاولى من صمام (حجم مقذوف) ووقت الإقامة من رأس الطباعة في الموضع حيث تودع الركيزة .
  4. عندما يتم تحسين المعلمات، طباعة عدة طبقات من خط ينبغي أن يؤدي إلى جدار صلب، أو في حالة من النقاط، عمود. حفظ المعلمات لاستخدامها لاحقا.

> 4. الطباعة وشطف من العفن عكسي

استخدام المعلمات وجد أثناء إجراء التحسين من هذه النقطة.

  1. طباعة البنية الداخلية (هنا هو مجموعة عمود) على شريحة المجهر والزجاج، واتركها لتجف بين عشية وضحاها. هذا أ) يقلل من حجم وسمك الهياكل وب) يوفر التصاق أفضل بين هيكل والركيزة، حتى انطلاقه خلال الردم يمكن تجنبها.
  2. مع برنامج CAD، رسم الهيكل الذي يتكون من الجدار الخارجي الذي يحيط هيكل كنت تنوي ومزال بعيدا وشغلها. طباعة هيكل مع بولوكسامير. سوف طباعة الجدار يستغرق 6 دقائق.

انتباه: الجدار يجب أن تكون مطبوعة 3.5 مم على الأقل بعيدا عن البنية الداخلية بسبب الأبعاد من الإبرة. وإلا فإن الطباعة من الجدار الخارجي سوف يدمر البنية الداخلية

  1. إعداد الحل الذي تريد ردم SACR الخاصقالب ificial مع (هنا الاغاروز 1٪ في الماء منزوع الأيونات). يجب أن يكون الحل الاغاروز درجة حرارة بين 35 درجة مئوية و 45 درجة مئوية. تحت درجة الحرارة هذه، فإن الاغاروز يصلب بسرعة كبيرة جدا؛ أعلاه درجة الحرارة هذه، فإنه قد تدمر الركائز المطبوعة لأن بنية بولوكسامير شأنها أن تخفف.
  2. ملء القالب ببطء الذبيحه مع حل الردم باستخدام ماصة. وينبغي أن يتم هذا ببطء لتجنب تدمير بنية داخل الجدار.
  3. السماح للهلام حل ردم أو تشعبي واعتمادا على البوليمر المستخدمة. في حالة الاغاروز أخذت مكان التصلب عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  4. مكان القالب الذبيحه تجمعت عليها في حمام الثلج لمدة 10 دقيقة إلى أزل هيكل بولوكسامير.
  5. لطخة بنية ردم بمنديل ورق وضعه على الزجاج الجديد شريحة المجهر. اضغط على هيكل بعناية على شريحة المجهر والزجاج لتجنب تسرب من هيدروجيل الثالث من الفراغ في الفضاء بينهيكل ردم وشريحة المجهر والزجاج.

5. ملء الفراغات

  1. لملء الفراغات من قبل بولوكسامير مزال غادر، وملء حل البوليمر المقصود في حقنة مزودة إبرة G 30. في هذا المثال، استخدمنا ميتاكريليت الجينات 1٪ في محلول كلوريد الصوديوم 0.15 M مع إضافة 0.05٪ W / V الليثيوم فينيل-2 ،4،6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) و 2.5٪ V / V-488 من اليكسا الفيبرينوجين مترافق . تمت إضافة اليكسا-488 الفيبرينوجين مترافق لأغراض التصور.
  2. Photopolymerize البوليمر مع كثافة عالية مصباح الأشعة فوق البنفسجية (100 واط، 365 نانومتر، المسافة من الركيزة كان 3.5 سم) لمدة 5 دقائق وصورة بناء باستخدام مجهر برنامج التحصين الموسع ومضان أو متحد البؤر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وأظهرت النتائج أن ممثل تقنية القالب العكسي (مبين في الشكل 2) سيخلق هلام المهيكلة التي يمكن شغلها مع المواد الثانية. في بداية كل عملية الطباعة هي الأمثل المعلمات الطبعة الأولى. سوف التعديلات خطوة حكيمة من المعلمات يؤدي إلى بنيات متعددة الطبقات المطبوعة هو مبين في الشكل 3 والشكل 4 عندما تطبع خطوط واحد. إذا كان سمك طبقة (رفع الإبرة بعد طبقة واحدة مطبوعة) منخفضة جدا، وسوف واحدة نلاحظ أن إبرة سوف تلمس الطبقات السابقة. إذا كانت إبرة مرتفعة جدا، فإن نمط الموجة على سطح بناء المطبوعة تظهر. ويمكن رؤية هذا في أرقام 3A-3D، حيث كانت كل طبقة اختبار سمك كبير جدا بالنسبة بالنظر إلى سرعة المرحلة. بسبب ارتفاع سرعة مرحلة يقلل من سماكة طبقة، والاختلافات الصغيرة بين مجموعة وسمك طبقة الفعلي تتراكم ويبدأ نمط الموجةلتبدو وكأنها ذروة الزيادات بناء. عن طريق خفض سماكة طبقة، تصبح الاختلافات أصغر ويظهر نمط موجة في موضع أعلى من ذي قبل (المشار إليها بواسطة الخطوط المنقطة في الشكل 3C والشكل 3D). لسماكة طبقة ثابتة، إذا كانت سرعة المرحلة هو سريع جدا وهذا سيؤدي إما في نمط الموجة أو في التركيبات التي الضيقة نحو الأعلى ويكون لها انتفاخ في بداية بناء (الحافة اليمنى من الهيكل المطبوعة) كما هو مبين في أرقام 4A-4C. وكانت المعلمات الأمثل لبولوكسامير وقت افتتاح 0.2 ميللي ثانية، تردد 31.14 هرتز، وهو سمك طبقة من 0.15 مم، ضغط 1.5 بار وسرعة 75 مم / دقيقة. أدى الطباعة مع هذه المعلمات في الجدران الصلبة على نحو سلس كما في الشكل 4D. ومع ذلك، تم اختيار سرعة أعلى مرحلة من 100 مم / دقيقة لعملية لتقليل وقت الإنتاج من الجدران.

مع معلمات الأمثل لPIllar الطباعة (فتح الوقت 0.2 ميللي ثانية، تردد 31.14 هرتز، طبقة سماكة 0.08 مم، ضغط 1.5 بار، وسرعة المرحلة 200 مم / دقيقة، والإقامة وقت 0.3 ثانية) أنشأنا مجموعة من الأعمدة كما هو مبين في الشكل 5A. أدت آثار الجفاف للصفيف عمود في الانحناء من الركائز نحو الوسط. ويمكن تخفيض هذا التأثير، ولكن ليس تجنبها، من خلال وضع ركائز أخرى بعيدا عن بعضها البعض. ثم تتم طباعة جدار حول أعمدة كما هو مبين في الشكل 5B.

بعد شطف من العفن بولوكسامير الذبيحه في الماء البارد، تم إنشاؤها الهلاميات المائية الاغاروز منظم مثل واحد هو مبين في الشكل 5C. بعد ملء الفراغات مع الجينات الفلورسنت الحل ميتاكريليت ويشابك اللاحقة، رواية هيدروجيل في وهيدروجيل مجموعة دعامة مثل ويمكن إجراء واحد هو مبين في الشكل (6). و3D ض المكدس إعادة الإعمار يبين بوضوح ركائز الفلورسنت التي تم إنشاؤها. الشكل 7 يوضح STRONG> إمكانية هذه التقنية لإنشاء قوالب أيضا منحني بشكل تعسفي.

الشكل 1
الشكل 1. تصوير لbioprinter. أ) صورة من bioprinter "BioFactory". الإبرة وصمام تكون غير مرئية في هذه الصورة، ولكن وصفت في B). ما يصل إلى 8 رؤوس الطباعة هي التي شنت على برج تحول الذي يسمح احد لتغيير بسرعة بين المواد. تتم الطباعة في الصعود إلى منصة متحركة يمكن تحريكها في X-، Y-Z-والاتجاه. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

s.jpg و"SRC =" / files/ftp_upload/50632/50632fig2.jpg "/>
الشكل 2. مخطط عملية إنتاج قوالب فداء لتصنيع الهلاميات المائية منظم.

الشكل (3)
الشكل (3). طبقة سمك الأمثل. طبقات بولوكسامير المطبوعة بسرعة مرحلة ثابتة (250 مم / دقيقة) مع تناقص سمك طبقة. عندما سمك طبقة عالية جدا، وهو نمط موجة يخرج. هذا يختفي تدريجيا مع تناقص سمك طبقة. خطوط صلبة حمراء تشير إلى الجزء السفلي من بناء المطبوعة في حين أن الخطوط المنقطة الحمراء تشير إلى ارتفاع جزء عيب خالية من بناء المطبوعة. طبقة سمك هي A) 0.18 ملم، B) 0.16 ملم C) 0.15 ملم وD) 0.13 مم. يشير شريط أحمر 2 مم.

"> الشكل 4
الشكل 4. مرحلة السرعة الأمثل. طبقات بولوكسامير المطبوعة مع سمك طبقة من 0.15 ملم مع سرعات مختلفة للمرحلة A) 250 مم / دقيقة، B) 200 مم / دقيقة، C) 150 مم / دقيقة وD) 75 مم / دقيقة. عن طريق خفض سرعة المرحلة، ونقطة انطلاق لعملية الطباعة لجميع طبقات نفس ويمكن طباعتها على الجدار الصلب. يشير شريط أحمر 2 مم.

الرقم 5
الشكل 5. إنتاج الهلاميات المائية منقوشة. A) مجموعة عمود بولوكسامير المجففة مع أعمدة فصل 1.75 مم من بعضها البعض. ويتسبب الانحناء من الركائز التي كتبها تجفيف الآثار. B) مجموعة عمود محاطة بجدار مصنوعة من بولوكسامير قبل pipetting لالاغاروز. C) منظمالاغاروز هيدروجيل بعد إزالة العفن فداء.

الشكل (6)
الشكل (6). 3D ض المكدس إعادة بناء ركائز fluorescently المسمى مضمن في الاغاروز السقالة.

الرقم 7
الرقم 7. دوائر متحدة المركز طبعت من بولوكسامير. طبقات واحدة واضحة. يشير شريط أحمر 2 مم.

معايير التصميم المعلمة الطباعة
فاينر سماكة طبقة
  • الضغط ↓
  • سرعة مرحلة ↑
  • افتتاح الوقت ↓
  • تردد ↓
أصغر سمك الخط
  • الضغط ↓
  • سرعة مرحلة ↑
  • افتتاح الوقت ↓
  • تردد ↓
البثق المستمر
  • ضغط ↑
  • سرعة مرحلة ↓
  • افتتاح الوقت ↑
  • تردد ↑
أسرع سرعة البناء
  • ضغط ↑
  • سرعة مرحلة ↑
  • افتتاح الوقت ↑
  • تردد ↑

الجدول 1. أربعة معايير التصميم للقذف من خطوط بولوكسامير وكيف يمكن أن تتأثر المعلمات الطباعة المختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا نقدم، لأول مرة، واستخدام البوليمر thermoresponsive لقالب الذبيحه التي يمكن مزال بسرعة في الماء البارد بسبب الانتقال هلام سول من بولوكسامير من ~ 20 درجة مئوية. سرعة العملية برمتها يجعل بولوكسامير مثيرة للاهتمام لخلق السريع للهياكل البوليمر الحيوي الذي لا يمكن طباعتها مع القرار الملائم. التقنية المذكورة هنا يمكن أن تستخدم لتنميط هيدروجيل واحد داخل هيدروجيل أخرى أو لإنشاء قنوات ميكروفلويديك كما ذكرت سابقا لمواد أخرى 35. الاستفادة من بولوكسامير كقالب الذبيحه هو أنه يمكن أن تكون مطبوعة في هندستها التعسفي في صلب يبني طبقة تلو طبقة التي يمكن شغلها ومزال بعد ذلك.

نحن هنا وصف عملية إنشاء قالب الذبيحه مع بولوكسامير مع الردم اللاحق للهيدروجيل الثاني لإنشاء الهلاميات المائية منظم. المواد اللازمة لهيدروجيل منظم يمكن أن يكون CHاوسين مع قيود في ما يخص اللزوجة ودرجة الحرارة عند نقطة التعبئة. منخفض حلول السلائف لزج من البوليمرات المستخدمة عادة مثل البولي ايثيلين جلايكول diacrylate 36،37، 38،39 الجينات، الاغاروز 40 و البوليمرات الحيوية methacrylated هي مجرد أمثلة قليلة للمواد تعبئة مناسبة 41-43. المواد اللزجة عالية ولكن قد لا تملأ هندستها ضيقة أو يمكن أن تدمر العفن الذبيحه في حالة من هياكل هشة رقيقة مثل الركائز المطبوعة هنا. ولذلك تم اختيار وانخفاض نسبة الاغاروز حل لالردم. ميزة أخرى لاستخدام الاغاروز في تركيبة مع بولوكسامير هو أنه المواد الهلامية عن طريق التبريد. لذلك، عندما المغمورة في الماء البارد، الاغاروز يحتفظ حالته تبلور، وهي الدولة التي تعكس بدقة معكوس نمط بولوكسامير المطبوعة.

الخطوات الهامة في هذا الإجراء ينطوي على تعظيم الاستفادة من المعلمات والطباعة، وملء القالب والأضاحيملء الفراغات. وكانت المعلمات الطباعة التي تم الأمثل لوقت تردد وفتح صمام، والضغط، وسرعة مرحلة وسمك طبقة. يتم تعريف سماكة طبقة كما رفع من الإبرة بعد كل طبقة المطبوعة. في حالة من الركائز، وهي المرة الإقامة، أي المواد الوقت هو مقذوف على نقطة دون تحريك المرحلة، أيضا كان لا بد من تعديلها. عملية التحسين يمكن أن يكون مضيعة للوقت لأن التغييرات في معلمة واحدة يمكن أن يكون لها تأثيرات على العديد من المعلمات تصميم خطوط مقذوف. يتم وصف المعلمات الرئيسية لمعايير تصميم مختلف في الجدول 1.

الخطوة الثانية الهامة في هذه العملية هو ملء القالب فداء. ملء القالب الذبيحه هو خطوة حساسة. بحاجة إلى هياكل صغيرة وضيقة المراد شغلها بعناية، وغالبا ما يدويا، والصب بسيطة من حلول قد لا يكون من الممكن دائما.

ملء حذرا من لياليولذلك تم إجراء قالب acrificial مع الاغاروز باستخدام ماصة ميكرولتر 100 لتجنب تدمير الركائز. الخطوة الأخيرة، ملء الفراغات، يتطلب استخدام حقنة مزودة إبرة G 30. وينبغي الحرص على تجنب تشكيل فقاعة خلال التعبئة.

يمكن أن المواد الهلامية مختلفة في بناء المقدمة هنا تحتوي أيضا على خلايا. عن طريق وضع نوع واحد من الخلايا في الهلاميات المائية داخل الفراغات ونوع خلية أخرى داخل هيدروجيل منظم، يمكن إنشاء الإعداد المشترك ثقافة محددة مكانيا. شبكة مترابطة 3D كما في المنشور من ميلر وآخرون. 30، شبكات الأوعية الدموية أو العصبية من الممكن أيضا. ومن شأن النهج الممكنة لهذه الشبكات أن تكون لطباعة خطوط داخل الجدار المحيط وملء الفراغات مع هيدروجيل الثانية، تشعبي هيدروجيل الثانية وتواصل مع طباعة استدارة طبقة المقبل بنسبة 90 درجة. ميزة الطباعة بولوكسامير كقالب الذبيحه هو أنه لا يتطلبقالب ماجستير أو قناع. كما أنها لا تتطلب رأس الطباعة ساخنة لبثق لم يحترم المادية وانسداد للنظام في تجاربنا.

بنيات مثل تلك المعروضة هنا يمكن أن تستخدم في المستقبل كما نظمت مكانيا 3D المشترك الثقافات لدراسة نشرها على أساس التفاعلات خلية خلية أو لاكتشاف المخدرات. ومع ذلك، نسخة مؤتمتة بالكامل من الإجراء المقدمة هنا يحتاج إلى تطوير لتصبح ناجحة في مجال فحص المخدرات.

لتلخيص، قدمنا ​​طريقة التي تسمح للطباعة هندستها التعسفي التي يمكن شغلها مع الهلاميات المائية ومزال بعد ذلك. بهذه الطريقة، يمكن إنشاء أبنية منظم هيدروجيل في وهيدروجيل بطريقة مباشرة وفعالة من حيث التكلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما تعلن.

Acknowledgments

نشكر ديبورا شتودر للمساعدة مع bioprinter.

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل برنامج الاتحاد الأوروبي الإطاري السابع (FP7/2007-2013) تحت منحة اتفاق N ° NMP4-SL-2009-229292.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Poloxamer (Pluronic F127) Sigma P2443
PBS Invitrogen 10010-015
CAD software regenHU BioCAD
Alginate methacrylate Innovent e.V Technologieentwicklung Jena Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292
Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate Invitrogen F13191
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) Innovent e.V Technologieentwicklung Jena Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292
Agarose Lonza 50004
EQUIPMENT
Bioprinter regenHU Biofactory
Valve regenHU 300 μm Nozzel Diameter
Needle regenHU 150 μm Inner Diameter
Zeiss Axioobserver with ApoTome Zeiss
UV Light Source UVP Blak-Ray B-100AP High Intensity UV Lamp 100 W

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fedorovich, N. E., et al. Evaluation of photocrosslinked Lutrol hydrogel for tissue printing applications. Biomacromolecules. 10, 1689-1696 (2009).
  2. Lee, K. B., Park, S. J., Mirkin, C. A. Protein nanoarrays generated by Dip-Pen Nanolithography. Abstr Pap Am Chem S. 223, C94 (2002).
  3. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual review of biomedical engineering. 3, 335-373 (2001).
  4. Mironov, V., Reis, N., Derby, B. Review: bioprinting: a beginning. Tissue engineering. 12, 631-634 (2006).
  5. Odde, D. J., Renn, M. J. Laser-guided direct writing of living cells. Biotechnology and bioengineering. 67, 312-318 (2000).
  6. Derby, B. Bioprinting: inkjet printing proteins and hybrid cell-containing materials and structures. J Mater Chem. 18, 5717-5721 (1039).
  7. Therriault, D., White, S. R., Lewis, J. A. Chaotic mixing in three-dimensional microvascular networks fabricated by direct-write assembly. Nature. 2, 265-271 (2003).
  8. Engelhardt, S., et al. Fabrication of 2D protein microstructures and 3D polymer-protein hybrid microstructures by two-photon polymerization. Biofabrication. 3, 025003 (2011).
  9. Mironov, V. Printing technology to produce living tissue. Expert opinion on biological therapy. 3, 701-704 (2003).
  10. Mironov, V., Kasyanov, V., Drake, C., Markwald, R. R. Organ printing: promises and challenges. Regenerative medicine. 3, 93-103 (2008).
  11. Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line. Current opinion in biotechnology. 22, 667-673 (2011).
  12. Fedorovich, N. E., De Wijn, J. R., Verbout, A. J., Alblas, J., Dhert, W. J. Three-dimensional fiber deposition of cell-laden, viable, patterned constructs for bone tissue printing. Tissue engineering. Part A. 14, 127-133 (2008).
  13. Dhariwala, B., Hunt, E., Boland, T. Rapid prototyping of tissue-engineering constructs, using photopolymerizable hydrogels and stereolithography. Tissue engineering. 10, 1316-1322 (2004).
  14. Cook, C., Wang, T., Derby, B. Inkjet Printing of Enzymes for Glucose Biosensors. Mater Res Soc Symp P. 1191, 103-109 (2009).
  15. Cui, X., Gao, G., Qiu, Y. Accelerated myotube formation using bioprinting technology for biosensor applications. Biotechnol Lett. 1-7 (2012).
  16. Fabrication of a Glucose Biosensor by Piezoelectric Inkjet Printing. Wang, T. M., Cook, C., Derby, B. 2009 3rd International Conference on Sensor Technologies and Applications (Sensorcomm 2009), 82-85 (2009).
  17. Shim, J. H., Lee, J. S., Kim, J. Y., Cho, D. W. Bioprinting of a mechanically enhanced three-dimensional dual cell-laden construct for osteochondral tissue engineering using a multi-head tissue/organ building system. J. Micromech. Microeng. 22, (2012).
  18. Malmsten, M., Lindman, B. Self-Assembly in Aqueous Block Copolymer Solutions. Macromolecules. 25, 5440-5445 (1021).
  19. Cebotari, S., et al. Clinical application of tissue engineered human heart valves using autologous progenitor cells. Circulation. 114, I132-I137 (2006).
  20. Matsumura, G., Hibino, N., Ikada, Y., Kurosawa, H., Shin'oka, T. Successful application of tissue engineered vascular autografts: clinical experience. Biomaterials. 24, 2303-2308 (2003).
  21. Kropp, B. P., Zwischenberger, J. B. Tissue-engineered autologous bladders: new possibilities for cystoplasty. Nature clinical practice. Urology. 3, 588-589 (2006).
  22. Oberpenning, F., Meng, J., Yoo, J. J., Atala, A. De novo reconstitution of a functional mammalian urinary bladder by tissue engineering. Nature. 17, 149-155 (1999).
  23. Wood, F. Tissue engineering of skin. Clinics in plastic surgery. 39, 21-32 (2012).
  24. Groeber, F., Holeiter, M., Hampel, M., Hinderer, S., Schenke-Layland, K. Skin tissue engineering--in vivo and in vitro applications. Clinics in plastic surgery. 39, 33-58 (2012).
  25. Bannasch, H., Momeni, A., Knam, F., Stark, G. B., Fohn, M. Tissue engineering of skin substitutes. Panminerva medica. 47, 53-60 (2005).
  26. Jakab, K., Neagu, A., Mironov, V., Forgacs, G. Organ printing: fiction or science. Biorheology. 41, 371-375 (2004).
  27. Boland, T., Mironov, V., Gutowska, A., Roth, E. A., Markwald, R. R. Cell and organ printing 2: fusion of cell aggregates in three-dimensional gels. The anatomical record. Part A, Discoveries in molecular, cellular, and evolutionary biology. 272, 497-502 (2003).
  28. Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).
  29. Raimondi, M. T., et al. Two-photon laser polymerization: from fundamentals to biomedical application in tissue engineering and regenerative medicine. Journal of applied biomaterials. 10, 56-66 (2012).
  30. Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature. 11, 768-774 (2012).
  31. Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33, 6020-6041 (2012).
  32. Murphy, S. V., Skardal, A., Atala, A. Evaluation of hydrogels for bio-printing applications. Journal of biomedical materials research. Part A. 101, 272-284 (2013).
  33. He, J., Li, D., Liu, Y., Gong, H., Lu, B. Indirect fabrication of microstructured chitosan-gelatin scaffolds using rapid prototyping. Virtual and Physical Prototyping. 3, 159-166 (2008).
  34. Sachlos, E., Reis, N., Ainsley, C., Derby, B., Czernuszka, J. T. Novel collagen scaffolds with predefined internal morphology made by solid freeform fabrication. Biomaterials. 24, 1487-1497 (2003).
  35. Lee, W., et al. On-demand three-dimensional freeform fabrication of multi-layered hydrogel scaffold with fluidic channels. Biotechnology and bioengineering. 105, 1178-1186 (2010).
  36. Turturro, M., Christenson, M., Larson, J., Papavasiliou, G. Matrix metalloproteinase (MMP) sensitive PEG diacrylate (PEGDA) hydrogels with spatial variations in matrix properties direct vascular cell invasion. J. Tissue. 6, 302-302 (2012).
  37. Butterworth, A., Garcia, M. D. L., Beebe, D. Photopolymerized poly(ethylene) glycol diacrylate (PEGDA) microfluidic devices. Roy. Soc. Ch. 4-6 (2005).
  38. Shachar, M., Tsur-Gang, O., Dvir, T., Leor, J., Cohen, S. The effect of immobilized RGD peptide in alginate scaffolds on cardiac tissue engineering. Acta biomaterialia. 7, 152-162 (2011).
  39. Jeon, O., Bouhadir, K. H., Mansour, J. M., Alsberg, E. Photocrosslinked alginate hydrogels with tunable biodegradation rates and mechanical properties. Biomaterials. 30, 2724-2734 (2009).
  40. Mauck, R. L., et al. Functional tissue engineering of articular cartilage through dynamic loading of chondrocyte-seeded agarose gels. J. Biomech. Eng-T Asme. 122, 252-260 (2000).
  41. D'Arrigo, G., et al. Hyaluronic acid methacrylate derivatives and calcium alginate interpenetrated hydrogel networks for biomedical applications: physico-chemical characterization and protein release. Colloid Polym. Sci. 290, 1575-1582 (2012).
  42. Pescosolido, L., et al. Hyaluronic Acid and Dextran-Based Semi-IPN Hydrogels as Biomaterials for Bioprinting. Biomacromolecules. 12, 1831-1838 (2011).
  43. Guo, Y., et al. Hydrogels of collagen/chondroitin sulfate/hyaluronan interpenetrating polymer network for cartilage tissue engineering. J. Mater. Sci-Mater. M. 23, 2267-2279 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics