Isolering av Double Negative αβ T-celler från njure

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

ERRATUM NOTICE

Summary

DNabT celler är sällsynta bland perifera T-celler; Men, de är rikligt förekommande i vissa icke-lymfoida vävnader. Svårighet att isolera DN T-celler från icke-lymfatisk vävnad hindrar deras funktionella analyser trots ökande erkänd patofysiologiska betydelse. Vi beskriver en roman protokoll för isolering av höggradigt renade DN T-celler från mus njure.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Martina, M. N., Bandapalle, S., Rabb, H., Hamad, A. R. Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney. J. Vis. Exp. (87), e51192, doi:10.3791/51192 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Det finns idag inget standardprotokoll för isolering av DN T-celler från icke-lymfvävnad trots deras alltmer rapporterade engagemang i olika immunsvar. DN T-celler är en unik immun celltyp som har varit inblandad i regleringen av immun och autoimmuna svar och tolerans till allotransplants 1-6. DN T-celler är dock sällsynt i perifert blod och sekundära lymfoida organ (mjälte och lymfkörtlar), men är viktiga invånare i normal njure. Mycket lite är känt om deras patofysiologiska funktion 7 på grund av deras brist i periferin. Vi beskrev nyligen en omfattande fenotypiska och funktionsanalys av denna befolkning i njuren 8 i stabilt tillstånd och under ischemireperfusionsskada. Analys av cellfunktionen DN T kommer att förstärkas avsevärt genom att utveckla ett protokoll för deras isolering från njuren.

Här beskriver vi ett nytt protokoll som tillåter isolation av mycket rena ab CD4 + CD8 + T-celler och DN T-celler från mus njure. Kortfattat, smälta vi njurvävnad med hjälp av kollagenas och isolera njurmononukleära celler (KMNC) genom densitetsgradient. Detta följs av två steg för att berika hematopoietiska T-celler från 3% till 70% från KMNC. Det första steget består av en positiv selektion av hematopoietiska celler med användning av CD45 + isoleringskit. I det andra steget, är DN-T-celler negativt isoleras genom avlägsnande av icke-önskade celler med användning av CD4, CD8 och MHC klass Il-monoklonala antikroppar och CD1d α-GalCer tetramer. Denna strategi leder till en befolkning på mer än 90% ren DN T-celler. Ytfärgning med ovan nämnda antikroppar följt av FACS-analys används för att bekräfta renheten.

Introduction

Perifera αβTCR + CD3 + CD4 - CD8 - dubbel-negativ (DN) T-celler är uppdelade i olika undergrupper som besitter olika fenotyper och funktioner 1-4. DN T-celler är dåligt känd, men i allt högre grad inblandad i patofysiologiska immunsvar i olika sjukdomsmodeller 4-6.

DN T-celler är en unik immun celltyp som i allt högre grad är inblandad i regleringen av olika immun och autoimmuna reaktioner och moduleringen av allotransplantat tolerans. 4-6, 9 De är sällsynta i perifert blod och sekundära lymfoida organ (mjälte och lymfkörtlar ). Men de är stora bosatta i normala njurar och tarm epitel 10-12. Mycket lite är känt om deras funktion 7 i njuren i stabilt tillstånd och under patologiska tillstånd såsom akut njurskada (AKI) i samband med njur Transplmyra.

På grund av de invecklade roller olika immunceller i reglering av immunsvar, inklusive alloresponses, fastställa uppgifterna för varje spelare är avgörande för att förstå alloresponses och design av nya läkemedel. Med tanke på de betydande antal DN T-celler som finns i njuren under fysiologiska och olika sjukdomstillstånd, DN T-celler kommer sannolikt att spela en viktig roll i regleringen av immun och autoimmuna reaktioner hos möss och människor, och alloresponses hos transplantationspatienter. Ackumulerande men fortfarande spridda bevis blandar in DN T-celler i både patogena och immunosuppressiva funktioner, men det är dåligt förstått varför och hur de uppvisar en viss skadlig eller undertryckande funktion och hur miljön påverkar dem.

På grund av deras låga förekomst i njure, förbättrade metoder för isolering är nödvändiga.

Det finns idag inget standardprotokoll för isolering av DN T-celler från than icke-lymfoida vävnader. Vårt protokoll beskriver ett nytt förfarande för isolering av DN-T-celler från njure; emellertid kan förfarandet också användas för olika icke-lymfoida vävnader.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Beredning av instrument, Kultur Media och reagenser

  1. Instrument: Förbered reagenser under sterila förhållanden och använda under ett laminärt flöde huva.
  2. Bered en L RPMI vävnadsodlingsmedium, tillsätt 5% fetalt bovint serum, 2,1 g natriumbikarbonat, 10 ml glutamat 100x, 10 mg HEPES, 1 mg natriumpyruvat och 10 ml 100x penicillin / streptomycin.
    Anmärkning: den rekommenderade vävnadsodlingsmedium, RPMI, är utbytbara med DMEM.
  3. Bered 5% kollagenas "D"-lösning (5 ml kollagenas "D" till 9 ml av vävnadsodlingsmedium).
  4. Gör Percoll-lösning vid tre olika koncentrationer: 100%, 80% och 40%. Följande koncentrationer beräknas för ett prov. Håll lösningar vid rumstemperatur.
    1. Percoll lösning: tillsätt 9 ml outspädd PercoU (från stamlösning); lägg 1 ml PBS 10x.
    2. Percoll lösning: tillsätt 8 ml Percoll 100%; tillsätt 2 ml PBS 1x.
    3. Percoll lösning:tillsätt 4 ml Percoll 80%; tillsätt 4 ml PBS 1x.
  5. Gör ett L av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS)-buffert; Tillsätt 5 ml 10% BSA (0,1% BSA), 1 ml 10% natriumazid (0,1%), 2 ml EDTA-agent, fyll till 1000 ml med 1x PBS.

2. Beredning av Njure Digestion

  1. Efter att ha förvärvat nödvändiga institutionella godkännande, offra och exsanguinate mössen med standardmetoder och följa gällande regler och riktlinjer djurskötsel.
    1. Bedöva musen med pentobarbital (0,07 mg / kg).
    2. Gå vidare till avblodning.
    3. Placera musen i liggande ställning på ett operationsbord.
    4. Spraya buken med 70% etanol.
  2. Tillsätt 10 ml kollagenas D-lösning till petriskål.
  3. Avlägsna och decapsulate båda njurarna från varje mus.
    1. Öppna abdomimal hålrum genom att göra en mittlinjen snitt genom buken huden och bukhinnan från bröstbenet tillpubis.
    2. Exponera den vänstra njuren genom att flytta tarmarna i sidled åt höger.
    3. Separera försiktigt vänstra kapseln med pincett.
      Anm: Kapseln visas som ett transparent skikt som omger njuren och delvis täckt av perinephric fettvävnad.
    4. Ta bort den vänstra njuren genom att skära av pedicle kärlen med hjälp av en kirurgisk sax.
    5. Upprepa samma procedur för höger njure.
      Obs: Den högra njuren är mer kranial och närmare mittlinjen (pedicels är kortare).
  4. Placera njure in i petriskål.
  5. Skär njurvävnaden i små bitar (1-2 mm i storlek) med användning av en vanlig metallformningsbladet och placera bitarna in i kollagenaslösning för 30 till 45 min i inkubatorn vid 37 ° C (figur 1).

3. Beredning av Kidney mononukleära celler (KMNC) från Njure Digestion

  1. Erhålla en cellsuspension av njurenmatsmältning genom att mekaniskt störa vävnad med hjälp av en sil (70 um) och återsuspendera i 25 ml vävnadsodlingsmedium och blanda.
  2. Centrifugera vid 400 x g under 10 min vid 4 ° C för att pelletera cellsuspension.
  3. Återsuspendera pelleten i 4 ml 40% Percoll-lösning och försiktigt överlagra på 4 ml av 80% Percoll-lösning med en överförings plastpipett, mycket långsamt och försiktigt. Detta resulterar i två faser tydligt separerade av ett genomskinligt lager. På toppen kommer att vara ett gult skikt motsvarande de lipider.
  4. Centrifugera vid 1500 x g under 30 min vid rumstemperatur med centrifugen i bromsfrånläge.
  5. Ta bort genom aspiration de gula och tjockt toppskikt (ca 1-2 ml).
  6. Samla endast den obetydliga vitaktigt genomskinliga skiktet från gränsytan mellan de två faserna med en överföringspipett. Mycket försiktigt överföra denna suspension i en 15 ml koniskt rör som innehåller 2 ml vävnadsodlingsmedium och tillsätt sedan 13 ml medium för att göra en total volym på15 ml.
  7. Centrifugera vid 400 x g under 10 min vid 4 ° C.
  8. Återsuspendera proverna i 1 ml av mediet.
  9. Räkna antalet KMNC använda trypanblåttuteslutning på en hemocytometer och uttrycka resultatet som antalet KMNC per ml per njure.
  10. Tvätta en gång enligt ovan.

4. Isolering av Hematopoietic (CD45 +) Celler från KMNC (Steg I)

  1. Omsuspendera cellerna upp till 10 7 till 90 | il av rinnande buffert.
  2. Tillsätt 10 pl av CD45 mikropärlor och inkubera under 15 min vid 4 ° C.
  3. Tillsätt 1 ml löpbufferten för att stoppa reaktionen. Centrifugera vid 400 x g under 10 min vid 4 ° C och återsuspendera i 500 pl av rinnande buffert.
  4. Förbered magnetisk kolonn genom att placera på magneten och skölj med 3 ml av körningsbuffert.
  5. Passera cellsuspensionen genom den magnetiska kolonnen och samla in de omärkta celler som passerar genom kolonnen.
  6. Tvätta cellerna tre gånger med 3 ml av runnningsbuffert. Sedan samlar utflödet.
  7. Ta bort kolumnen från separatorn och pipett 5 ml löpande buffert på kolonnerna och spola ut den märkta fraktionen omedelbart. Denna fraktion innehåller CD45 +-celler. Räkna celler.
  8. För att beräkna absoluta antal olika T-celler undergrupper i njurar multiplicera det totala antalet KMNC av andelen positiva celler bestäms genom flödescytometri (figur 2).

5. Isolering av DN T cell från CD45 + Förberedelse genom negativ selektion (steg II)

  1. Tillsätt 2,5 | il (0,5 mg / ml, 1,25 | ig) av vardera av följande biotinylerade antikroppar: anti-CD4, anti-CD8, anti-Fc-receptor (CD16/32), anti-MHC klass II (IA b), anti- CD1d PBS-57 tetramer för varje 10 7 hematopoetiska celler.
  2. Inkubera cellerna under 30 minuter i kylrum.
  3. Lägg 1 ml anti-Biotin mikropärlor.
  4. Inkubera under 30 min i ett kallt rum.
  5. Placera röret i than magnet och fortsätt till utarmning.
  6. Räkna livskraftiga celler för att bestämma det totala antalet DN-T-celler i den negativa fraktionen genom att använda en hemocytometer.
  7. Kontrollera renhet DN T-celler med flödescytometri genom att följa denna gating strategi: första gate CD45 +, andra porten TCRαβ +. Uteslut CD1d + celler. Plot CD4 + vs CD8 ^ för att identifiera DN-T-celler (Figur 3).
  8. Multiplicera det totala antalet med procentsatsen bestämmes i renhet.
    OBS: Användning av detta protokoll resulterar i en befolkning på mer än 90% ren DN T-celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vild typ C57BL / 6 (B6) njure innehåller ca 1,5-2,1 x 10 6 mononukleära celler per njure. Ungefär mindre än 10% är hematopoetiska CD45 + celler. För framställningen av njure mononukleära celler (KMNC), är njurarna skars i små bitar såsom visas i fig 1 följt av digerering med användning av 5% kollagenas.

Detta följs av utförande av en densitetsgradientcentrifugering för att samla KMNC skikt (figur 2, vänster panel). KMNC utsattes sedan för positiv selektion med hjälp av CD45 + magnetiska mikrokulor som beskrivs i avsnitt 4 (STEG I). Kolumn bundna celler eluerades sedan och analyserades för CD45 + med FACS. Detta resulterar i anrikning av CD45 +-celler till cirka 80 till 95% såsom analyserades med flödescytometri (figur 2, mellersta panelen). Bland anrikade hematopoietiska CD45 +-celler, ungefär 40 till 60% var αβ TCR ^ (data ej visade), ca 30-60% var DN-T-celler (figur 2, höger panel).

Det sista steget involverade utsätta berikade CD45 + celler till negativa urval att märka och ta bort CD4 +, CD8 +, MHC klass II + och CD16/32 +-celler med hjälp av biotin specifika mAbs och anti-biotin mikropärlor och magnetiska kolumner. Detta resulterar i höggradigt renat (90-95%) DN-T-celler (Figur 3). Efter detta protokoll var det möjligt att få upp till 0,5 x 10 6 hematopoetisk CD45 + magnetiskt märkta celler per mus (båda njurarna).

Figur 1
Figur 1. Framställning av njuren för digerering med 5% kollagenaslösning. Musen njure skärs i små bitar av 1-2 mm och placerades i kollagenas D 5% lösning i 30 min för att grävaestion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
. Figur 2 Strategi för anrikning av CD45 + hematopoetiska celler från Njure vänster:.. CD45 färgning av njure MNC före berikning med CD45 + kit med positiv selektion Center: CD45 färgning av njure MNC efter berikning med CD45 + kit med positiv selektion Höger.: CD4 och CD8 profil αβTCR + celler bland gated CD45 + celler olika undergrupper av T-celler. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3
. Figur 3 Renhet av isolerade DN T-celler vänster:. CD45 färgning av isolerade njur DN T-celler genom negativ selektion Center:.. TCRαβ färgning av isolerade njur DN T-celler genom negativ selektion Höger: CD4 och CD8 färgning bland isolerade DN T-celler från negativt urval. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4
Figur 4. Lymfocyter i njuren innan rening. höger:.. CD45 färgning i njurvävnad innan rening Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det finns ett ökat intresse för DN T-celler eftersom de håller på att blandas in i olika patologiska tillstånd såsom autoimmuna sjukdomar, cancer, graft tolerans, och primära sjukdomar i njure inklusive akut njurskada (AKI), glomerulonefrit 8, 13. Därför finns det behov av att bättre förstå och karaktärisera de patofysiologiska funktioner DN T-celler. Men för närvarande finns det en brist på förståelse för dessa cellers funktion jämfört med CD4-och CD8-T-celler. En viktig orsak är brist på DN T-celler i sekundära lymfoida organ och därmed svårigheter att få tillräckligt med celler för in vitro-analys och adoptiv överföringsförsök. DN T-celler är i huvudsak belägna i icke-lymfoida vävnader såsom njuren 8 men bristen på tillförlitliga metoder för deras isolering från organ hindrar ansträngningarna att undersöka deras funktion. Därför är vår nya protokoll för isolering av DN T-cellar från njuren förväntas påskynda forskning om funktionen av DN-T-celler. DN-T-celler ansamlas i lymfkörtlar i stort antal i Fas-deficient (LPR) eller FasL deficient (GLD)-möss, och de kan lätt isoleras från lymfoida organ 9, 14, 15, men den är fortfarande en utmaning att isolera dessa celler från andra vävnader.

Enligt detta protokoll, njurar från två möss ger ungefär 0,5 x 10 6 hematopoetiska celler (CD45 +) och cirka 0,2 x 10 6 DN T-celler. Detta antal är tillräckligt för att utföra in vitro-kultur, funktionella analyser och / eller FACS-analys. Renheten av DN-T-cellpopulationen måste bekräftas med flödescytometri. Detta protokoll ger en befolkning på DN T-celler som kan vara så ren som 98%. Även om detta protokoll är avsedd för isolering av DN T-celler från njuren, kan den modifieras för isolering av T-celler från andra icke-lymfoida organ såsom som hjärta, sköldkörtel etc.

Eftersom DN T-celler utgör en liten befolkning, är det ibland nödvändigt att öka avkastningen genom att utföra ytterligare omgångar av rening. Men om ett högre antal DN T-celler krävs (högre än 0,5 x 10 6 celler) rekommenderar vi att utföra sorterings separation för att minska tid och reagenskostnad.

Sammanfattningsvis beskriver detta protokoll ett nytt förfarande för isolering av DN-T-celler från njure. Den består av en beredning (via matsmältningen och anrikning av KMNC) steg följt av positiv selektion och negativ selektion med avseende på förbrukning av icke-önskvärda cellpopulationer. Därför föreligger minimal direkt manipulering av DN-T-celler under isoleringsprocessen. Det bör noteras att det finns existerande protokoll för isolering av DN-T-celler från perifert blod i möss och människor och från sekundära lymfoida organ, liknande dem som används för isolering av konventionella T-celler.

ove_content "> Eftersom det har visat sig att vissa DN T-celler uttrycker FcR-γ, är ett alternativ att inte inkludera CD16/32 + i cocktail 16, 17. Framgångsrik isolering av DN T-celler kräver stor uppmärksamhet på detaljer. Särskilt viktigt stegen är: vävnad matsmältning, kapning av njurvävnaden i små bitar, och korrekt identifiera och samla in ljus lager i densitetsgradienten Sammantaget är flera omgångar av praktik och en del fingerfärdighet krävs för att uppnå önskat resultat..

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgements

Detta arbete stöds av NIH PBS (K21 AI095484). Vi tackar NHI tetramer core facilitet för CD1d tetramer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Laminar flow hood  Baker Company, Inc Or equivalent equipment 
Centrifuge Beckman Coulter Or equivalent equipment 
Hemocytometer Electron Microscopy Sciences 63514-11
Atmosphere-controlled incubator Fisher Scientific  (37 °C with 5% CO2)
Analytical flow cytometer LSR II
RPMI 1640 Media Tech 10-040-CV
Collagenase D Roche 11088858001
Percoll  GE Healthcare 17-0891-01
Fetal bovine serum  Corning Cellgro 35-011-CV
0.1% sodium azide (NaN3) Sigma-Aldrich S2002
Buffer phosphate buffered saline (PBS) Corning Cellgro 21-040-CV
PBS 10x Mediatech 46-013-CM
EDTA buffer  Sigma-Aldrich E1161
LS columns  MiltenyiBiotec 130-042-401
CD45+ microbeads MiltenyiBiotec 6.78E-51
Biotin microbeads  MiltenyiBiotec 130-090-485
anti-CD45 (clone: 30-F11)  PerCP  eBioscience G1397
anti-CD45 (clone: 30-F11)  APC-Cy7 Biolegend 103116
anti-TCR Pacific Blue  (ab-chain, clone: H57-597) Invitrogen HM3628
anti-CD4 PE eBioscience 12-0043
anti-CD8 FITC eBioscience 8011-0087
anti-CD4 biotinylated (GK1.5) BD 553728
anti-CD8 biotinylated  (clone 53-6.7) BD 553029
anti-MHC class II (I-A b) biotinylated BD 553609
AutoMACS Running Buffer - MACS Separation Buffer  MIlteny I Biotec 130-091-221
C57BL/6J mice Jackson Labs 000664 Kidneys - Lymph Nodes
Petri dish  BD Biosciences 356517
70 μm filter  Fisher Scientific 22363548
Plunger  Or equivalent equipment 
GeneMate Tubes 50 ml Bioexpress C-3394-3 Or equivalent equipment 
GeneMate Tubes 15 ml Bioexpress C-3394-1 Or equivalent equipment 
CD1d α-galcer tetramer NHI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, Z. X., Yang, L., Young, K. J., DuTemple, B., Zhang, L. Identification of a previously unknown antigen-specific regulatory T cell and its mechanism of suppression. Nat Med. 6, 782-789 (2000).
  2. Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, Z., Ohashi, P. S., Zhang, L. The immune regulatory function of lymphoproliferative double negative T cells in vitro and in vivo. J Exp Med. 196, 261-267 (2002).
  3. Ford McIntyre, M. S., Young, K. J., Gao, J., Joe, B., Zhang, L. Cutting edge: in vivo trogocytosis as a mechanism of double negative regulatory T cell-mediated antigen-specific suppression. J Immunol. 181, 2271-2275 (2008).
  4. Young, K. J., Yang, L., Phillips, M. J., Zhang, L. Donor-lymphocyte infusion induces transplantation tolerance by activating systemic and graft-infiltrating double-negative regulatory T cells. Blood. 100, 3408-3414 (2002).
  5. Chen, W., Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, L. Infusion of in vitro-generated DN T regulatory cells induces permanent cardiac allograft survival in mice. Transplant Proc. 35, 2479-2480 (2003).
  6. Young, K. J., DuTemple, B., Phillips, M. J., Zhang, L. Inhibition of graft-versus-host disease by double-negative regulatory T cells. J Immunol. 171, 134-141 (2003).
  7. Mohamood, A. S., et al. Gld mutation of Fas ligand increases the frequency and up-regulates cell survival genes in CD25+CD4+ TR cells. Int Immunol. 18, 1265-1277 (2006).
  8. Ascon, D. B., et al. Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire. J Leukoc Biol. 84, 1400-1409 (2008).
  9. Hamad, A. R., et al. B220+ double-negative T cells suppress polyclonal T cell activation by a Fas-independent mechanism that involves inhibition of IL-2 production. J Immunol. 171, 2421-2426 (2003).
  10. Rabb, H., et al. Pathophysiological role of T lymphocytes in renal ischemia-reperfusion injury in mice. Am J Physiol-Renal. 279, 525-531 (2000).
  11. Burne, M. J., et al. Identification of the CD4(+) T cell as a major pathogenic factor in ischemic acute renal failure. J Clin Invest. 108, 1283-1290 (2001).
  12. Yokota, N., Daniels, F., Crosson, J., Rabb, H. Protective effect of T cell depletion in murine renal ischemia-reperfusion injury. Transplantation. 74, 759-763 (2002).
  13. Crispin, J. C., et al. Expanded double negative T cells in patients with systemic lupus erythematosus produce IL-17 and infiltrate the kidneys. J Immunol. 181, 8761-8766 (2008).
  14. Igarashi, S., Takiguchi, M., Kariyone, A., Kano, K. Phenotypic and functional analyses on T-cell subsets in lymph nodes of MRL/Mp-lpr/lpr mice. Int Arch Allergy Appl Immunol. 86, 249-255 (1988).
  15. Dowdell, K. C., et al. Somatic FAS mutations are common in patients with genetically undefined autoimmune lymphoproliferative syndrome. Blood. 115, 5164-5169 (2010).
  16. Juvet, S. C., et al. FcRgamma promotes T cell apoptosis in Fas-deficient mice. J Autoimmun. 42, 80-93 (2013).
  17. Thomson, C. W., et al. FcR gamma presence in TCR complex of double-negative T cells is critical for their regulatory function. J Immunol. 177, 2250-2257 (2006).

Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney
Posted by JoVE Editors on 02/10/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney.

There was an error with an author's name. The author's given name had a typo, this was corrected to:

Samatha Bandapelle

instead of:

Samantha Bandapelle

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics