신장에서 더블 네거티브 (Double Negative) αβ의 T 세포의 분리

Immunology and Infection

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ERRATUM NOTICE

Summary

DNabT 세포가 말초 T 세포 사이 드물다; 그러나, 그들은 특정 비 림프 조직에 풍부합니다. 비 림프 조직에서 DN T 세포를 분리의 어려움은 병태 생리 학적 중요성을 인식 증가에도 불구하고 자신의 기능 분석을 방해한다. 우리는 쥐의 신장에서 고순도 DN T 세포의 분리를 위해 새로운 프로토콜을 설명합니다.

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Martina, M. N., Bandapalle, S., Rabb, H., Hamad, A. R. Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney. J. Vis. Exp. (87), e51192, doi:10.3791/51192 (2014).

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Abstract

비 림프 조직에서 DN T 세포의 분리를위한 표준 프로토콜은 다양한 면역 반응에서의 점점보고 참여에도 불구하고 현재 없습니다. DN T 세포는 allotransplants 1-6로 면역 및자가 면역 반응과 내성을 조절에 연루되어 고유 한 면역 세포의 유형입니다. DN T 세포는 말초 혈액 및 이차 림프​​ 기관 (비장과 림프절)에서 드문,하지만,하지만, 정상적인 신장의 주요 거주자입니다. 아주 작은 인해 주변에서의 소수 자신의 병태 생리 학적 기능 7에 대한 알려져있다. 우리는 최근에 정상 상태 및 허혈 재관류 손상시 신장 8이 인구의 포괄적 인 표현형 및 기능 분석을 설명했다. DN T 세포 기능 분석을 크게 신장에서의 그들의 분리를위한 프로토콜을 개발함으로써 강화 될 것이다.

여기, 우리는 isolatio 수있는 새로운 프로토콜을 설명뮤린 신장으로부터 고순도 AB CD4 + CD8 + T 세포 및 DN T 세포의 N. 간단히 말해서, 우리는 콜라게나 제를 사용하여 신장 조직을 소화하고 밀도 구배에 의해 신장 단핵 세포 (KMNC)를 분리. 이것은 KMNC에서 70 %로 3 %에서 조혈 T 세포를 풍부하게하기 위해 두 단계로 이어진다. 첫 번째 단계는 CD45 + 분리 키트를 사용하여 조혈 세포의 포지티브 선택으로 구성된다. 두 번째 단계에서는, DN T 세포는 부정적인 CD4, CD8, 및 MHC 클래스 II 단일 클론 항체 및 CD1D α-galcer 량체를 사용하여 원하지 않는 세포의 제거에 의해 격리됩니다. 이 전략은 90 % 이상 순수 DN T 세포의 인구에 이르게한다. FACS 분석이어서 상기 항체 표면 염색은 순도를 확인하기 위하여 사용된다.

Introduction

주변 αβTCR + CD3 + CD4 - CD8 - 이중 부정은 (DN) T 세포는 별개의 표현형과 기능 1-4을 가지고 다양한 하위 집합으로 분할된다. DN T 세포는 제대로 이해하고 있지만 점점 다른 질병 모델 4-6의 병태 생리 학적 면역 반응에 연루된다.

DN T 세포는 점점 더 다양한 면역 및자가 면역 반응의 조절과 이식 실험 관용의 변조에 연루되는 고유 한 면역 세포의 유형입니다. 4-6, 9 그들은 비장과 림프절 (말초 혈액 및 이차 림프 기관에 드문 ). 그러나, 그들은 정상 신장 및 소화관 상피 10-12의 주요 거주자. 약간은 정상 상태에서의 신장에서의 기능 7에 대해 이러한 신장 transpl과 관련된 급성 신장 손상 (AKI)과 같은 병적 인 조건에서 알려져있다개미.

이 때문에, 각 플레이어의 역할을 정의 alloresponses 포함한 면역 반응을 조절하는 다른 면역 세포의 복잡한 역할은 alloresponses 승낙 새로운 치료제를 설계하는데 중요하다. 생리적 및 다양한 질병 상태에서 신장에 존재 DN T 세포의 상당수 감안 DN T 세포는 이식 수혜자에서 중요한 마우스 및 인간 면역 및자가 면역 반응을 조절하는데 역할 및 alloresponses 재생할 가능성이있다. 아직도 흩어져있는 증거 불구하고 축적하는 것은 모두 병원성 및 면역 기능에 DN T 세포를 연루하지만, 왜, 어떻게 그들이 특정 유해하거나 억제 기능을 발휘하고 환경 영향을 그들이 어떻게 그것을 제대로 이해된다.

때문에 신장에서의 낮은 풍요, 분리의 개선 된 방법이 필요합니다.

t에서 DN T 세포의 분리를위한 표준 프로토콜은 없습니다그는 비 림프 조직. 우리 프로토콜은 신장에서 DN T 세포의 분리를위한 신규 한 방법을 설명한다; 그러나, 상기 방법은 또한 다양한 비 - 림프 조직을 위해 사용될 수있다.

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Protocol

1. 악기의 제조, 문화, 미디어 및 시약

  1. 상품 : 무균 조건 하에서 시약을 준비하고 층류 후드를 사용합니다.
  2. 소 태아 혈청의 5 %, 수소 나트륨 2.1 g, 10 ㎖ 글루타민산 100 배, HEPES 10 ㎎, 1 밀리그램의 나트륨 피루 베이트 10 ㎖를 100 배의 페니실린 / 스트렙토 마이신을 추가, RPMI 조직 배양 배지 1 L를 준비합니다.
    참고 : 권장되는 조직 배양 배지, RPMI는 DMEM에 교환 할 수있다.
  3. 5 % 콜라게나 "D"솔루션 (조직 문화 매체의 10 ML에 콜라게나 "D"5 ㎖)을 준비합니다.
  4. 100 %, 80 % 및 40 %의 세 가지 다른 농도에서 퍼콜 솔루션을합니다. 다음의 농도는 1 샘플에 대해 계산됩니다. 실온에서 솔루션을 유지합니다.
    1. 퍼콜 용액 (원액부터) 희석 퍼콜 9 ML을 추가합니다; PBS 배 1 ㎖를 추가합니다.
    2. 퍼콜 솔루션 :; 퍼콜 8 ㎖를 100 % 추가 PBS 1X 2 ㎖를 추가합니다.
    3. 퍼콜 솔루션 :퍼콜 80 % 4 ㎖를 추가; PBS 1X 4 ㎖를 추가합니다.
  5. (FACS) 버퍼를 정렬 형광 활성화 된 셀의 1 L를 확인; 5 ML 10 % BSA (0.1 % BSA), 1 ㎖의 10 % 아 지드 화 나트륨 (0.1 %), 2 ㎖ EDTA 에이전트, 1X PBS 1,000 ml로 구성을 추가합니다.

신장 소화의 2. 준비

  1. , 필요한 기관 승인을 획득 한 표준 방법으로 쥐를 희생에게서 피를 뽑다 현재 규정 및 동물 관리 지침에 따라 한.
    1. 펜토 바르 비탈 (0.07 ㎎ / ㎏)와 마우스를 마취.
    2. 일어난 과다 출혈로 넘어갑니다.
    3. 수술대에 누운 위치에 마우스를 놓습니다.
    4. 70 % 에탄올과 복부 영역 스프레이.
  2. 페트리 접시에 콜라게나 D 솔루션의 10 ML을 추가합니다.
  3. 제거하고 각 마우스 모두에서 신장을 디 캡슐.
    1. 에 흉골의 복부 피부와 복막을 통해 중간 선 절개를함으로써 abdomimal 구멍을 엽니 다치골.
    2. 측으로 측방 부위를 이동하여 좌측 신장을 노출.
    3. 조심스럽게 집게로 왼쪽 캡슐을 분리합니다.
      참고 : 캡슐은 신장을 둘러싸고있는 투명한 층으로 나타납니다 부분적으로 perinephric 지방 조직에 의해 덮여.
    4. 수술 가위를 사용하여 척추 경 혈관을 절단하여 왼쪽 신장을 제거합니다.
    5. 오른쪽 신장에 대해 동일한 절차를 반복합니다.
      참고 : 오른쪽 신장은 더 많은 두개골과 중간 선 (작은 꽃자루가 짧다)에 더 가깝다.
  4. 페트리 접시에 신장을 놓습니다.
  5. 일반 금속 형성 블레이드를 사용하여 작은 조각으로 신장 조직 (치수 1 ~ 2 mm)를 절단하고 (그림 1) 37 ° C에서 인큐베이터에서 30 ~ 45 분 동안 콜라게나 솔루션으로 조각을 배치합니다.

신장의 소화에서 신장 단핵 세포 (KMNC) 3. 준비

  1. 신장의 세포 현탁액을 얻을기계적 조직 배양 배지 25 ㎖에 스트레이너 (70 μm의)와에 resuspend를 사용하여 혼합 조직을 방해하여 소화.
  2. 세포 현탁액을 펠렛 4 ° C에서 10 분 400 XG에 원심 분리기.
  3. 아주 천천히, 조심스럽게 40 % 퍼콜 용액 4 ㎖의 펠렛을 다시 일시 중단하고 부드럽게 전달 플라스틱 피펫으로 80 % 퍼콜 용액 4 ㎖에 오버레이. 이것은 분명히 반투명 층에 의해 분리 된 두 개의 단계가 발생합니다. 상단에있는 지질에 해당하는 노란색 층이 될 것입니다.
  4. 브레이크 오프 모드에서 원심 분리하여 실온에서 30 분 동안 1,500 XG에서 원심 분리기.
  5. 흡인에 의해 노란색 두꺼운 꼭대기 층 (약 1 ~ 2 ㎖) 제거합니다.
  6. 전송 피펫을 가진 두 단계의 인터페이스 만 약간의 흰 반투명 레이어를 수집합니다. 아주 조심스럽게 조직 배양액 2 ㎖를 함유하는 15 ㎖의 원뿔형 튜브에이 현탁액을 전송하고 총 부피를 만들기 위해 배지 13 mL를 넣고15 ML.
  7. 4 ℃에서 10 분 동안 400 XG에 원심 분리기
  8. 배지 1 ㎖에 샘플에 resuspend.
  9. 혈구에 트리 판 블루 배제를 사용 KMNC의 수를 계산 및 신장 당 ML 당 KMNC의 숫자로 결과를 표현한다.
  10. 한 번 상기와 같이 씻는다.

KMNC에서 4. 조혈의 분리 (CD45의 +) 세포 (단계 I)

  1. 버퍼를 실행의 90 μL에 10 7 세포를 재현 탁.
  2. CD45 마이크로 비즈의 10 μl를 추가하고 4 ℃에서 15 분 동안 품어
  3. 반응을 정지 실행 버퍼 1 ML을 추가합니다. 버퍼를 실행 500 μL에서 4 ° C와에 resuspend에서 10 분 400 XG에 원심 분리기.
  4. 자석에 배치하여 자기 열을 준비하고 버퍼를 실행의 3 ㎖로 씻어.
  5. 자기 칼럼을 통해 세포 현탁액을 통과하고 열을 통과 레이블이없는 세포를 수집합니다.
  6. runn 3 ㎖의 세포를 세 번 씻으십시오버퍼를 보내고. 그런 다음 유출 물을 수집합니다.
  7. 분리 및 피펫 열에 버퍼를 실행 5 ㎖에서 열을 제거하고 즉시 표시된 부분을 세척하십시오. 이 부분은 CD45 + 세포가 포함되어 있습니다. 세포를 계산합니다.
  8. 신장에 다른 T 세포 아형의 절대 수를 계산하는 것은 유동 세포 계측법에 의해 결정 양성 세포의 비율 (도 2)에 의해 KMNC의 총 수를 곱한다.

음의 선택에 의해 CD45 + 준비에서 DN T 세포 5. 절연 (단계 II)

  1. 다음 비오틴 항체의 각 2.5 μL (0.5 ㎎ / ㎖, 1.25 μg) 추가 : 안티 - CD4, 항 CD8, 안티-FC 수용체 (CD16/32을), 안티 MHC 클래스 II (IA의 B), 안티 - 매 10 7 조혈 세포에 대한 CD1D PBS-57 량체.
  2. 차가운 방에서 30 분 동안 세포를 품어.
  3. 1 ㎖ 안티 - 비오틴 마이크로 비드를 추가합니다.
  4. 추운 방에서 30 분 동안 품어.
  5. t에 튜브를 놓고그는 자석과 고갈로 진행합니다.
  6. 혈구를 사용하여 음의 분획 DN T 세포의 총 수를 결정하는 생세포 횟수.
  7. 제 1 게이트 CD45의 +, 제 2 게이트 TCRαβ +이 게이팅 전략에 따라 유동 세포 계측법과 DN T 세포의 순도를 확인합니다. CD1D + 세포를 제외합니다. CD8 + 대 플롯 CD4 +는 DN T 세포 (그림 3)를 식별합니다.
  8. 순도 결정된 비율로 총 수를 곱한다.
    참고 : 90 % 이상 순수 DN T 세포의 인구에이 프로토콜의 결과를 사용하여.

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Representative Results

야생형 C57BL / 6 (B6) 신장 신장 당 약 1.5-2.1 × 10 6 단핵 세포가 포함되어 있습니다. 약 10 % 미만은 조혈 CD45 + 세포 수 있습니다. 5 % 콜라게나 제를 사용하여 분해 한 다음도 1에 나타낸 바와 같이 신장 단핵 세포 (KMNC)의 제조에 대하여, 신장이 작은 조각으로 절단된다.

이것은 KMNC 층 (도 2, 왼쪽 패널) 수집하는 밀도 구배 원심 분리를 수행하여 이어진다. KMNC은 다음 섹션 4 (단계 I)의 설명에 따라 CD45 + 자기 마이크로 비드를 사용하여 긍정적 인 선택을 하였다. 컬럼 바인딩 균체 후 FACS로 용출하고 CD45 +에 대해 분석 하였다. 이 유동 세포 계측법 (그림 2, 가운데 패널)에 의해 분석으로 약 80~95%에 CD45 + 세포의 농축에서 발생합니다. 농축 된 CD45 + 조혈 세포 중, 약 40 % ~ 60 %가 TCR + (미도 데이터) αβ이고, 약 30-60%은 DN T 세포 (그림 2, 오른쪽 패널)이었다.

CD4 +, CD8 +, MHC 클래스 II +와 비오틴 특정 단클론 항체 및 안티 - 비오틴 마이크로 비드 및 자기 열을 사용 CD16/32 + 세포에 라벨을 제거하기 위해 음의 선택에 충실 CD45 + 세포를 쓰는 포함하는 마지막 단계. (그림 3) DN T 세포 (90 % -95 %) 고도로 정제에서이 결과. 이 프로토콜 다음은 0.5 × 10 6 조혈 CD45 + 마우스 (두 개의 신장) 기준 자기 표시된 셀을 얻을 수 있었다.

그림 1
그림 1. 5 % 콜라게나 솔루션 소화 신장의 제조. 마우스의 신장이 1-2밀리미터의 작은 조각으로 절단 및 발굴을위한 30 분 콜라게나 D 5 % 용액에 배치됩니다estion. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
. 신장에서 CD45 + 조혈 세포의 농축 그림 2 전략 왼쪽 :.. 긍정적 인 선택에 의해 CD45 + 키트를 사용하여 농축 전에 신장 MNC의 CD45 염색 센터 : 긍정적 인 선택에 의해 CD45 + 키트를 사용하여 농축 한 후 신장 MNC의 CD45 염색 오른쪽. : 게이트 CD45 + 세포 T 세포의 다른 부분 집합들 사이 αβTCR + 세포의 CD4 및 CD8의 프로필. 이 인터넷의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오gure.

그림 3
. 격리 된 DN T 세포의 그림 3 순도 왼쪽 :. 음의 선택에 의한 절연 신장 DN T 세포의 CD45 염색 센터 :.. 음의 선택에 의한 절연 신장 DN T 세포의 TCRαβ 염색 오른쪽 : 격리 된 DN T 세포 중 CD4 및 CD8 염색 음의 선택. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
정화하기 전에 신장에서 4. 림프구 그림. 오른쪽 :.. 신장 조직에서 CD45 염색 정화하기 전에 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

그들은 같은자가 면역 질환, 암, 이식 허용, 급성 신장 손상 (AKI)을 포함하여 신장의 주요 질환과 같은 다른 병리학 적 조건에 연루되고 있기 때문에 DN T 세포에 대한 관심이 증가가, 8, 13 사구체 신염. 따라서, 더 나은 DN T 세포의 병태 생리 학적 기능을 이해 및 특성화가 필요하다. 그러나, 현재 CD4와 CD8 T 세포에 비해 이러한 세포의 기능에 대한 이해의 부족이있다. 가장 큰 이유는 차 림프 기관의 DN T 세포의 소수 따라서 체외 분석 및 입양 전송 실험을위한 충분한 세포를 얻기에 어려움이 있습니다. DN T 세포는 주로 신장 (8)과 같은 비 림프 조직에 있습니다 만, 고체 기관에서 자신의 격리를위한 신뢰할 수있는 방법의 부족은 그 기능을 조사하는 노력을 방해한다. 따라서, DN T 세포의 분리를위한 우리의 새로운 프로토콜신장에서의 DN은 T 세포의 기능에 대한 연구를 촉진 할 것으로 예상된다. DN T 세포와 Fas 결핍 ​​(LPR) 또는 FasL의 결핍 (GLD) 생쥐에서 많은 수있는 림프절에 축적하고 쉽게 림프 기관 (9), (14), (15)로부터 분리 될 수 있지만, 여전히 다른에서 이들 세포를 분리 할 과제로 남아 조직.

이 프로토콜에 따라,이 마우스의 신장은 대략 0.5 × 106 조혈 세포 (CD45 +) 및 주변의 0.2 × 106 DN T 세포를 얻었다. 이 숫자는 체외 배양, 기능 분석 및 / 또는 FACS 분석에서 수행하기에 충분하다. DN T 세포 인구의 순도는 유동 세포 계측법에 의해 확인되어야한다. 이 프로토콜은 98 %로 순수 할 수 있습니다 DN T 세포의 인구를 제공합니다. 이 프로토콜은 신장에서 DN T 세포의 분리를 위해 설계되었지만, 다른 비 림프 기관에서 T 세포의 분리에 대해 수정 될 수있다 마음으로, 갑상선 등

DN T 세포가 작은 모집단을 대표하기 때문에, 정제의 추가적인 라운드를 수행함으로써 수율을 증가시키기 위해 종종 필요하다. DN T 세포의 높은 숫자가 (이상 0.5 × 10 6 세포)를 요구되는 경우, 우리는 시간 및 시약 비용을 감소시키기 위해 분리를 선별 수행 추천합니다.

요약하면,이 프로토콜은 신장에서 DN T 세포의 분리를위한 신규 한 방법을 설명한다. 그것은 긍정적 인 선택하고 원하지 않는 세포 인구의 고갈에 대한 부정적인 선택에 의해 다음 단계 (소화 KMNC의 농축을 통해) 준비로 구성되어있다. 따라서, 분리 공정 동안 DN T 세포의 최소한의 직접적인 조작이있다. 이 마우스 및 인간의 말초 혈액에서 종래 T 세포의 분리를 위해 사용되는 것과 유사한 이차 림프​​ 기관에서 DN T 세포의 분리를위한 기존의 프로토콜이 있다는 것을 주목할 필요가있다.

ove_content "> 그것이 어떤 DN T 세포의 FcR-γ를 표현하는 것으로 나타났습니다 때문에, 다른 옵션은 칵테일 16, 17 CD16/32 +를 포함하지 않는 것입니다. DN T 세포의 성공적인 분리 세부 사항에 큰 관심이 필요합니다. 특히 중요 단계는 다음과 같습니다 조직 소화, 작은 조각으로 신장 조직의 절단, 정확하게 식별하고 밀도 구배에 가벼운 층을 수집을 전반적으로, 연습과 약간의 손재주 몇 차례가 원하는 결과를 달성하기 위해 필요합니다..

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Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgements

이 작품은 NIH PBS (R21 AI095484)에 의해 지원된다. 우리는 CD1D 량체를위한 NHI의 테트라 핵심 시설을 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Laminar flow hood  Baker Company, Inc Or equivalent equipment 
Centrifuge Beckman Coulter Or equivalent equipment 
Hemocytometer Electron Microscopy Sciences 63514-11
Atmosphere-controlled incubator Fisher Scientific  (37 °C with 5% CO2)
Analytical flow cytometer LSR II
RPMI 1640 Media Tech 10-040-CV
Collagenase D Roche 11088858001
Percoll  GE Healthcare 17-0891-01
Fetal bovine serum  Corning Cellgro 35-011-CV
0.1% sodium azide (NaN3) Sigma-Aldrich S2002
Buffer phosphate buffered saline (PBS) Corning Cellgro 21-040-CV
PBS 10x Mediatech 46-013-CM
EDTA buffer  Sigma-Aldrich E1161
LS columns  MiltenyiBiotec 130-042-401
CD45+ microbeads MiltenyiBiotec 6.78E-51
Biotin microbeads  MiltenyiBiotec 130-090-485
anti-CD45 (clone: 30-F11)  PerCP  eBioscience G1397
anti-CD45 (clone: 30-F11)  APC-Cy7 Biolegend 103116
anti-TCR Pacific Blue  (ab-chain, clone: H57-597) Invitrogen HM3628
anti-CD4 PE eBioscience 12-0043
anti-CD8 FITC eBioscience 8011-0087
anti-CD4 biotinylated (GK1.5) BD 553728
anti-CD8 biotinylated  (clone 53-6.7) BD 553029
anti-MHC class II (I-A b) biotinylated BD 553609
AutoMACS Running Buffer - MACS Separation Buffer  MIlteny I Biotec 130-091-221
C57BL/6J mice Jackson Labs 000664 Kidneys - Lymph Nodes
Petri dish  BD Biosciences 356517
70 μm filter  Fisher Scientific 22363548
Plunger  Or equivalent equipment 
GeneMate Tubes 50 ml Bioexpress C-3394-3 Or equivalent equipment 
GeneMate Tubes 15 ml Bioexpress C-3394-1 Or equivalent equipment 
CD1d α-galcer tetramer NHI

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References

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Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney
Posted by JoVE Editors on 02/10/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney.

There was an error with an author's name. The author's given name had a typo, this was corrected to:

Samatha Bandapelle

instead of:

Samantha Bandapelle

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