संयुक्त डीएनए शाही सेना फ्लोरिसेंट

Biology

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Summary

सीटू संकरण (मछली) में फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के भीतर उनके पैतृक वातावरण में न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने के लिए अनुमति देता है. हम यहाँ माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं में एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जो मछली के माध्यम से शाही सेना और डीएनए के संयुक्त, एक साथ पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन.

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Barakat, T. S., Gribnau, J. Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (88), e51628, doi:10.3791/51628 (2014).

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Abstract

सीटू संकरण (मछली) में फ्लोरोसेंट कोशिकाओं में न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने में सक्षम बनाता है, जो एक आणविक तकनीक है. डीएनए मछली अक्सर कोशिकाजननप्रकरण और कैंसर निदान में प्रयोग किया जाता है, और अक्सर महत्वपूर्ण नैदानिक ​​निहितार्थ हैं जो जीनोम के aberrations पता लगा सकते हैं. शाही सेना मछली कोशिकाओं में शाही सेना अणु का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और जीन अभिव्यक्ति के नियमन में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की है. डीएनए मछली के लिए उपयुक्त स्थितियां नाजुक, एकल असहाय शाही सेना अणु के लिए भी कठोर हो सकता है के रूप में एक ही कोशिका के भीतर डीएनए और आरएनए मछली का मेल है, तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है. हम यहाँ एक्स क्रोमोसोम द्वारा इनकोडिंग Xist आरएनए और डीएनए के संयुक्त, एक साथ पता लगाने में सक्षम बनाता है, जो एक आसानी से लागू प्रोटोकॉल उपस्थित थे. इस संयुक्त डीएनए शाही सेना मछली प्रोटोकॉल संभावना आरएनए और डीएनए दोनों का पता लगाया जा करने की जरूरत है, जहां अन्य प्रणालियों के लिए लागू किया जा सकता है.

Introduction

सीटू संकरण (मछली) में फ्लोरोसेंट के माध्यम से कोशिकाओं और ऊतकों का अध्ययन कर 1970 के दशक 1 में अपनी शुरुआत के बाद से, शोधकर्ताओं subcellular स्तर पर जीनों chromatin संगठन और जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करने की अनुमति दी है. डीएनए मछली अक्सर कोशिकाजननप्रकरण, karyotyping 2, कैंसर निदान 3 और पूर्व आरोपण आनुवंशिक स्क्रीनिंग 4 में प्रयोग किया जाता है, और यह उनके पैतृक वातावरण में न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने के लिए अनुमति देता है के बाद से आणविक अनुसंधान 5-6 करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका है. शाही सेना मछली द्वारा एकल कक्ष अभिव्यक्ति विश्लेषण देशी प्राथमिक टेप का पता लगा सकते हैं और noncoding RNAs क्रोमोसोम से लिखित जा रहा है, और उदाहरण के लिए सहित एक जनसंख्या स्तर पर जीन अभिव्यक्ति का आकलन जो अन्य तकनीकों, के लिए लाभ प्रदान करता है मात्रात्मक RT-पीसीआर, जीनोम चौड़ा अभिव्यक्ति विश्लेषण या उत्तरी सोख्ता . मूल के उनके साइटों से सीधे होने वाले शाही सेना टेप visualizing करके, यह उदाहरण के लिए कर दिया गया हैजीन अभिव्यक्ति स्टोकेस्टिक 7 है, और कभी कभी 8 एलील विशिष्ट किया जा सकता है देखा. तकनीक में सुधार भी कोशिकाओं 9-11 भीतर ही mRNA अणुओं का पता लगाने और मात्रा का ठहराव की अनुमति दी है.

मछली के बुनियादी सिद्धांत अति विशिष्ट वाटसन और क्रिक आधार बाँधना के माध्यम से एक न्यूक्लिक एसिड जांच करने के लिए सेल के भीतर न्यूक्लिक एसिड के संकरण के होते हैं. जांच या तो सीधे या परोक्ष रूप से पता लगाया, microscopically देखे जा सकते हैं, जो एक संकेत के परिणामस्वरूप हो सकता है. आरंभिक प्रयास सुरक्षा मुद्दों, सीमित स्थानिक संकल्प और एक समय 12-14 में केवल एक ही लक्ष्य का पता लगाने की क्षमता के आधार पर कमियां थी जो radioactively लेबल जांच, शामिल थे. fluorochromes, haptens, और एंजाइमों सहित nonradioactive लेबल, के बाद के विकास, एक नियमित आणविक जीव विज्ञान तकनीक के रूप में मछली के व्यापक प्रसार के उपयोग की अनुमति दी है. मछली जांच या तो सीधे fluoroch के साथ लेबल किया जा सकता हैएसिड न्यूक्लिक को फ्लोरोसेंट अणु की रासायनिक लिंक के द्वारा Romes 15 और fluorescently लेबल nucleotides 16-19, या जांच परोक्ष रूप से (बायोटिन और digoxigenin सहित) haptens के एकीकरण और संयुग्मित hapten विशिष्ट एंटीबॉडी द्वारा haptens की प्रतिरक्षा पता लगाने के बाद देखे जा सकते हैं के एकीकरण के दृश्यों फ्लोरोसेंट संवाददाता 20-21 अणुओं. उत्तरार्द्ध दृष्टिकोण मूल संकेत बढ़ाने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं जो fluorescently लेबल एंटीबॉडी के कई परतों का उपयोग करके संकेत प्रवर्धन की अनुमति देता है, और कम स्तर पर व्यक्त कर रहे हैं जो शाही सेना प्रजातियों का पता लगाने में सक्षम बनाता है. प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष लेबलिंग तकनीक और विभिन्न haptens के संयोजन से, कई लक्ष्यों को एक साथ एक ही कक्ष में देखे जा सकते हैं.

मछली प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदमों में से एक अपने लक्ष्य को जांच के संकरण है. सिद्धांत रूप में, एक जांच विशेष रूप से व्यवहार में, अपने लक्ष्य के लिए ही बाध्य होगा हालांकि, इस विशिष्टताजांच मुताबिक़ क्षेत्रों के लिए बाध्य कर सकते हैं, हमेशा नहीं हासिल की है, और संकरण स्थितियां हमेशा एक निश्चित डीएनए क्षेत्र या शाही सेना प्रजातियों के लिए आदर्श नहीं होगा है. वे मछली प्रक्रिया की तंगी को बढ़ा सकते हैं, और पृष्ठभूमि शोर के एक उच्च स्तर पर नतीजा होगा मछली जो जांच की अविशिष्ट बंधन रोका जा सकता है जैसे बाद संकरण washes, इसलिए विशेष महत्व के हैं. शाही सेना अणु भी फंसे हैं के रूप में वे आसानी से एक मछली जांच संकरित किया जा सकता है. इसके विपरीत, डबल असहाय डीएनए अणु पहले एक जांच संकरण कर सकते हैं, जिसके बाद एक विकृतीकरण कदम, जरूरत है. यह आमतौर पर डीएनए का विकृतीकरण में जो परिणाम का नमूना हीटिंग, द्वारा हासिल की है. हालांकि, इन कठोर परिस्थितियों में, कमजोर, एकल असहाय आरएनए अणुओं लुप्त हो सकती हैं. इसलिए, संयुक्त डीएनए शाही सेना मछली की स्थिति का महत्वपूर्ण अनुकूलन की आवश्यकता है, और केवल शाही सेना या डीएनए की अलग पता लगाने की तुलना में अधिक तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है.

यहाँ हम presenप्रादेशिक सेना में विस्तृत हमें महिला माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं 22-24 फर्क में एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता (XCI) का अध्ययन करने के लिए अनुमति दी गई है, जो संयुक्त, एक साथ डीएनए शाही सेना मछली के प्रोटोकॉल. XCI एक महत्वपूर्ण epigenetic महिला भ्रूण विकास के 25 के लिए तंत्र, और heterochromatinization में परिणाम है और इसलिए महिला व्यक्तियों 26-27 में दो एक्स क्रोमोसोम में से एक का मुंह बंद. इस प्रक्रिया के लिए आवश्यक RNF12 22-23 और REX1 24 प्रोटीन द्वारा नियंत्रित किया जाता है, जो noncoding शाही सेना Xist 28-30, है. Xist अभिव्यक्ति भ्रूण के विकास के दौरान या इन विट्रो में ES सेल भेदभाव पर भविष्य निष्क्रिय एक्स गुणसूत्र (ग्यारहवीं) पर upregulated हो जाता है , और एक्स गुणसूत्र के साथ फैला है और जिससे एक्स गुणसूत्र 31 के transcriptional शटडाउन में जो परिणाम chromatin remodeling एंजाइमों को आकर्षित कर सकते हैं. इस Xist शाही सेना के प्रसार एक्स chromo की एक परत के रूप में शाही सेना मछली से देखे जा सकते हैंकुछ भी एक Xist बादल के रूप में भेजा है. महिला ES कोशिकाओं जीनोमिक अस्थिरता की वजह से उनके एक्स गुणसूत्रों में से एक को खो सकते हैं, और हम दूसरों को यकीन ही karyotypically स्थिर कोशिकाओं को इस महत्वपूर्ण प्रक्रिया 22,32 के विश्लेषण में मूल्यांकन कर रहे हैं कि बनाने के लिए, XCI का अध्ययन करने के लिए संयुक्त डीएनए शाही सेना मछली कार्यरत है -34. हर आणविक जीव विज्ञान तकनीक के साथ के रूप में, कई अलग उत्कृष्ट प्रोटोकॉल 35-38 प्रकाशित किया गया है. यहाँ हम अनुमति देने के लिए माउस ES कोशिकाओं, कोशिकाओं का निर्धारण, निक अनुवाद, तय कोशिकाओं के पूर्व उपचार द्वारा मछली जांच की लेबलिंग में भेदभाव के शामिल होने से शुरू, हमारे विधि प्रस्तुत permeabilization और बाद में जांच तेज, जांच के संकरण लक्ष्य, और अंत में fluorescently लेबल एंटीबॉडी द्वारा जांच का पता लगाने. इस के साथ साथ प्रस्तुत प्रोटोकॉल Xist शाही सेना के वफादार का पता लगाने और दो ​​दिन की अवधि के भीतर एक्स गुणसूत्र की अनुमति देता है, और इस तकनीक की मूल बातें संभावना ओ.टी. के लिए अनुकूलित किया जा सकता हैउसकी व्यवस्था और अनुसंधान के क्षेत्रों में.

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Protocol

1. स्त्री भ्रूण स्टेम कोशिकाओं में भेदभाव की प्रेरण एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता प्रेरित करने के लिए

नोट: महिला माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं (अनुरोध पर उपलब्ध) माउस भ्रूणीय fibroblasts (MEFs) के साथ लेपित gelatinized संस्कृति व्यंजन पर मानक ES सेल परिस्थितियों में बड़े हो रहे हैं. हम यहाँ पाठक मानक सेल कल्चर तकनीक 39-41 से परिचित है कि मान. भेदभाव प्रेरित करने के लिए, T25 बर्तन में उगाए ES कोशिकाओं MEFs से अलग हो जाएगा, और भेदभाव मध्यम में चढ़ाया जाएगा.

  1. ES सेल संस्कृति से ते मध्यम निकालें, और सेल संस्कृति पीबीएस के साथ दो बार धोने.
  2. 1.5 मिलीलीटर trypsin EDTA (37 डिग्री सेल्सियस पूर्व गर्म) जोड़ें, और 7 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते हैं. 3.5 मिनट के बाद, कालोनियों को तोड़ने के लिए धीरे पकवान हिला.
  3. कोशिकाओं को भेदभाव माध्यम की 3.5 मिलीलीटर जोड़कर trypsin-EDTA निष्क्रिय. पिपेट कोशिकाओं ऊपर और नीचे एक एकल कोशिका समाधान प्राप्त, और इकट्ठा करने के लिएएक 15 मिलीलीटर ट्यूब में. 200 XG पर 5 मिनट के लिए स्पिन, और भेदभाव माध्यम के 10 एमएल में कोशिकाओं को इकट्ठा.
  4. एक गैर gelatinized संस्कृति डिश के लिए सेल निलंबन जोड़ें, और एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 1 घंटे के लिए सेते हैं. नोट: ES कोशिकाओं निलंबन में रहेगा जबकि MEFs, गैर gelatinized संस्कृति डिश का पालन करने में सक्षम हो जाएगा.
  5. इस बीच, 6 अच्छी तरह प्लेटें को निष्फल कांच coverslips (24 x 24 मिमी) जोड़ने के 0.2% जिलेटिन जोड़ने, और कमरे के तापमान पर कम से कम 5 मिनट के लिए सेते हैं.
  6. 1 घंटा बाद, मुख्य रूप से गैर पालन ES कोशिकाओं से मिलकर बनता है, जो पूर्व चढ़ाया ES सेल संस्कृति की सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा. Coverslips युक्त 6 अच्छी तरह प्लेटें प्लेट ES कोशिकाओं. नोट: उपयोग ⅙ 6 अच्छी तरह से थाली के 6 कुओं के लिए एक मिला हुआ T25 पकवान वें. यह अच्छी तरह से भेदभाव के 3 दिन बाद मिला हुआ भेदभाव की अनुमति देगा. एक दैनिक आधार पर मध्यम बदलें. अब भेदभाव समय पाठ्यक्रम, बैक्टीरियल व्यंजन में भेदभाव मध्यम में थाली पूर्व मढ़वाया ES कोशिकाओं, और incub लिएसेल कल्चर इनक्यूबेटर में एकीकृत एक सेल प्रकार के बरतन पर खा लिया. यह कोशिकाओं को 1-2 दिन पूर्व निर्धारण के लिए coverslips को चढ़ाया जा सकता है जो embryoid निकायों, फार्म करने के लिए अनुमति देगा.

बाद में डीएनए शाही सेना मछली विश्लेषण के लिए विभेदित ES कोशिकाओं के 2. फिक्सेशन

  1. भेदभाव संस्कृतियों से भेदभाव मध्यम निकालें, और सेल संस्कृति पीबीएस के साथ दो बार धोने. नोट: कोशिकाओं दूर धोया जा रहा रोकने के लिए ध्यान से पीबीएस जोड़ें.
  2. सेल संस्कृति पीबीएस निकालें और 4% paraformaldehyde (पीएफए) / पीबीएस जोड़कर कोशिकाओं को ठीक करने, और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं. चेतावनी: पीएफए ​​विषैला होता है और साँस या जब त्वचा या आंखों के लिए संपर्क में किया जा रहा है जब महत्वपूर्ण स्वास्थ्य जोखिम पैदा कर सकता है. इसके अलावा, पीएफए ​​कैंसर है.
  3. 4% पीएफए ​​/ पीबीएस निकालें, और 70% इथेनॉल के साथ coverslips 3x धो लो. नोट: पीएफए ​​के किसी भी ट्रेस बाद मछली कदम के साथ हस्तक्षेप करेगा के रूप में सही धोने, महत्वपूर्ण है. Coverslips पूर्व एफ के लिए कई महीनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर 70% इथेनॉल में संग्रहित किया जा सकता हैISH विश्लेषण.

मछली प्रयोगों के लिए डीएनए जांच की 3. लेबल

नोट: ब्याज की जीन (न्यूनतम लंबाई> आरएनए मछली, या> डीएनए मछली के लिए 20 केबी के लिए 2 केबी), या हित के जीन को कवर एक बीएसी की एक डीएनए टुकड़ा प्राप्त करते हैं. सबसे अधिक संभावना प्रतिलेखन एक साथ पाया जा सकता है जो कई टेप में परिणाम होगा क्योंकि आरएनए का पता लगाने के लिए, एक छोटे जांच, डीएनए का पता लगाने की तुलना में पर्याप्त हो सकता है. एक प्रति डीएनए किनारा पर एक मजबूत संकेत के लिए, एक लंबी जांच शामिल haptens के लिए पर्याप्त संख्या का पता लगाने में सक्षम होने के लिए आवश्यक है. अधिमानतः, एक गैर लिखित जीनोमिक क्षेत्र डीएनए जांच के डिजाइन करने के लिए चुना है. आरएनए का पता लगाने के लिए एक जांच छोटे का उपयोग करते समय इसके अलावा, यह इस पूरी तरह से बाहर नहीं किया जा सकता है, हालांकि शाही सेना लिखित है जहाँ से जीनोमिक loci, संयुक्त डीएनए शाही सेना मछली दृष्टिकोण में पता लगाया जा रहा है कि नहीं रोका जायेगा. माउस Xist का पता लगाने के लिए, एक 5.5 केबी सीडीएनए जांच इस्तेमाल किया गया था. डेट के लिएएक्स गुणसूत्र के ection, कई बीएसी जांच में इस्तेमाल किया जा सकता है. अच्छे परिणाम Xist लोकस के पास स्थित हैं जो बीएसी RP23-100E1 और बीएसी CT7-474E4, का एक मिश्रण के साथ प्राप्त किया गया है. ब्याज की जीन या गुणसूत्र पर निर्भर करता है, कई अलग अलग जांच इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो सकता है. , आरएनए मछली के लिए उपयोग किया जाएगा जो सामग्री के साथ काम कर रहे एक स्वच्छ वातावरण में बाँझ फिल्टर टिप्स, RNase मुक्त एच 2 हे, और काम का उपयोग जब भी.

  1. डीएनए की 1 ग्राम लो और 16 μl की कुल मात्रा में एच 2 ओ में पतला. , 4 digoxigenin के μl या बायोटिन लेबलिंग समाधान (अभिकर्मकों देखें) जोड़ें vortexing द्वारा मिश्रण और 90 मिनट के लिए 16 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. नोट: बायोटिन या digoxigenin लेबल nucleotides अब निक अनुवाद द्वारा शामिल किया जाएगा.
  2. इस बीच, गैर एकीकृत न्यूक्लियोटाइड दूर करने के लिए G50 कॉलम तैयार करते हैं. , एक 2 मिलीलीटर सिरिंज ले लो Stamper हटाने, और सिरिंज में निष्फल कपास जोड़ें. समाधान टी में G50 गेंदों जोड़ेंओ 1 मिनट के लिए 642 XG पर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब और अपकेंद्रित्र में सिरिंज जगह, सिरिंज भरें. नोट: सिरिंज का लगभग 80% अब G50 से भरा जाना चाहिए. कम G50 मौजूद है जब दोहराएँ.
  3. 90 मिनट के बाद, निक अनुवाद प्रतिक्रिया मिश्रण करने के लिए एच 2 ओ के 40 μl जोड़ने, और G50 स्तंभ की प्रतिक्रिया जोड़ें. स्तंभ के तहत एक खाली ट्यूब जोड़ें, और 2 मिनट के लिए 642 XG पर अपकेंद्रित्र. एक प्रतिक्रिया ट्यूब में के माध्यम से प्रवाह लीजिए.
  4. एक विंदुक के साथ के माध्यम से प्रवाह की मात्रा को मापने, और 200 μl की कुल मात्रा तक पहुँचने के लिए एच 2 हे जोड़ें. 13.3 μl सामन शुक्राणु डीएनए (10 मिलीग्राम / एमएल), 13.3 μl खमीर tRNA (10 मिलीग्राम / एमएल), 26.7 μl माउस खटिया -1 डीएनए (1 मिलीग्राम / एमएल) और 28 μl 2 एम एनएएसी, पीएच जोड़कर माध्यम से प्रवाह वेग 5.6. Vortexing द्वारा मिक्स, और 533 μl बर्फ ठंड 100% इथेनॉल जोड़ें. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 16,200 XG पर ट्यूब, और अपकेंद्रित्र हिला
  5. सतह पर तैरनेवाला निकालें, और 70% इथेनॉल के साथ दो बार गोली धोने. 5 मिनट में के लिए 16,200 XG पर अपकेंद्रित्र4 डिग्री सेल्सियस, और हवा गोली सूखी. 50 + संकरण समाधान के 50 μl जोड़ें, और भंग की सुविधा के लिए 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. नोट: लेबल जांच -20 डिग्री सेल्सियस पर कई वर्षों के लिए भंडारित किया जा सकता है चेतावनी: 50 + संकरण समाधान, विषाक्त है त्वचा, आंखों और श्वसन प्रणाली में जलन पैदा कर सकते हैं, और यह भी एक अपरूपजनन है जो formamide, शामिल हैं.

4. Permeabilization, संयुक्त डीएनए शाही सेना मछली के लिए तय कोशिकाओं के पूर्व उपचार और संकरण

  1. 70% इथेनॉल और 6 अच्छी तरह प्लेटें सेल संस्कृति पीबीएस के अलावा निकाल कर, coverslips पर तय कोशिकाओं rehydrate. 5 मिनट के लिए सेते हैं. कुल तीन बार में दोहराएँ.
  2. सेल संस्कृति पीबीएस निकालें, और कोशिकाओं permeabilize करने के लिए, 6 अच्छी तरह प्लेटें को 0.2% पेप्सिन जोड़ें. 4 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में 6 अच्छी तरह प्लेटें सेते हैं. पेप्सिन निकालें, और RNase मुक्त एच 2 ओ के साथ निष्क्रिय
  3. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 4% पीएफए ​​/ पीबीएस के साथ incubating द्वारा पोस्ट तय कोशिकाओं. Fixati बादपर, 5 मिनट के लिए सेल संस्कृति पीबीएस के साथ दो बार धोने.
  4. 3 मिनट, 3 मिनट के लिए 3 मिनट और 100% इथेनॉल के लिए 90% इथेनॉल के लिए 70% इथेनॉल के साथ incubating द्वारा कोशिकाओं निर्जलीकरण. स्थानांतरण 6 अच्छी तरह प्लेटें से बाहर coverslips, और कई मिनट के लिए शुष्क हवा coverslips.
  5. एक गर्मी की थाली पर 1 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर coverslips incubating द्वारा आयु कोशिकाओं.
  6. विश्लेषण किया जा करने के लिए हर coverslip के लिए एक साथ जोड़कर माउस खटिया -1 डीएनए के साथ मछली जांच पूर्व संकरण, 50 + संकरण समाधान, 0.5 μl माउस खटिया -1 डीएनए, बायोटिन लेबल Xist जांच की 1 μl और digoxigenin के 1 μl के 25 μl एक्स गुणसूत्र का पता लगाने के लेबल बीएसी जांच. Vortexing द्वारा मिक्स, और 5 मिनट के लिए 99 डिग्री सेल्सियस पर denature. खटिया -1 डीएनए जांच में मौजूद दृश्यों को दोहराने के लिए संकरण करने की अनुमति के लिए, 45 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर तुरंत सेते हैं.
  7. उम्र बढ़ने के बाद, एक गिलास स्लाइड पर (SSC/10 मिमी फॉस्फेट बफर formamide/2x 70% से मिलकर) विकृतीकरण बफर के 50 μl जगह है, और कोशिकाओं towar का सामना करना पड़ के साथ शीर्ष पर coverslips डालविकृतीकरण बफर डी एस. 2 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  8. 5 मिनट के लिए बर्फ ठंड 70% इथेनॉल में incubating द्वारा वापस 6 अच्छी तरह प्लेटें coverslips, और बाद तय कोशिकाओं जोड़ें.
  9. 3 मिनट, 3 मिनट के लिए 3 मिनट और 100% इथेनॉल के लिए 90% इथेनॉल के लिए 70% इथेनॉल में बाद में ऊष्मायन द्वारा कोशिकाओं निर्जलीकरण. 6 अच्छी तरह प्लेटें से coverslips निकालें, और कई मिनट के लिए शुष्क हवा हैं.
  10. एक गिलास स्लाइड पर पूर्व संकरित जांच जगह है, और शीर्ष पर coverslip सेते हैं. जगह एसएससी formamide/2x 50 मिलीलीटर 50% से भरा एक humidified कक्ष में स्लाइड, और 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते

5. बाद संकरण Washes और जांच के एंटीबॉडी मध्यस्थता जांच

  1. 2x एसएससी के साथ 6 अच्छी तरह प्लेटें भरें, और पूर्व गर्म 42 डिग्री सेल्सियस तक रात ऊष्मायन के बाद coverslips जोड़ें, और 5 मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  2. 2x एसएससी निकालें, और 42 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 50% formamide/2x एसएससी के साथ coverslips सेते कुल 3 बार (पूरी तरह धोने के 30 मिनट) में दोहराएँ. एसएससी formamide/2x 50% निकालें, और कमरे के तापमान पर 2 एक्स 5 मिनट के लिए Tris-खारा के बीच (TST) के साथ स्लाइड्स धो लो.
  3. स्पॉट 50 μl नई गिलास स्लाइड पर coverslip प्रति Tris-खारा बीएसए (TSBSA), और एक TST-humidified अंधेरे कक्ष में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के दौरान रोकने के लिए उल्टा coverslips सेते हैं.
  4. स्थानांतरण वापस 6 अच्छी तरह प्लेटें coverslips, और TST के साथ 2 एक्स 5 मिनट धो लो.
  5. स्पॉट 50 नए गिलास स्लाइड पर coverslip प्रति भेड़ विरोधी खुदाई एंटीबॉडी (TSBSA में 1:500) के μl, और एक TST-humidified अंधेरे कक्ष में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के दौरान पहली ऊष्मायन कदम के लिए coverslips सेते उलटा.
  6. स्थानांतरण वापस 6 अच्छी तरह प्लेटें coverslips, और TST के साथ 2 एक्स 5 मिनट धो लो.
  7. स्पॉट 50 नए गिलास स्लाइड पर coverslip प्रति FITC (TSBSA में 1:250) के साथ संयुग्मित खरगोश विरोधी भेड़ एंटीबॉडी के μl, और एक TST-humidified अंधेरे कक्ष में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के दौरान दूसरा ऊष्मायन कदम के लिए उल्टा coverslips सेते .
  8. ट्रांसfer वापस 6 अच्छी तरह प्लेटें coverslips, और TST के साथ 2 एक्स 5 मिनट धो लो.
  9. स्पॉट 50 नए गिलास स्लाइड पर coverslip प्रति FITC (TSBSA में 1:250) के साथ संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश एंटीबॉडी के μl, और एक TST-humidified अंधेरे कक्ष में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के दौरान तीसरे ऊष्मायन कदम के लिए उल्टा coverslips सेते .
  10. स्थानांतरण वापस 6 अच्छी तरह प्लेटें coverslips, और TST के साथ 2 एक्स 5 मिनट धो लो.
  11. स्पॉट 50 नए गिलास स्लाइड पर coverslip प्रति माउस विरोधी बायोटिन एंटीबॉडी के μl (TSBSA में 1:200), और एक TST-humidified अंधेरे कक्ष में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के दौरान चौथे ऊष्मायन कदम के लिए उल्टा coverslips सेते हैं.
  12. स्थानांतरण वापस 6 अच्छी तरह प्लेटें coverslips, और TST के साथ 2 एक्स 5 मिनट धो लो.
  13. स्पॉट 50 नए गिलास स्लाइड पर coverslip प्रति Rhodamine (TSBSA में 1:250) के साथ संयुग्मित गधा विरोधी माउस एंटीबॉडी के μl, और उल्टा एक TST-humidified अंधेरे chamb में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के दौरान पांचवें ऊष्मायन कदम के लिए coverslips सेतेएर.
  14. स्थानांतरण वापस 6 अच्छी तरह प्लेटें coverslips, और TST के साथ 2 एक्स 5 मिनट धो लो.
  15. स्पॉट 50 नए गिलास स्लाइड पर coverslip प्रति Rhodamine (TSBSA में 1:250) के साथ संयुग्मित बकरी विरोधी घोड़ा एंटीबॉडी के μl, और एक TST-humidified अंधेरे कक्ष में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के दौरान छठे ऊष्मायन कदम के लिए उल्टा coverslips सेते . नोट: बकरी विरोधी घोड़ा एंटीबॉडी गधा विरोधी माउस एंटीबॉडी पहचान लेगा; जब शोधकर्ता के लिए उपलब्ध, एक बकरी विरोधी गधा एंटीबॉडी के रूप में अच्छी तरह से काम करेगा.
  16. स्थानांतरण वापस 6 अच्छी तरह प्लेटें coverslips, और TST के साथ 2 एक्स 5 मिनट धो लो. Tris-खारा (टीएस) के साथ अतिरिक्त 5 मिनट धो लें.
  17. 3 मिनट, 3 मिनट के लिए 3 मिनट और 100% इथेनॉल के लिए 90% इथेनॉल के लिए 70% इथेनॉल में बाद में ऊष्मायन द्वारा कोशिकाओं निर्जलीकरण. 6 अच्छी तरह प्लेटें से coverslips निकालें, और कई मिनट के लिए शुष्क हवा हैं.
  18. एक गिलास स्लाइड पर DAPI के साथ बढ़ते मध्यम की एक बूंद (अभिकर्मकों देखें) जगह है, और उल्टा शीर्ष पर coverslip जोड़ें. नेल वार्निश के साथ स्लाइड सील औरफ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा मछली परिणामों का आकलन (चित्रा 1).

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Representative Results

संयुक्त डीएनए शाही सेना मछली के लिए ऊपर उल्लेख किया प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम महिला भ्रूण स्टेम कोशिकाओं फर्क में एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता कल्पना करने में सक्षम है. 1 हम Xist (जो दोनों का पता लगाया है, जहां एक डीएनए शाही सेना मछली प्रयोग के एक प्रतिनिधि उदाहरण से पता चलता है निष्क्रिय एक्स गुणसूत्र पर एक तथाकथित Xist आरएनए बादल और सक्रिय एक्स गुणसूत्र पर एक बेसल प्रतिलेखन तुच्छ), और एक तुच्छ संकेत के रूप में दिख रहा है जो एक्स गुणसूत्र के एक क्षेत्र के रूप में दिखाई दे. तुच्छ संकेतों में से एक है, जिससे Xist बादल वास्तव में साथ स्थानीयकृत, और एक्स गुणसूत्र कोटिंग दिखा रहा है कि Xist बादल के भीतर स्थित है कि ध्यान दें. कोशिकाओं के 99% से अधिक में, हम अपने प्रोटोकॉल एक सही डीएनए संकेत (नहीं दिखाया डेटा) का उपयोग कर पता लगाने. आरएनए मछली की तुलना में, Xist बादलों विकृत डीएनए एक बड़े क्षेत्र पर कब्जा करने के लिए लगता है के रूप में संयुक्त डीएनए शाही सेना मछली प्रक्रिया, कभी कभी बड़ा देखो का उपयोग कल्पना. हम ओब हैमानव ES कोशिकाओं, मानव लिम्फोसाइटों और विभिन्न प्रजातियों के विभिन्न fibroblast सेल लाइनों का उपयोग इसी तरह के परिणाम tained, और एक ही प्रोटोकॉल Rnf12 सहित विभिन्न एक्स से जुड़े स्थलों के जीन की अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए लागू किया गया है. इस प्रोटोकॉल undifferentiated महिला ES कोशिकाओं को लागू किया गया था जब इसके अलावा, दोनों एक्स क्रोमोसोम से बेसल Xist अभिव्यक्ति कम स्तर पर व्यक्त भी इस प्रोटोकॉल का उपयोग जीन (डेटा) नहीं दिखाया देखे जा सकते हैं जो दर्शाता है कि पता लगाया जा सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. विभेदित महिला ES कोशिकाओं में संयुक्त डीएनए शाही सेना मछली. संयुक्त डीएनए शाही सेना मछली के लिए यहाँ बताया प्रोटोकॉल के बाद प्राप्त प्रतिनिधि परिणाम है. एक्स गुणसूत्र (एक्स CHR.) FITC संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग कल्पना है जो एक digoxigenin लेबल बीएसी जांच, (हरी संकेत का उपयोग कर पाया हैअल). लगभग हर कोशिका में, दो एक्स क्रोमोसोम पता चला रहे हैं. Xist आरएनए rhodamine (रेड सिग्नल) संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग कल्पना है जो एक बायोटिन लेबल सीडीएनए जांच, का उपयोग कर पाया है. निष्क्रिय एक्स गुणसूत्र (Xist बादल) और सक्रिय एक्स गुणसूत्र (Xist pinpoints) से बेसल Xist अभिव्यक्ति पर दोनों बड़े Xist राशि का पता लगाया जाता है (ध्यान दें: भेदभाव पर इस बेसल Xist अभिव्यक्ति भविष्य सक्रिय एक्स गुणसूत्र पर रह गए हैं, और इसलिए पता नहीं है हर नाभिक में). नाभिक DAPI (नीला) के साथ counterstained रहे हैं. स्केल बार 10 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

डीएनए मछली के लिए उपयुक्त स्थितियां कम स्थिर शाही सेना अणु के लिए भी कठोर हो सकता है के रूप में संयुक्त डीएनए शाही सेना मछली, तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है. कई तरीकों डीएनए और आरएनए दोनों का पता लगाने के जांच के साथ एक साथ ऊष्मायन के लिए जरूरत circumventing, एक ही सेल में डीएनए और आरएनए दोनों का अध्ययन करने के लिए लागू किया गया है. उदाहरण के लिए, एक superimposition दृष्टिकोण में, पहली बार शाही सेना मछली किया जाता है, और कोशिकाओं imaged हैं, और निर्देशांक ले रहे हैं. बाद में, एक ही स्लाइड शाही सेना मछली के संकेत खो दिया है, जिसके दौरान डीएनए मछली के लिए उपयोग किया जाता है. डीएनए मछली के बाद, कोशिकाओं को फिर से imaged हैं, और आरएनए और डीएनए मछली दोनों से प्राप्त चित्रों आरोपित कर रहे हैं. तय कोशिकाओं के डीएनए स्थिर है, और प्रारंभिक आरएनए मछली के लिए आवश्यक उपचार से प्रभावित नहीं है के रूप में इस दृष्टिकोण, लगभग सभी मामलों में काम करेंगे, इस पर कम से कम चार दिन में खर्च होंगे, जो एक बहुत ही थका देने वाली दृष्टिकोण है. एक और दृष्टिकोण में, पहला शाही सेना मछली किया जाता है, आरएनए मछली संकेत ओ अलावा द्वारा तय हो गई हैडीएनए मछली लागू किया जाता है, जिसके बाद च fixatives,. इस दृष्टिकोण से काम कर सकते हैं, आरएनए मछली से व्युत्पन्न फ्लोरोसेंट संकेत के कुछ निर्धारण पर खो दिया जा सकता है. यह विशेष रूप से केवल एक कम स्तर पर व्यक्त कर रहे हैं जो टेप का पता लगाने में बाधा हो सकती है. इस के साथ साथ प्रस्तुत दृष्टिकोण एक मछली प्रयोग में एक शाही सेना लक्ष्य और एक डीएनए लक्ष्य दोनों का एक साथ पता लगाने के लिए अनुकूलित किया है, और दोनों के परिणाम विश्वसनीय परिणामों के साथ दो दिनों के भीतर एक ही प्रयोग में प्राप्त किया जा सकता है कि लाभ दिया जाता है.

मछली प्रोटोकॉल में कई कदम उठाए इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं. शाही सेना अणु के साथ काम कर जब भी सबसे पहले, एक प्रयोग किया जाता है किसी भी बफर या समाधान में RNAse परिचय नहीं सावधान रहना चाहिए. इसलिए, एक स्वच्छ कार्य वातावरण स्थापित किया जाना चाहिए, और pipetting अभिकर्मकों मछली के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है जब फिल्टर सुझावों इस्तेमाल किया जाना चाहिए. केयर RNase मुक्त यौगिकों (उदाहरण के लिए RNase मुफ्त पानी, सेल कल्चर ग्रेड पीबीएस, पूर्ण उपयोग करने के लिए लिया जाना चाहिएly शुद्ध इथेनॉल आदि). इन सरल नियमों का पालन कर रहे हैं, तो इसका इस्तेमाल किया अभिकर्मकों के लिए पूरक अतिरिक्त RNAse inhibitors का उपयोग करने के लिए आम तौर पर आवश्यक नहीं है. दूसरा, पेप्सिन का उपयोग permeabilization प्रक्रिया बहुत कम या बहुत ज्यादा permeabilization के बीच एक सज्जन संतुलन है. इस्तेमाल किया विशेष सेल प्रकार पर निर्भर करता है, यह permeabilization के लिए अनुमति दी समय, या पेप्सिन सांद्रता का अनुकूलन करने की आवश्यकता हो सकती है. गतिविधि भिन्न हो सकता है के रूप में बाद में भी, पेप्सिन के अपने विशेष बैच पर निर्भर करता है. कुछ शर्तों के तहत अच्छे परिणाम में 5 मिनट के परिणाम के लिए 0.1% Triton-X100/PBS का उपयोग कर, और permeabilization की इस पद्धति का उपयोग मछली परमाणु या cytoplasmic प्रोटीन का पता लगाने के लिए immunostaining के साथ जोड़ा जा सकता है कि लाभ है एक वैकल्पिक, permeabilization के रूप में. मछली की एक तीसरा महत्वपूर्ण पहलू के रूप में, उम्र बढ़ने, विकृतीकरण, संकरण और धोने के तापमान स्थिर रखा जाना चाहिए. लक्ष्य के तापमान से भी छोटे विचलन कम EFF में परिणाम कर सकते हैंअधिक पृष्ठभूमि धुंधला में परिणाम होगा जो icient विकृतीकरण, संकरण, या कम कठोर washes,. भी 2 मिनट, 5 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रारंभिक विकृतीकरण के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण द्वारा पीछा 65 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए उम्र बढ़ने कदम के लिए एक विकल्प के रूप में, उम्र बढ़ने के बिना, अच्छे परिणाम दे सकते हैं. सामान्य तौर पर इस प्रक्रिया को और अधिक विश्वसनीय डीएनए मछली संकेत देता है, जैसा कि हम उम्र बढ़ने की प्रक्रिया को प्राथमिकता देते हैं. अंत में, कुछ डीएनए जांच वे पर्याप्त पता लगाने के लिए एंटीबॉडी की तीन परतों की आवश्यकता नहीं होगी, ताकि विशिष्ट हो जाएगा. इस अनुभव से हर नव सृजित जांच के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए.

मौजूदा प्रोटोकॉल एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता और Xist का पता लगाने, आरएनए और डीएनए के संयुक्त पता लगाने के अध्ययन में मजबूती के साथ काम करता है हालांकि अन्य सेटिंग्स में और अधिक जटिल हो सकता है. यह विशेष रूप से पता लगाया जा करने के उद्देश्य से है जो शाही सेना प्रजातियों केवल बहुत कम स्तर पर व्यक्त की है जब मामला हो सकता है, दोहराने दृश्यों से भरा है या एक अपेक्षाकृत कम हैप्रतिलेख. इन स्थितियों में, यह लक्ष्य का एक सीमित, इष्टतम नहीं उपलब्ध राशि के लिए कुशल संकरण की अनुमति होगी जो एक इष्टतम जांच, डिजाइन करने के लिए नहीं बल्कि मुश्किल हो सकता है. ऐसी स्थितियों में, यह आरएनए मछली के लिए पहले की स्थिति के अनुकूलन लायक हो सकता है. कई वैकल्पिक जांच करने की कोशिश की जा सकती है, और निक अनुवाद द्वारा जांच लेबलिंग की अवधि शामिल haptens की राशि का अनुकूलन करने के लिए, titrated किया जा सकता है. महत्वपूर्ण बात है, यह उद्देश्य से शाही सेना उदाहरण के लिए RT-पीसीआर द्वारा अभिव्यक्ति सत्यापित करके जांच की जा कोशिकाओं में व्यक्त किया है कि सत्यापित किया जाना चाहिए. कोशिकाओं का एक अलग प्रकार का विश्लेषण करते समय भी, यह कि यह एक तकनीकी, मछली संबंधित समस्या, या नए प्रकार में अभिव्यक्ति की सरल अभाव के बीच अंतर की अनुमति सकता है के रूप में पहले, सकारात्मक नियंत्रण के रूप में पहचान की गई है जो अभिव्यक्ति में कोशिकाओं शामिल करने के लिए आवश्यक है कोशिकाओं का विश्लेषण किया. सत्यापित अभिव्यक्ति के बावजूद, विभिन्न जांच और लेबलिंग शर्तों के अनुकूलन के उपयोग, आरएनए मछली n करता है,एक स्पष्ट संकेत में ओ.टी. परिणाम, इसका इस्तेमाल किया formamide की राशि, या अवधि और जांच संकरण के तापमान में परिवर्तन करके, संकरण की स्थितियों को बदलने लायक हो सकता है. वैकल्पिक रूप से, सीधे लेबल oligonucleotide जांच 9-10 इस्तेमाल किया जा सकता है. एक ही अनुकूलन कदम बाद में डीएनए मछली, और डीएनए और आरएनए का एक साथ पता लगाने में सुधार करने के लिए लागू किया जा सकता है.

संयुक्त डीएनए शाही सेना मछली प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम महिला ते फर्क कोशिकाओं में एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता का अध्ययन करने में सक्षम है. इसी तरह के परिणाम विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं और भ्रूण का उपयोग हमारी पढ़ाई में प्राप्त किया गया है, और हम इस समय आगे ऊतक वर्गों पर संयुक्त डीएनए शाही सेना मछली लागू करने के लिए परिस्थितियों को अनुकूलित कर रहे हैं. कई जैविक प्रक्रियाओं में गैर कोडन RNAs की महत्वपूर्ण भूमिका को अधिक से अधिक की सराहना हो जाता है, हम एक ही प्रोटोकॉल संभावना उनके विशिष्ट chromatin के संदर्भ में अन्य गैर कोडन RNAs अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि उम्मीद है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
female mouse embryonic stem cells will be made available upon request
mouse embryonic fibroblasts can be derived from E13.5 embryos, or via commercial sources e.g. Millipore
ES cell culture medium DMEM, 15% fetal calf serum, 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin, non-essential amino acids, 0.1 mM γ-mercaptoethanol, and 1,000 U/ml LIF. Filter sterilize and store at 4 °C for maximum of 2 weeks.
LIF Chemicon ESG1107
DMEM Invitrogen 11960085
Fetal Calf Serum Invitrogen 10099141
Penicillin–streptomycin (100x) Invitrogen 15140-122
Non-essential aminoacids Invitrogen 11140-050
γ-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M7522
ES cell differentiation medium IMDM-Glutamax, 15% heat inactivated fetal calf serum, 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin, non-essential amino acids, 37.8 μl/L monothioglycerol and 50 μg/ml ascorbic acid
IMDM-Glutamax Invitrogen 31980-030
Ascorbic acid (50 mg/ml) Sigma-Aldrich A4403
monothioglycerol Sigma-Aldrich M6145
T25 cell culture dishes Greiner Bio-one 690160
6-well cell culture dishes Greiner Bio-one 662160
cell culture grade PBS Sigma-Aldrich D8537
Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) trypsin/0.2% (w/v) EDTA in PBS Gibco 25200-056
Falcon tubes Falcon 352196
24 x 24 mm coverslips Menzle 780882
gelatin Sigma-Aldrich G1890-100G prepare a 0.2% gelatin/cell culture PBS solution, and autoclave
Pepsin Sigma-Aldrich P7000 Dilute to 0.2% in 0.01 M HCl (pH 2.0)
absolute 100% ethanol Sigma-Aldrich 32221-2.5L use absolute 100% ethanol and RNAse free water to make 70% and 90% ethanol solutions
RNAse free water Baxter TKF7114
sterile filter tips Rainin Bio Clean GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F
digoxigenin-labeling kit (DIG-Nick translation) Roche 11745816910
biotin-labeling kit (Biotin Nick translation) Roche 11745824910
Sephadex G50 Sigma-Aldrich G5080
2 ml syringe BD Plastipak 300013
sterilized cotton
Eppendorf tubes Eppendorf 30120086
yeast tRNA 10 mg/ml Invitrogen 15401-029
Salmon Sperm DNA 10 mg/ml Invitrogen 15632-011
mouse cot-1 DNA 1 mg/ml Invitrogen 18440-016
Eppendorf bench top microcentrifuge Eppendorf Model 5417R
Eppendorf refrigerated centrifuge Eppendorf Model 5810R
2 M NaAc, pH 5.6 Sigma-Aldrich S7670
50+ hybridization solution 50% formamide, 2x SSC, 50 mM phosphate buffer pH 7, 10% dextran sulfate pH 7
formamide Acros organics 3272350000
dextran sulfate Fluka 31403
10 mM phosphate buffer, pH 7 add 57.7 ml of 1 M Na2HPO4 and 42.3 ml 1 M NaH2PO4; use DEPC treated water and autoclave
denaturation buffer 70% formamide/2x SSC/10 mM phosphate buffer pH 7
Tween-20 Sigma-Aldrich P2287
2 M Tris pH 7.5 solution
Tris-saline-Tween washing solution (TST) 100 ml 10x saline, 50 ml 2M Tris, 500 μl Tween-20, add RNAse free water till 1 L
10x saline solution dissolve 85 g NaCl in 1 L RNAse free H2O, and autoclave
Tris-saline-BSA (TSBSA) 500 μl 10x saline, 250 μl 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3.25 ml RNAse free H2O
BSA, purified, 100x New England Biolabs B9001S
sheep-anti-dig antibody Roche diagnostics use 1:500 diluted in TSBSA
rabbit-anti-sheep antibody conjugated with FITC Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
goat-anti-rabbit antibody conjugated with FITC Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
mouse-anti-biotin antibody Roche diagnostics use 1:200 diluted in TSBSA
donkey-anti-mouse antibody conjugated with Rhodamine Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
goat-anti-horse antibody conjugated with Rhodamine Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
Tris-saline washing solution (TS) 10 ml 10x saline, 5 ml 2 M Tris, 85 ml RNAse free H2O
Vectashield mounting medium with DAPI Vectorlabs H-1200
nail varnish
fluorescent miscroscope

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References

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