결합 된 DNA-RNA 형광

Biology

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Summary

현장 하이브리드(물고기)의 형광은 세포 내에서 네이티브 환경에서의 핵산을 검출 할 수 있습니다. 우리는 여기에 마우스 배아 줄기 세포에서 X 염색체의 불 활성화를 연구하는 데 사용할 수있는 FISH에 의해 RNA와 DNA의 결합, 동시 검출을위한 프로토콜을 설명합니다.

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Barakat, T. S., Gribnau, J. Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (88), e51628, doi:10.3791/51628 (2014).

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Abstract

제자리 혼성화 (FISH)에서 형광 세포의 핵산의 검출을 가능 분자 기법이다. DNA 물고기는 종종 세포 유전학과 암 진단에 사용되며, 종종 중요한 임상 적 의미를 가지고있는 게놈의 수차를 검출 할 수있다. FISH RNA는 세포에서 RNA 분자를 검출하는데 사용될 수 있으며, 유전자 발현의 조절에 중요​​한 통찰력을 제공했다. DNA FISH에 적합한 조건이 깨지기 쉬운, 단일 가닥 RNA 분자에 비해 너무 가혹한 수 있습니다와 같은 세포 내 DNA 및 RNA의 물고기를 결합하는 것은 기술적으로 도전이다. 우리는 여기에서 X 염색체에 의해 인코딩 XIST RNA와 DNA의 결합을 동시에 검출 할 수 쉽게 적용 할 수있는 프로토콜을 제시한다. 이 결합 된 DNA-RNA 물고기 프로토콜 가능성이 RNA와 DNA가 탐지해야하는 다른 시스템에 적용 할 수 있습니다.

Introduction

현장 하이브리드(물고기)의 형광에 의해 세포와 조직을 공부하는 것은 1970 년대 후반 1 년에 소개 된 이후, 연구자들은 세포 내 수준에서 유전자 염색질 조직 및 유전자 발현을 연구 할 수있다. DNA의 FISH 자주 세포 유전학, 핵형이, 암 진단 (3) 및 착상 전 유전자 검사 (4)에 사용되고, 그것은 그 나라의 환경에서 핵산을 검출 할 수 있으므로 분자 연구 5-6에서 중요한 역할을한다. RNA FISH에 의해 단일 ​​세포 발현 분석은 네이티브 차 전 사체를 검출 할 수 있고, 비 암호화 RNA를 염색체로부터 전사되고, 예를 들면 등 집단 수준에서 유전자 발현을 평가하는 다른 기술에 이점을 제공 정량적 RT-PCR, 게놈 넓은 발현 분석 또는 노던 블롯 . 원래 자신의 사이트에서 직접 발생하는 RNA 전 사체를 시각화함으로써, 예를 들어왔다유전자 발현 확률 7이며, 때로는 8 대립 유전자 특정 할 수 있습니다 것으로 나타났습니다. 기술의 개선도 9-11 세포 내에서 하나의 mRNA 분자의 검출과 정량을 허용했다.

FISH의 기본 원리는 매우 구체적인 왓슨과 크릭 염기쌍에 의해 핵산 프로브로 세포 내에서 핵산의 혼성화로 구성된다. 프로브는 직접 또는 간접적으로 검출, 미시적으로 시각화 될 수있는 신호의 결과 일 수있다. 초기 시도는 안전 문제, 제한된 공간 해상도 및 시간 12-14에 하나의 타겟을 검출 할 수있는 능력에 근거 단점이 있었다 방사성 표지 된 프로브로 구성되었다. 형광 색소, 합텐, 효소 등의 비 방사성 라벨의 후속 개발, 일상적인 분자 생물학 기법으로 물고기의 폭 넓은 사용을 허용했다. FISH 프로브는 직접 fluoroch으로 표시 할 수있다산 핵산에 형광 분자의 화학적 연결하여 romes (15)와 형광 표지 된 뉴클레오티드 16 ~ 19, 또는 프로브가 간접적으로 (비오틴과 제닌 포함) 합텐의 통합에 접합 된 합텐 특정 항체에 의해 합텐의 면역 검출 후 시각화 할 수있는 통합을 시퀀스 형광 기자는 20 ~ 21 분자. 후자의 방법은 원래의 신호를 향상시키기 위해 사용되는 형광 표지 된 항체의 여러 계층을 사용하여 신호 증폭이 가능하고, 낮은 수준으로 발현되는 RNA 종의 검출을 가능하게한다. 직접 및 간접 라벨링 기술과 다양한 합텐을 결합하여 여러 가지 목표를 동시에 동일한 셀 내에서 시각화 할 수 있습니다.

FISH 프로토콜에서 가장 중요한 단계 중 하나는 대상에 대한 프로브의 하이브리드입니다. 이론적으로, 프로브가 구체적으로 실제로 목표에만 바인딩되지만,이 특이성프로브는 상동 지역에 바인딩 수 있으므로 항상 달성되지 및 하이브리드 조건이 항상 특정 DNA 영역 또는 RNA 종에 적합하지 않을 것입니다. 그들이 FISH 절차의 엄격 성을 증가시킬 수 있고, 배경 잡음의 고레벨 초래 FISH 프로브의 비특이적 결합을 방지 할 수있는 포스트 - 혼성화 세척 따라서 특히 중요하다. RNA 분자가 하나의 좌초로 그들은 쉽게 FISH 프로브에 혼성화 할 수 있습니다. 대조적으로, 이중 가닥 DNA 분자는 먼저 프로브에 혼성화 할 수있는 후 변성 단계를 필요로한다. 이것은 일반적으로 DNA의 변성을 초래 시험편의 가열에 의해 달성된다. 그러나 이러한 가혹한 조건에서, 깨지기 쉬운, 단일 가닥 RNA 분자가 손실 될 수 있습니다. 따라서 결합 된 DNA-RNA FISH는 조건의 상당한 최적화를 필요로하고, 단지 RNA 또는 DNA의 별도의 검출에 비해 기술적으로 도전이다.

여기에서 우리는 프리젠타 자세한 문의는 여성 마우스 배아 줄기 세포에게 22-24 차별화에 X 염색체 불 활성화 (XCI)를 연구 할 수있다 결합, 동시에 DNA-RNA 물고기의 프로토콜입니다. XCI는 중요한 성적인 여성의 배아 발달 (25)에 대한 메커니즘 및 heterochromatinization 결과이며 따라서 여성 개인이 26 ~ 27에있는 두 개의 X 염색체 중 하나의 침묵. 이 과정에 필수적인 RNF12 22 ~ 23과 REX1 24 단백질에 의해 조절되는 비 암호화 RNA XIST 28-30가 있습니다. XIST 표현이 배아 발달 동안이나 체외에서 ES 세포 분화에 미래 비활성 X 염색체 (사이)에 상향 조절된다 와 X 염색체를 따라 확산하여 X 염색체 (31)의 전사 종료 될 염색질 리모델링 효소를 유치 할 수 있습니다. 이 XIST RNA의 확산은 X 염색체의 코팅으로 RNA FISH에 의해 시각하실 수 있습니다일부도 XIST 클라우드라고한다. 여성 ES 세포 게놈 불안정성으로 인해 자신의 X 염색체 중 하나를 잃을 수 있기 때문에, 우리는 다른 사람은 확인 만 되었으면 염색체 안정 세포가이 중요한 과정 (22), (32)의 분석에서 평가하는 것을 확인하기 위하여, XCI을 연구하기 위해 결합 된 DNA-RNA FISH를 이용했다 -34. 모든 분자 생물학 기법으로, 여러 가지 우수한 프로토콜은 35-38을 발표되었다. 여기에 우리가 할 수 있도록 마우스 ES 세포, 세포의 고정, 닉 - 번역, 고정 된 세포의 전처리에 의한 FISH 프로브의 라벨에 분화 유도에서 시작, 우리의 방법을 제시 permeabilization 이후 프로브 흡수,에 프로브의 하이브리드 타겟, 그리고 마지막으로 형광 표지 된 항체에 의해 프로브의 검출. 여기에 제시 프로토콜은 XIST RNA의 충실한 검출 이틀의 기간 내에서 X 염색체를 허용하고,이 기술의 기본 가능성이 오티에 적용 할 수 있습니다그녀의 시스템과 연구의 영역.

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Protocol

1. 여성 배아 줄기 세포의 분화 유도 X 염색체의 불 활성화를 유도하기 위해

참고 : 여성 마우스 배아 줄기 세포 (요청시 제공)을 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs)로 코팅 된 호화 배양 접시에 표준 ES 세포 조건에서 재배하고 있습니다. 우리는 여기에서 독자가 표준 세포 배양 기술에 39-41을 잘 알고 있다고 가정합니다. 분화를 유도하기 위하여, T25 접시에서 성장 ES 세포는 MEFs에서 분리되고, 분화 배지에서 도금 될 것이다.

  1. ES 세포 배양에서 ES 매체를 제거하고 세포 배양 PBS로 두 번 세척한다.
  2. 1.5 ML 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (37 ° C에서 미리 예열) 추가하고 7 분 동안 37 ° C에서 세포를 품어. 5 분 후, 식민지를 깨고 부드럽게 요리를 흔들.
  3. 세포 분화 배지 3.5 ㎖를 첨가하여 트립신-EDTA를 비활성화. 피펫 세포 상하 단일 세포 용액을 수득하고, 수집15 ML 튜브에. 200 XG에 5 분 동안 회전, 분화 매체의 10 ML에있는 세포를 수집합니다.
  4. 비 젤라틴 화 배양 접시에 세포 현탁액을 추가하고 세포 배양 인큐베이터에서 1 시간 동안 배양한다. 참고 : ES 세포 현탁액에 남아 반면 MEFs는, 비 젤라틴 화 배양 접시에 부착 할 수 있습니다.
  5. 한편, 6 - 웰 플레이트에 멸균 유리 커버 슬립 (24 X 24mm)를 추가 0.2 % 젤라틴을 추가하고, 상온에서 최소 5 분 동안 품어.
  6. 1 시간 후, 주로 비 접착 ES 세포로 구성되는, 사전 도금 ES 세포 배양의 상층 액을 수집합니다. 커버 슬립을 포함 6 - 웰 플레이트에 플레이트 ES 세포. 참고 : 사용 ⅙ 6 잘 플레이트의 6 우물 합류 T25 접시의 일. 이 잘 분화의 3 일 후에 합류 차별화 수 있습니다. 매일 매체를 변경합니다. 더 이상 차별화 시간 코스, 세균 요리에 차별화 매체 접시 사전 도금 ES 세포와 incub에 대한세포 배양 인큐베이터에 통합 된 세포의 진탕 먹었다. 이 세포는 1-2 일 전에 고정으로 커버 슬립으로 도금 될 수 배아 체를 형성하도록 허용 할 것이다.

이후 DNA-RNA의 FISH 분석을위한 차별화 된 ES 세포의 2. 고정

  1. 차별 문화에서 차별화 매체를 제거하고 세포 배양 PBS로 두 번 세척한다. 참고 : 세포가 씻겨지지 않도록 조심스럽게 PBS를 추가합니다.
  2. 세포 배양 PBS를 제거하고 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) / PBS를 첨가하여 세포를 고정하고, 실온에서 10 분 동안 배양한다. 주의 : PFA는 독성과 흡입하거나 피부 나 눈에 접촉 될 때 중요한 건강 위험을 일으킬 수 있습니다. 또한, PFA는 발암 물질이다.
  3. 4 % PFA / PBS를 제거하고 70 % 에탄올로 커버 슬립 배 씻는다. 주 : PFA의 흔적 후속 FISH 단계에 방해가되므로 올바른 세척이 중요합니다. 커버 슬립 전에 F에 몇 개월 -20 ° C에서 70 % 에탄올에 저장 될 수있다ISH 분석.

FISH 실험에 대한 DNA 프로브의 3. 레이블

참고 : 관심의 유전자 (최소 길이> RNA FISH, 또는> DNA의 물고기를 20킬로바이트 2 KB), 또는 관심있는 유전자를 포함하는 BAC의 DNA 조각을 얻습니다. 대부분의 전사가 동시에 검출 할 수있는 여러 사본에 원인이되므로 RNA 검출을 위해, 작은 프로브, DNA 검출에 비해 충분히 할 수 있습니다. 단일 복사본 DNA 가닥의 강한 신호에 대해서, 더 긴 프로브 혼입 합텐의 충분한 수를 검출 할 수 있도록 요구된다. 바람직하게, 비 - 전사 된 게놈 영역은 DNA 프로브를 설계를 위해 선택된다. RNA를 검출하기 위하여 더 작은 프로브를 사용할 때, 이는이 완전히 배제 할 수는 없지만 RNA가 전사되는 게놈 로커스 결합 DNA-RNA의 FISH 방법으로 검출되는 것을 방지 할 것이다. 마우스 XIST을 검출하기 위해, 5.5 킬로바이트 된 cDNA 프로브를 사용 하였다. DET에 대한X 염색체의 ection 여러 BAC 프로브가 사용될 수있다. 좋은 결과는 XIST의 현장 가까이에있는 BAC RP23-100E1 및 BAC CT7-474E4의 혼합물로 얻어졌다. 관심의 유전자 또는 염색체에 따라 여러 가지 프로브는 최적의 결과를 얻기 위해 필요할 수 있습니다. , RNA-FISH에 사용되는 재료로 작업 깨끗한 환경에서 살균 필터 팁, 이는 RNAse 무료로 H 2 O 및 작업을 사용할 때마다.

  1. DNA 1 μg을 16 μL의 총 부피에 H 2 O에서 희석. 4 제닌 ㎕의 또는 비오틴 라벨링 솔루션 (시약 참조) 추가 소용돌이로 교반하여 혼합하고 90 분 동안 16 ° C에서 알을 품다. 참고 : 비타민 B 복합체 또는 제닌 표지 뉴클레오티드 지금 흠 번역에 의해 통합됩니다.
  2. 한편, 비 통합 세포핵을 제거하기 위해 G50의 열을 준비합니다. , 2 ML의 주사기를 타고 스탬퍼을 제거하고 주사기로 멸균면을 추가합니다. 솔루션 t에서 G50 공 추가O 1 분 642 XG에 15 ML 튜브와 원심 분리기에 주사기를 배치, 주사기를 채우십시오. 참고 : 주사기의 약 80 %가 현재 G50로 가득해야합니다. 이하 G50이 존재하는 경우 반복합니다.
  3. 90 분 후, 닉 - 번역 반응 혼합물을 H 2 O의 40 μL를 추가 한 G50 컬럼에 반응을 추가한다. 열에서 빈 튜브를 추가하고 2 분 642 XG에 원심 분리기. 반응 튜브를 통하여 흐름을 수집한다.
  4. 펫을 통해 흐름의 양을 측정하고, 200 μL의 총 볼륨에 도달하는 H 2 O를 추가합니다. 13.3 μL 연어 정자 DNA (10 ㎎ / ㎖), 13.3 μL 효모의 tRNA (10 ㎎ / ㎖), 26.7 μL 마우스 침대-1 DNA (1 ㎎ / ㎖) 28 ㎕의 2 M NaAc, 산도를 추가를 통해 흐름을 침전 5.6. 소용돌이로 교반하여 혼합하고, 533 ㎕의 얼음에게 차가운 100 % 에탄올을 추가합니다. 4 ℃에서 30 분 동안 16,200 XG에서 튜브와 원심 분리기를 흔들어
  5. 뜨는을 제거하고 70 % 에탄올로 두 번 펠릿 씻는다. 5 분에 대한 16,200 XG에 원심 분리기4 ° C, 공기 펠렛을 건조. 50 + 하이브리드 솔루션의 50 μl를 추가하고 용해를 촉진하기 위해 30 분 동안 37 ° C에서 알을 품다. 참고 : 레이블이 프로브는 -20 ℃에서 몇 년 동안 저장 될 수있다 주의 : 50 + 하이브리드 솔루션, 독성, 피부, 눈과 호흡기에 자극을 줄 수 있으며, 또한 기형이다 포름 아미드가 포함되어 있습니다.

4. Permeabilization, 결합 DNA-RNA 물고기를 고정 세포의 전처리 및 하이브리드

  1. 70 % 에탄올 및 10 - 웰 플레이트에 세포 배양 PBS의 첨가를 제거하여, 커버 슬립에 고정 된 세포를 재수. 5 분 동안 품어. 총 세 번 반복합니다.
  2. 세포 배양 PBS를 제거하고 세포를 투과하는, 6 - 웰 플레이트에 0.2 %의 펩신을 추가합니다. 4 분 동안 37 ° C에서의 물을 욕조에 6 - 웰 플레이트를 품어. 펩신을 제거하고, 이는 RNAse 무료로 H 2 O와 비활성화
  3. 실온에서 5 분 동안 4 % PFA / PBS와 함께 배양하여 사후 수정 세포. fixati 후에, 5 분 동안 세포 배양 PBS로 두 번 세척한다.
  4. 3 분 3 분 3 분, 100 % 에탄올, 90 % 에탄올, 70 % 에탄올로 배양하여 세포를 탈수. 전송 6 - 웰 플레이트 밖으로 커버 슬립, 그리고 몇 분 동안 공기 건조 커버 슬립.
  5. 열 접시에 1 시간 동안 65 ° C에서의 coverslips을 배양하여 나이 세포.
  6. 분석 할 수있는 모든 coverslip을 함께 추가하여 마우스 침대-1 DNA와 FISH 프로브를 사전 하이브리드, 50 + 하이브리드 솔루션, 0.5 ㎕의 마우스 침대-1 DNA, 비오틴 표지 XIST 프로브의 1 μL와 제닌의 1 μL의 25 μL X 염색체를 검출하는 표시 BAC 프로브. 소용돌이로 교반하여 혼합하고, 5 분 동안 99 ℃에서 변성. 침대-1 DNA가 프로브에 존재하는 순서를 반복 교배 할 수 있도록 45 분 동안 37 ° C에서 즉시 품어.
  7. 노화 후, 유리 슬라이드에 (SSC/10 MM의 인산 완충 formamide/2x 70 %로 구성) 변성 버퍼의 50 μl를 발견하고, 세포가 towar을 향 상단에 커버 슬립을 넣어변성 버퍼 DS. 2 분 동안 65 ° C에서 알을 품다.
  8. 5 분 동안 얼음 차가운 70 % 에탄올에 배양하여 다시 6 - 웰 플레이트에 커버 슬립, 사후 수정 세포를 추가합니다.
  9. 3 분 3 분 3 분, 100 % 에탄올, 90 % 에탄올, 70 % 에탄올에 후속 배양 세포를 탈수. 6 - 웰 플레이트에서의 coverslips를 제거하고 몇 분 동안 건조시켜.
  10. 유리 슬라이드에 사전 하이브리드 프로브를 발견하고, 상단에 커버 슬립을 배양한다. 장소 SSC formamide/2x 50 ㎖의 50 %로 가득 찬 가습 실에서 슬라이드 및 37 ℃에서 하룻밤 배양

5. 후 하이브리드 세척 및 검사의 항체 매개 검출

  1. 2X SSC와 6 - 웰 플레이트를 입력하고 미리 따뜻한 42 ° C.까지 하룻밤 배양 한 후 커버 슬립을 추가하고 5 분 동안 42 ° C에서 알을 품다.
  2. 2X SSC를 제거하고, 42 ℃에서 10 분 동안 50 % formamide/2x SSC와 커버 슬립을 품다 총 3 회 (모두 씻어 30 분)에 반복합니다. SSC formamide/2x 50 %를 제거하고 실온에서 2 × 5 분 트리스 - 식염수 사이 (TST)와 함께 슬라이드를 씻으십시오.
  3. 스팟 50 ㎕의 새로운 유리 슬라이드에 coverslip에 당 트리스 - 생리 식염수 BSA (TSBSA), 그리고 TST-가습 어두운 챔버에서 실온에서 30 분 동안 차단하는 거꾸로의 coverslips을 품어.
  4. 전송 다시 6 - 웰 플레이트에 커버 슬립 및 TST와 2 × 5 분을 씻어.
  5. 스팟 50 새로운 유리 슬라이드에 coverslip에 당 양 - 안티 발굴 항체 (TSBSA에서 1:500)의 μL 및 TST-가습 어두운 챔버에서 실온에서 30 분 동안 첫 번째 배양 단계의 coverslips을 품어 거꾸로.
  6. 전송 다시 6 - 웰 플레이트에 커버 슬립 및 TST와 2 × 5 분을 씻어.
  7. 스팟 50 새로운 유리 슬라이드에 coverslip에 당 FITC (TSBSA에서 1:250)가 결합 토끼 반대로 양의 항체의 μL 및 TST-가습 어두운 챔버에서 실온에서 30 분 동안 제 2 배양 단계에 거꾸로 커버 슬립을 품다 .
  8. 트랜스FER 다시 6 - 웰 플레이트에 커버 슬립 및 TST와 2 × 5 분을 씻어.
  9. 스팟 50 새로운 유리 슬라이드에 coverslip에 당 FITC (TSBSA에서 1:250)가 결합 염소 안티 - 토끼 항체의 μL 및 TST-가습 어두운 챔버에서 실온에서 30 분 동안 세 번째 배양 단계에 거꾸로 커버 슬립을 품다 .
  10. 전송 다시 6 - 웰 플레이트에 커버 슬립 및 TST와 2 × 5 분을 씻어.
  11. 스팟 50 새로운 유리 슬라이드에 coverslip에 당 마우스 항 비오틴 항체의 μL (TSBSA에서 1:200), 및 TST-가습 어두운 챔버에서 실온에서 30 분 동안 네 번째 배양 단계에 거꾸로 커버 슬립을 배양한다.
  12. 전송 다시 6 - 웰 플레이트에 커버 슬립 및 TST와 2 × 5 분을 씻어.
  13. 스팟 50 새로운 유리 슬라이드에 coverslip에 당 로다 민 (TSBSA에서 1:250)가 결합 당나귀 - 항 - 마우스 항체의 μL, 거꾸로 TST-가습 어두운 chamb 실온에서 30 분 동안 다섯 번째 배양 단계의 coverslips을 품어어.
  14. 전송 다시 6 - 웰 플레이트에 커버 슬립 및 TST와 2 × 5 분을 씻어.
  15. 스팟 50 새로운 유리 슬라이드에 coverslip에 당 로다 민 (TSBSA에서 1:250)가 결합 염소 안티 - 말 항체의 μL 및 TST-가습 어두운 챔버에서 실온에서 30 분 동안 여섯 번째 배양 단계에 거꾸로 커버 슬립을 품다 . 참고 : 염소 안티 - 말 항체는 당나귀 - 항 - 마우스 항체를 인식합니다; 시 연구원에게 제공, 염소 항 당나귀 항체는 잘 작동합니다.
  16. 전송 다시 6 - 웰 플레이트에 커버 슬립 및 TST와 2 × 5 분을 씻어. 트리스 - 식염수 (TS)과 추가 5 분을 씻으십시오.
  17. 3 분 3 분 3 분, 100 % 에탄올, 90 % 에탄올, 70 % 에탄올에 후속 배양 세포를 탈수. 6 - 웰 플레이트에서의 coverslips를 제거하고 몇 분 동안 건조시켜.
  18. 유리 슬라이드에 DAPI와 매체를 장착 한 방울 (시약 참조) 스팟, 거꾸로 상단에 커버 슬립을 추가합니다. 손톱 광택과 함께 슬라이드를 밀봉하고형광 현미경으로 FISH 결과를 평가한다 (그림 1).

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Representative Results

결합 된 DNA-RNA 물고기를 위에서 언급 한 프로토콜을 사용하여, 우리는 여성의 배아 줄기 세포를 분화에 X 염색체의 불 활성화를 시각화 할 수있게되었습니다. 1 우리가 XIST (인 모두 검출 DNA-RNA FISH 실험의 대표적인 예를 보여줍니다 비활성 X 염색체에 소위 XIST RNA 구름과 액티브 X 염색체에 기초 전사 핀 포인트), 그리고 핀 포인트의 신호로 볼 수있는 X 염색체의 영역으로 볼 수. 핀 포인트 신호 중 하나가되어 XIST 구름이 참으로 따라 지역화 및 X 염색체를 코팅하는 것을 보여주는, XIST 클라우드 내에 위치하고 있습니다. 세포의 99 % 이상에서, 우리는 프로토콜 올바른 DNA 신호 (데이터 미도시)를 이용하여 검출한다. RNA-FISH에 비해 XIST 구름 변성 된 DNA가 더 큰 영역을 차지하기 위해 보인다 결합 된 DNA-RNA FISH 절차가 때로는 큰 볼 사용하여 시각. 우리는 산부인과있다인간 ES 세포, 사람 림프구 및 다양한 종류의 각종 섬유 아 세포주를 사용하여 유사한 결과를 부여되었습니다와 같은 프로토콜을 포함하는 다양한 Rnf12 X-결합 유전자좌의 유전자 발현 연구에 적용되어왔다. 이 프로토콜은 미분화 암 ES 세포에 적용했을 때뿐만 아니라, 두 X 염색체로부터 기저 XIST 발현은 낮은 수준으로 발현의이 프로토콜을 이용하여 유전자 (데이터는 도시하지 않음)를 시각화 할 수 있다는 것을 보여주는, 검출 될 수있다.

그림 1
그림 1. 차별화 된 여성의 ES 세포에 결합 된 DNA-RNA FISH. 결합 된 DNA-RNA 물고기를 여기에서 설명 프로토콜 후의 대표 결과. X 염색체 (X의 CHR는.) FITC에 접합 된 항체를 사용하여 시각화 제닌 표지 BAC 프로브 (녹색 기호를 사용하여 검출알). 거의 모든 셀에 두 개의 X 염색체가 감지된다. XIST RNA는 로다 민 (적색 신호)에 접합 된 항체를 사용하여 시각화하는 비오틴 표지 된 cDNA 프로브를 사용하여 감지됩니다. 비활성 X 염색체 (XIST 구름)와 액티브 X 염색체 (XIST의 표적)에서 기초 XIST 식에 모두 큰 XIST 축적이 검출 된 (주 : 차별화에이 기초 XIST 식은 미래 활성 X 염색체에 정지, 따라서 검출되지 모든 핵). 핵은 DAPI (파란색)와 대조된다. 스케일 바는 10 μm의를 나타냅니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

DNA FISH에 적합한 조건이 안정적 RNA 분자에 비해 너무 가혹한 될 수있는 결합 된 DNA-RNA FISH는 기술적으로 어려울 수 있습니다. 여러 가지 방법은 DNA와 RNA를 모두 검출 프로브와 동시 배양의 필요성을 우회 동일한 셀의 DNA 및 RNA 모두를 연구에 적용되어왔다. 예를 들어, 중첩 방식으로, 첫 번째 RNA 물고기가 수행되고, 셀은 이미지하고, 좌표를 가져옵니다. 그 후, 같은 슬라이드는 RNA FISH의 신호가 손실되는 동안, DNA 물고기에 사용됩니다. DNA의 FISH 후, 균체를 다시 묘화하고, RNA 및 DNA의 FISH 모두로부터 얻어진 사진은 겹쳐있다. 고정 된 세포의 DNA가 안정적이며, 초기 RNA 물고기에 필요한 처리에 의해 영향을받지으로이 방법은 거의 모든 경우에 작동하지만,이 4 일 이상 비용이 매우 힘든 방법입니다. 또 다른 방법으로, 먼저 RNA 물고기가 수행되고, RNA 물고기 신호는 O를 추가로 고정되어DNA의 FISH를 적용한 후에 F 고정 제. 또한,이 방법도 사용할 수 있지만, RNA FISH 유래 형광 신호의 일부는 정착시 유실 될 수있다. 특히 단 낮게 발현되는 전 사체의 검출을 방해 할 수있다. 본 명세서에서 제시된 방법은 단일 FISH 실험 한 RNA 표적 한 DNA 타겟 모두의 동시 검출을 위해 최적화 된, 두 결과가 신뢰할 수있는 결과로 2 일 이내에 번의 실험으로 얻을 수있는 장점을 가지고있다.

FISH 프로토콜의 몇 가지 단계가 최적의 결과를 얻을 매우 중요합니다. RNA 분자를 처리 할 때마다 먼저, 하나는 사용 된 버퍼 또는 솔루션에 이는 RNAse을 소개하지 않도록주의해야합니다. 따라서, 깨끗한 작업 환경이 설정되어야하고, 피펫 시약 FISH에 사용되는 경우 필터 팁을 사용해야합니다. 케어 이는 RNAse 무료 화합물 (예를 들어, RNAse가없는 물, 세포 배양 등급 PBS, 절대 사용주의해야LY 순수한 에탄올 등). 이러한 간단한 규칙을 따르는 경우도 사용될 시약으로 보충 된 추가의 RNase 억제제를 사용하는 것이 일반적으로 필요하지 않다. 둘째, 펩신을 사용하여 permeabilization 절차가 너무 작은, 또는 너무 많은 permeabilization 사이에 부드러운 평형이다. 사용 된 특정 세포 유형에 따라, permeabilization 허용 시간 또는 펩신 농도를 최적화하기 위해 요구 될 수있다. 활동이 다를 수 있습니다으로 후자는 또한, 펩신의 특정 배치에 따라 달라집니다. 특정 조건 하에서 양호한 결과에서 5 분간 결과 0.1 % Triton-X100/PBS 사용, permeabilization이 방법을 사용하여 FISH 핵 또는 세포질의 단백질을 검출하는 면역 염색과 조합 될 수 있다는 장점을 갖는다 대안 permeabilization로. 물고기의 세 번째 중요한 부분으로, 노화, 변성, 하이브리드 및 세척 온도가 일정하게 유지되어야한다. 목표 온도에서 작아도 편차가 적은 EFF 초래할 수더 많은 배경 염색 발생합니다 icient 변성, 하이브리드, 또는 덜 엄격한 세척. 또한 2 분, 5 분, 80 ° C에서 초기 변성 65 ° C에서 변성 다음 65 ° C에서 1 시간 숙성 단계에 대한 대안으로, 노화하지 않고, 좋은 결과를 줄 수 있습니다. 일반적으로이 절차를 더 신뢰할 수있는 DNA 물고기 신호를주기 때문에 우리는 노화 과정을 선호한다. 마지막으로, 특정 DNA 프로브는 충분한 검출 용 항체의 세 층을 필요로하지 않습니다, 그래서 특정 될 것입니다. 이것은 경험적으로 모든 새로 생성 된 프로브에 대한 검사를해야한다.

현재 프로토콜은 X 염색체의 불 활성화 및 XIST의 감지, RNA와 DNA의 결합 검출 연구에 견고하게 작동하지만 다른 설정에서 더 복잡 할 수 있습니다. 이것은 특히 검출 할 목적으로 RNA 종에만 매우 낮은 수준에서 표현되는 경우 일 수 있습니다, 반복 서열의 전체 또는 상대적으로 짧은성적 증명서. 이러한 상황에서, 대상의 제한, 최적의 사용할 양을 효율적으로 하이브리드를 허용 할 최적의 프로브를 설계, 오히려 어려울 수 있습니다. 이러한 상황에서, RNA FISH를위한 첫 번째 조건을 최적화하는 가치가있을 수도 있습니다. 몇몇 대안 프로브 시도 할 수 있고, 닉 - 번역에 의해 프로브 라벨링 기간 혼입 합텐의 양을 최적화하기 위해, 적정 될 수있다. 중요한 것은 목표 RNA는 예를 들어 RT-PCR에 의해 발현을 확인함으로써, 조사해야 세포에서 발현되는 것을 확인한다. 세포의 다른 유형을 분석 할 때 또한,이 기술, FISH 관련된 문제, 또는 새로운 분류 식의 간단한 부재 사이의 구별을 허용 할 수 앞서, 양성 대조군으로서 검출 된 발현 세포를 포함하는 것이 필수적이다 세포 분석했다. 검증 된 발현에도 불구하고, 다양한 프로브 및 라벨링 조건의 최적화의 사용은 RNA FISH는 N을 수행 할 때,클리어 신호 OT 결과는, 그것이 사용되는 포름 아미드의 양, 또는 재생 시간 및 프로브의 혼성화 온도를 변화시킴으로써, 혼성화 조건을 변화 가치가있을 수있다. 또한, 직접 표지 된 올리고 뉴클레오티드 프로브는 9 ~ 10을 사용할 수 있습니다. 동일한 최적화 단계는 이후 DNA의 FISH 및 DNA 및 RNA의 동시 검출을 향상시키기 위해 적용될 수있다.

결합 된 DNA-RNA 물고기 프로토콜을 사용하여, 우리는 여성의 ES 세포를 분화에 X 염색체의 불 활성화를 연구 할 수 있었다. 비슷한 결과는 다른 종류의 세포와 배아를 사용하여 우리의 연구에서 얻어졌다, 우리는 현재 더 조직 섹션에 결합 된 DNA-RNA의 FISH를 적용하는 조건을 최적화 할 수 있습니다. 여러 생물학적 과정에서 비 코딩 RNA들 중 중요한 역할이 더욱 극명하게됨에 따라, 우리는 동일한 프로토콜 가능성 특정 염색질의 컨텍스트에서 다른 비 코딩 RNA를 연구하기 위해 사용될 수 있다는 것을 예견한다.

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Disclosures

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
female mouse embryonic stem cells will be made available upon request
mouse embryonic fibroblasts can be derived from E13.5 embryos, or via commercial sources e.g. Millipore
ES cell culture medium DMEM, 15% fetal calf serum, 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin, non-essential amino acids, 0.1 mM γ-mercaptoethanol, and 1,000 U/ml LIF. Filter sterilize and store at 4 °C for maximum of 2 weeks.
LIF Chemicon ESG1107
DMEM Invitrogen 11960085
Fetal Calf Serum Invitrogen 10099141
Penicillin–streptomycin (100x) Invitrogen 15140-122
Non-essential aminoacids Invitrogen 11140-050
γ-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M7522
ES cell differentiation medium IMDM-Glutamax, 15% heat inactivated fetal calf serum, 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin, non-essential amino acids, 37.8 μl/L monothioglycerol and 50 μg/ml ascorbic acid
IMDM-Glutamax Invitrogen 31980-030
Ascorbic acid (50 mg/ml) Sigma-Aldrich A4403
monothioglycerol Sigma-Aldrich M6145
T25 cell culture dishes Greiner Bio-one 690160
6-well cell culture dishes Greiner Bio-one 662160
cell culture grade PBS Sigma-Aldrich D8537
Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) trypsin/0.2% (w/v) EDTA in PBS Gibco 25200-056
Falcon tubes Falcon 352196
24 x 24 mm coverslips Menzle 780882
gelatin Sigma-Aldrich G1890-100G prepare a 0.2% gelatin/cell culture PBS solution, and autoclave
Pepsin Sigma-Aldrich P7000 Dilute to 0.2% in 0.01 M HCl (pH 2.0)
absolute 100% ethanol Sigma-Aldrich 32221-2.5L use absolute 100% ethanol and RNAse free water to make 70% and 90% ethanol solutions
RNAse free water Baxter TKF7114
sterile filter tips Rainin Bio Clean GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F
digoxigenin-labeling kit (DIG-Nick translation) Roche 11745816910
biotin-labeling kit (Biotin Nick translation) Roche 11745824910
Sephadex G50 Sigma-Aldrich G5080
2 ml syringe BD Plastipak 300013
sterilized cotton
Eppendorf tubes Eppendorf 30120086
yeast tRNA 10 mg/ml Invitrogen 15401-029
Salmon Sperm DNA 10 mg/ml Invitrogen 15632-011
mouse cot-1 DNA 1 mg/ml Invitrogen 18440-016
Eppendorf bench top microcentrifuge Eppendorf Model 5417R
Eppendorf refrigerated centrifuge Eppendorf Model 5810R
2 M NaAc, pH 5.6 Sigma-Aldrich S7670
50+ hybridization solution 50% formamide, 2x SSC, 50 mM phosphate buffer pH 7, 10% dextran sulfate pH 7
formamide Acros organics 3272350000
dextran sulfate Fluka 31403
10 mM phosphate buffer, pH 7 add 57.7 ml of 1 M Na2HPO4 and 42.3 ml 1 M NaH2PO4; use DEPC treated water and autoclave
denaturation buffer 70% formamide/2x SSC/10 mM phosphate buffer pH 7
Tween-20 Sigma-Aldrich P2287
2 M Tris pH 7.5 solution
Tris-saline-Tween washing solution (TST) 100 ml 10x saline, 50 ml 2M Tris, 500 μl Tween-20, add RNAse free water till 1 L
10x saline solution dissolve 85 g NaCl in 1 L RNAse free H2O, and autoclave
Tris-saline-BSA (TSBSA) 500 μl 10x saline, 250 μl 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3.25 ml RNAse free H2O
BSA, purified, 100x New England Biolabs B9001S
sheep-anti-dig antibody Roche diagnostics use 1:500 diluted in TSBSA
rabbit-anti-sheep antibody conjugated with FITC Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
goat-anti-rabbit antibody conjugated with FITC Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
mouse-anti-biotin antibody Roche diagnostics use 1:200 diluted in TSBSA
donkey-anti-mouse antibody conjugated with Rhodamine Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
goat-anti-horse antibody conjugated with Rhodamine Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
Tris-saline washing solution (TS) 10 ml 10x saline, 5 ml 2 M Tris, 85 ml RNAse free H2O
Vectashield mounting medium with DAPI Vectorlabs H-1200
nail varnish
fluorescent miscroscope

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References

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