이미징 및 면역 조직 화학에 대한 망막 Wholemount 준비를 위해 최적화 된 프로토콜

Biology

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Ivanova, E., Toychiev, A. H., Yee, C. W., Sagdullaev, B. T. Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (82), e51018, doi:10.3791/51018 (2013).

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Abstract

면역 조직 화학적 평가를 수행 할 때 섬세한 조직으로 작업하는 것은 복잡한 요소가 될 수 있습니다. 여기서, 우리는 달리 조직의 손상을 야기 다양한 프로토콜의 사용을 허용 면역 처리 중에 거실 고정 조직 모두에 구조적지지를 제공하는 링 - 지원 수화 PTFE 멤브레인을 이용하는 방법을 제시한다. 첫째, 이것은 망막 조직 생활에 형광 마커의 알약로드와 함께 보여줍니다. 멤브레인 지원을 주입하는 동안 조직의 무결성을 유지하고 추가 영상 또는 처리를위한 준비를 쉽게 전송을 허용하는 동안이 방법은, 대상 구조를 신속하게 시각화 할 수 있습니다.

둘째, 카르 보디이 미드로 고정 조직에서의 항체 염색을위한 절차를 설명한다. 파라 포름 알데히드 고정이 일반적이지만, 카르 보디이 미드 고정 시냅스 단백질의 시각화를 위해 우수한 기판을 제공. 카르 보디이 미드의 제한으로 인해 발생하는 고정 된 조직이 상대적으로 약해이라고하고 있지만, 이것은지지 막의 사용하여 극복된다. 망막 조직은 이들 기술을 설명하기 위해 사용되지만, 그들은 어떤 깨지기 쉬운 조직에 적용될 수있다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Millicell Cell Culture Insert, 12 mm,
hydrophilic PTFE (Biopore), 0.4 μm
Millipore PICM01250
Insulin syringe, 1 ml Beckton Dickinson 309659
Scissors Fine Science Tools 15003-08 dissection
Forceps, Dumont #55, inox Fine Science Tools 11255-20 dissection
Cryostat Leica various
Confocal Microscope System Nikon various
Capillary glass World Precision Instruments 1B150F-4
P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter Instrument Co.
Picospritzer III Parker Hannifin
Glass Bottom Culture Dishes MatTek Corporation P35G-0-14-C
Petri dish Falcon 1008
Disposable Graduated Transfer Pipettes VWR 16001-180
Multiwell plates, 24-well Beckton Dickinson 351147
Cover glass, #1 Electron Microscopy Sciences 72200-30
Polysine adhesion slides Electron Microscopy Sciences 63412-01
Microscope slides Globe 1301
Liquid Blocker Electron Microscopy Sciences 71312
VECTASHIELD mounting medium Vector Laboratories H-1000
OCT medium Sakura 4583
Parafilm laboratory film Fisher 13-374-10
Dow Corning high vacuum grease Sigma-Aldrich Z273554
Mouse anti-PSD95 Millipore MABN68 antibody
Donkey anti-mouse Alexa 568 Invitrogen A10037 antibody
Isolectin Alexa 488 Invitrogen I21411
Chemiblocker Chemicon 2170S
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284
Sulforhodamine Sigma-Aldrich 341738
Carbodiimide Thermo Scientific 22980 EDC
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148

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References

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