ADN-ARN combiné Fluorescent

Biology

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Summary

Hybridation in situ fluorescente (FISH) permet la détection d'acides nucléiques de leur environnement natif dans les cellules. Nous décrivons ici un protocole pour le combiné, la détection simultanée de l'ARN et de l'ADN à l'aide de FISH, qui peut être utilisée pour étudier l'inactivation du chromosome X dans les cellules souches embryonnaires de souris.

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Barakat, T. S., Gribnau, J. Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (88), e51628, doi:10.3791/51628 (2014).

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Abstract

Hybridation in situ fluorescente (FISH) est une technique moléculaire qui permet la détection d'acides nucléiques dans les cellules. ADN FISH est souvent utilisée en cytogénétique et diagnostic du cancer, et peut détecter des aberrations du génome, qui a souvent des implications cliniques importantes. ARN FISH peut être utilisée pour détecter des molécules d'ARN dans les cellules et a fourni des renseignements importants dans la régulation de l'expression génique. La combinaison de l'ADN et de l'ARN FISH dans la même cellule est techniquement difficile, que des conditions appropriées pour l'ADN poisson pourrait être trop sévère pour fragiles, molécules d'ARN simple brin. Nous présentons ici un protocole facilement applicable qui permet au combiné, la détection simultanée de Xist ARN et l'ADN codé par les chromosomes X. Ce protocole de FISH ADN-ARN susceptible combiné peut être appliquée à d'autres systèmes où à la fois l'ARN et de l'ADN devant être détecté.

Introduction

Étudier les cellules et les tissus au moyen d'hybridation fluorescente in situ (FISH) a, depuis son introduction à la fin des années 1970 1, a permis aux chercheurs d'étudier les gènes, l'organisation de la chromatine et l'expression des gènes au niveau subcellulaire. ADN FISH est fréquemment utilisée en cytogénétique, caryotype 2, le diagnostic du cancer 3 et pré-implantatoire dépistage génétique 4, et joue un rôle important dans la recherche moléculaire 5-6, car il permet la détection d'acides nucléiques dans leur environnement naturel. Simple analyse d'expression de cellules par l'ARN FISH peut détecter des transcrits primaires indigènes et ARN non codantes étant transcrit à partir de chromosomes, et offre des avantages à d'autres techniques qui évaluent l'expression des gènes au niveau de la population, y compris par exemple RT-PCR quantitative, génome large analyse de l'expression ou Northern blot . En visualisant des transcrits d'ARN provenant directement de leurs sites d'origine, il a par exemple étéa remarqué que l'expression du gène est stochastique 7, et peut être parfois allèle spécifique 8. L'amélioration de la technique ont même permis la détection et la quantification des molécules d'ARNm dans les cellules simples 9-11.

Le principe de base de l'hybridation FISH consiste en des acides nucléiques dans la cellule à une sonde d'acide nucléique au moyen de Watson et Crick d'appariement de bases hautement spécifiques. La sonde peut être directement ou indirectement détectée, résultant en un signal qui peut être visualisée au microscope. Les premières tentatives étaient composés de sondes marquées radioactivement, qui avaient inconvénients en fonction des questions de sécurité, la résolution spatiale limitée et la capacité de détecter une seule cible à la fois 12-14. Le développement ultérieur d'étiquettes non radioactives, y compris les fluorochromes, les haptènes, et des enzymes, a permis l'utilisation répandue de FISH comme une technique de biologie moléculaire de routine. La sonde FISH peut être soit directement marqué avec fluorochromes par liaison chimique des molécules fluorescentes de l'acide nucléique et des séquences de 15 nucleotides de l'intégration de 16 à 19 marquées par fluorescence, ou la sonde peut être visualisé indirectement après intégration des haptènes (y compris la biotine et la digoxigénine) et la détection immunologique d'anticorps spécifiques d'haptènes par haptène conjugué à rapporteur fluorescent molécules 20-21. Cette dernière approche permet une amplification du signal à l'aide de plusieurs couches d'anticorps marqués par fluorescence qui sont utilisés pour améliorer le signal d'origine et permet la détection de l'espèce d'ARN qui sont exprimés à des niveaux faibles. En combinant des techniques de marquage direct et indirect et des haptènes différents, plusieurs cibles peuvent être visualisées simultanément dans la même cellule.

Une des étapes les plus importantes dans les protocoles de poisson est l'hybridation de la sonde à sa cible. Bien qu'en théorie, une sonde se lier spécifiquement seulement à sa cible, dans la pratique, cette spécificitén'est pas toujours atteint, en tant que sondes peuvent se lier à des régions homologues, des conditions d'hybridation et ne seront pas toujours idéale pour une certaine espèce de la région d'ADN ou d'ARN. Les lavages post-hybridation sont donc d'une importance particulière, car ils peuvent augmenter la rigueur de la procédure de FISH, et peuvent empêcher la liaison non spécifique des sondes FISH, qui se traduirait par un niveau élevé de bruit de fond. Comme les molécules d'ARN sont simple brin, ils peuvent facilement être hybridées à une sonde FISH. En revanche, la molécule d'ADN double brin doit tout d'abord une étape de dénaturation, après quoi, une sonde peut s'hybrider. Ceci est généralement obtenu par chauffage de l'échantillon, ce qui entraîne la dénaturation de l'ADN. Cependant, dans ces conditions difficiles, fragiles, molécules d'ARN simple brin peuvent être perdues. Par conséquent, l'ADN-ARN combiné FISH nécessite l'optimisation des conditions importantes, et il est plus difficile techniquement par rapport à la détection de seulement séparée de l'ARN ou de l'ADN.

Ici, nous présentationta protocole détaillé de combinés, simultanée FISH ADN-ARN qui nous a permis d'étudier l'inactivation du chromosome X (XCI) dans la différenciation des cellules souches embryonnaires de souris femelle 22-24. XCI est un mécanisme épigénétique cruciale pour le développement embryonnaire femelle 25, et les résultats en hétérochromatinisation et donc faire taire l'un des deux chromosomes X chez les individus de sexe féminin 26-27. Essentiel de ce processus est la non codantes de l'ARN Xist 28-30, qui est réglementée par les 24 protéines RNF12 22-23 et Rex1. Expression de Xist devient régulée à la hausse sur l'avenir chromosome X inactif (Xi) au cours du développement embryonnaire ou sur la différenciation des cellules ES in vitro , et peuvent se répandre le long du chromosome X et d'attirer ainsi remodelage de la chromatine enzymes qui entraînent la fermeture de la transcription du chromosome X 31. Cet étalement de Xist ARN peut être visualisée par FISH ARN en tant que revêtement du chromosome Xcertains, qui est aussi appelé un nuage de Xist. Comme les cellules ES femmes peuvent perdre un de leurs chromosomes X en raison de l'instabilité génomique, nous et d'autres avons utilisé combiné ADN-ARN FISH pour étudier XCI, pour s'assurer que les cellules ne caryotype stables sont évalués dans l'analyse de cet important processus 22,32 -34. Comme avec toutes les techniques de la biologie moléculaire, plusieurs excellents différents protocoles ont été publiés 35-38. Ici, nous présentons notre méthode, à partir de l'induction de la différenciation des cellules ES de souris, la fixation des cellules, l'étiquetage du poisson sondes par Nick-traduction, pré-traitement des cellules fixées pour permettre la perméabilisation et l'utilisation de la sonde suite, l'hybridation de la sonde à l' cible, et enfin la détection de la sonde par des anticorps marqués par fluorescence. Le protocole présenté ici permet la détection de fidèles ARN Xist et le chromosome X dans un délai de deux jours, et les bases de cette technique peut probablement être adapté à otses systèmes et domaines de recherche.

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Protocol

1. Induction de la différenciation dans Femme cellules souches embryonnaires à induire des inactivation du chromosome X

REMARQUE: Femme de cellules souches embryonnaires de souris (disponible sur demande) sont cultivées dans des conditions de cellules ES standard sur des boîtes de culture gélifiés revêtues de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF). Nous supposons ici que le lecteur est familier avec les techniques de culture cellulaire standard 39-41. Pour induire la différenciation, les cellules ES cultivées dans des boîtes de T25 seront séparés des MEF, et seront étalées dans un milieu de différenciation.

  1. Retirez le milieu ES de la culture de cellules ES, et laver deux fois avec la culture de cellules PBS.
  2. Ajouter 1,5 ml de trypsine-EDTA (préchauffée à 37 ° C), et incuber les cellules à 37 ° C pendant 7 min. Après 3,5 min, secouer le plat délicatement pour briser les colonies.
  3. Inactiver la trypsine-EDTA par addition de 3,5 ml de milieu de différenciation pour les cellules. cellules de pipette de haut en bas pour obtenir une solution d'une seule cellule, et recueillentdans un tube de 15 ml. Spin pendant 5 min à 200 x g, et recueillir les cellules dans 10 ml de milieu de différenciation.
  4. Ajouter la suspension cellulaire à une boîte de culture non-gélatinisé, et incuber pendant 1 h dans un incubateur de culture cellulaire. NOTE: MEF seront capables d'adhérer à la boîte de culture non-gélatinisé, alors que les cellules ES resteront en suspension.
  5. Dans le même temps, ajouter des lamelles de verre stériles (24 x 24 mm) sur des plaques à 6 puits, ajouter 0,2% de gélatine, et incuber pendant un minimum de 5 min à température ambiante.
  6. Après 1 heure, recueillir le surnageant de culture de cellules ES pré-plaqué, qui sont principalement des cellules ES non-adhérents. Plate cellules ES à plaques à 6 puits contenant des lamelles. REMARQUE: Utilisez ⅙ e d'un plat confluent T25 pour 6 puits d'une plaque à 6 puits. Ceci permettra une différenciation confluente bien après 3 jours de différenciation. Changer le milieu sur une base quotidienne. Pour plus des cours de temps de différenciation, les cellules ES plaque pré-plaqués en milieu de différenciation dans les plats bactériennes, et Incubmangé sur un agitateur de cellule intégré dans l'incubateur de culture cellulaire. Cela permettra aux cellules pour former des corps embryoïdes qui peuvent être plaqués à lamelles 1-2 jours avant la fixation.

2. Fixation des cellules différenciées ES pour une analyse ultérieure FISH ADN-ARN

  1. Retirez milieu de différenciation des cultures de différenciation, et laver deux fois avec la culture de cellules PBS. NOTE: Ajouter PBS avec soin pour éviter les cellules emportés.
  2. Retirer culture cellulaire PBS et fixer les cellules en ajoutant 4% de paraformaldéhyde (PFA) / PBS, et laisser incuber pendant 10 min à température ambiante. ATTENTION: PFA est toxique et peut entraîner un risque important pour la santé lorsqu'il est inhalé ou au contact de la peau ou des yeux. En outre, l'IFP est cancérigène.
  3. Retirer 4% PFA / PBS, et laver lamelles 3x avec 70% d'éthanol. NOTE: Corriger lavage est importante, car aucune trace de PFA va interférer avec les étapes ultérieures de POISSON. Les lamelles couvre-peuvent être stockés dans 70% d'éthanol à -20 ° C pendant plusieurs mois avant Fanalyse de l'ISH.

3. Étiquetage des sondes d'ADN pour les expériences de FISH

REMARQUE: Obtenir un fragment d'ADN du gène d'intérêt (longueur minimale> 2 ko pour l'ARN FISH, ou> 20 kb de l'ADN FISH), ou un BAC couvrant le gène d'intérêt. Pour la détection de l'ARN, une sonde plus petite peut être suffisante par rapport à la détection de l'ADN, la transcription depuis le plus probable se traduira par des transcriptions multiples, qui peuvent être détectés simultanément. Pour un signal fort sur le seul brin d'ADN copie, une sonde plus longue est nécessaire, pour être en mesure de détecter un nombre suffisant d'haptènes incorporés. De préférence, une région génomique non transcrite est choisie pour la conception de la sonde d'ADN. En outre, lors de l'utilisation d'une sonde plus petite pour détecter l'ARN, on a empêché que le locus génomique à partir de laquelle l'ARN est transcrit n'est détecté dans l'approche combinée FISH ADN-ARN, bien que cela ne peut pas être entièrement exclue. Pour détecter les souris Xist, une sonde d'ADNc de 5,5 kb a été utilisé. Pour detection du chromosome X, plusieurs sondes BAC peuvent être utilisés. De bons résultats ont été obtenus avec un mélange de BAC RP23-100E1 et 474E4 CT7-BAC, qui sont situés à proximité immédiate du locus Xist. Selon le gène ou d'un chromosome d'intérêt, plusieurs sondes différentes peuvent être nécessaires pour obtenir des résultats optimaux. Pour travailler avec des matériaux qui seront utilisés pour l'ARN-FISH, utiliser des embouts stériles de filtre, RNAse H 2 O, et de travailler dans un environnement propre.

  1. Prendre 1 pg d'ADN et diluer dans H 2 O dans un volume total de 16 pl. Ajouter 4 pi de la digoxigénine ou solution de marquage à la biotine (voir réactifs), mélanger au vortex et incuber à 16 ° C pendant 90 min. NOTE: La biotine ou nucléotides marquées à la digoxigénine seront désormais intégrés par translation de coupure.
  2. Dans le même temps, préparer colonnes G50 pour éliminer les nucléotides non-intégrés. Prendre une seringue de 2 ml, enlever la matrice, et ajouter coton stérilisé dans la seringue. Ajouter les boulettes G50 en solution to remplir la seringue, placer la seringue dans un tube de 15 ml et centrifuger à 642 g pendant 1 min. NOTE: Environ 80% de la seringue doit maintenant être rempli avec G50. Répéter au moins G50 est présent.
  3. Après 90 min, ajouter 40 ul de H 2 O dans le mélange réactionnel de translation de coupure, et à la réaction de la colonne G50. Ajouter un tube vide dans la colonne, et centrifuger à 642 g pendant 2 min. Recueillir dans l'écoulement à travers un tube de réaction.
  4. Mesurer le volume de l'écoulement au travers d'une pipette, ajouter et H 2 O pour atteindre un volume total de 200 pi. Précipiter l'écoulement à travers en ajoutant 13,3 pi de l'ADN de sperme de saumon (10 mg / ml), 13,3 ARNt ul de levure (10 mg / ml), 26,7 pi de souris Cot-1 de l'ADN (1 mg / ml) et 28 ul de 2 M NaAc, pH 5.6. Mélanger au vortex, et ajouter 533 ul glacée 100% d'éthanol. Agiter le tube et centrifuger à 16 200 g pendant 30 min à 4 ° C.
  5. Enlever le surnageant et laver culot deux fois avec 70% d'éthanol. Centrifuger à 16 200 g pendant 5 min à4 ° C, et le culot sécher à l'air. Ajouter 50 ul de solution d'hybridation 50 +, et incuber à 37 ° C pendant 30 minutes pour faciliter la dissolution. REMARQUE: sonde marquée peut être stocké pendant plusieurs années à -20 ° C. ATTENTION: 50 + solution d'hybridation contient du formamide, qui est toxique, peut irriter la peau, les yeux et le système respiratoire, et est également un tératogène.

4. Perméabilisation, pré-traitement et l'hybridation des cellules fixes pour Combined DNA-ARN FISH

  1. Réhydrater les cellules fixées sur des lamelles, en éliminant l'éthanol 70% et l'addition d'une culture de cellules du PBS pour les plaques à 6 puits. Incuber pendant 5 min. Répétez au total trois fois.
  2. Retirer culture cellulaire PBS, et ajouter 0,2% de pepsine pour les plaques à 6 puits, à perméabiliser les cellules. Incuber les plaques à 6 puits dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 4 min. Retirer la pepsine, et inactiver avec RNAse H 2 O.
  3. Cellules post-fixes par incubation avec 4% de PFA / PBS pendant 5 min à température ambiante. Après FIXATIsur, laver deux fois avec une culture de cellules du PBS pendant 5 min.
  4. Déshydrater les cellules par incubation avec de l'éthanol à 70% pendant 3 min, de l'éthanol à 90% pendant 3 min et 100% d'éthanol pendant 3 min. Transfert des lamelles couvre de plaques de 6 puits, et l'air sec des lamelles pendant plusieurs minutes.
  5. les cellules de l'âge selon l'incubation des lamelles à 65 ° C pendant 1 heure sur une plaque chauffante.
  6. Pré-hybridation sonde FISH avec la souris Cot-1 DNA en additionnant pour chaque lamelle à analyser, 25 pi de solution 50 + d'hybridation, 0,5 pi souris Cot-1 DNA, 1 pl de sonde Xist marqué à la biotine et 1 pl de la digoxigénine sonde de BAC marqué détecter le chromosome X. Mélanger au vortex, et dénaturer à 99 ° C pendant 5 min. Incuber immédiatement à 37 ° C pendant 45 minutes, pour permettre à l'ADN Cot-1 de s'hybrider aux séquences répétées présentes dans les sondes.
  7. Après vieillissement, repéré 50 ul de tampon de dénaturation (consistant en 70% de tampon phosphate formamide/2x SSC/10 mM) sur une lame de verre, et les mettre sur le dessus avec des lamelles couvre-face des cellules towards le tampon de dénaturation. Incuber à 65 ° C pendant 2 min.
  8. Ajouter des lamelles à dos des plaques de 6 puits, et les cellules post-fix par incubation dans la glace froide éthanol à 70% pendant 5 min.
  9. Déshydrater les cellules par une incubation ultérieure dans l'éthanol 70% pendant 3 min, de l'éthanol à 90% pendant 3 min et 100% d'éthanol pendant 3 min. Retirez les lamelles de plaques de 6 puits, et laisser sécher à l'air pendant plusieurs minutes.
  10. Repérer sonde pré-hybridée sur une lame de verre, et incuber la lamelle sur le dessus. Placer les lames dans une chambre humide rempli de 50 ml 50% formamide/2x SSC, et incuber une nuit à 37 ° C.

5. Lavage post-hybridation et médiation par les anticorps de détection de la sonde

  1. Remplir des plaques 6 puits avec 2 x SSC, et de pré-chauffer jusqu'à 42 ° C. Ajouter des lamelles après une nuit d'incubation, et incuber à 42 ° C pendant 5 min.
  2. Retirer 2x SSC, et incuber lamelles avec 50% SSC formamide/2x pendant 10 min à 42 ° C. Répétez un total de 3 fois (30 min de lavage au total). Retirer 50% formamide/2x SSC, et laver les lames avec du Tris-saline-Tween (TST) pour 2 x 5 min à température ambiante.
  3. Place 50 ul de Tris-saline-BSA (TSBSA) par lamelle sur les nouvelles lames de verre, et incuber lamelles envers pour bloquer pendant 30 min à température ambiante dans une chambre sombre TST-humidifié.
  4. Transfert retour à lamelles couvre-plaques de 6 puits et laver 2 x 5 min avec TST.
  5. Place 50 ul d'anticorps de mouton anti-dig (1:500 dans TSBSA) par lamelle sur les nouvelles lames de verre, et incuber lamelles à l'envers pour la première étape d'incubation pendant 30 min à température ambiante dans une chambre sombre TST-humidifié.
  6. Transfert retour à lamelles couvre-plaques de 6 puits et laver 2 x 5 min avec TST.
  7. Coin 50 ul d'anticorps de lapin anti-mouton conjugué à FITC (1:250 dans TSBSA) par lamelle couvre-objet sur les nouvelles lames de verre, et incuber lamelles tête en bas pour la seconde étape d'incubation pendant 30 min à température ambiante dans une chambre noire TST-humidifiée .
  8. Transfer lamelles couvre-retour à des plaques 6 puits et laver 2 x 5 min avec TST.
  9. Place 50 ul d'anticorps de chèvre anti-lapin conjugué à la FITC (1:250 dans TSBSA) par lamelle sur les nouvelles lames de verre, et incuber lamelles envers pour l'étape d'incubation troisième pendant 30 min à température ambiante dans une chambre sombre TST-humidifié .
  10. Transfert retour à lamelles couvre-plaques de 6 puits et laver 2 x 5 min avec TST.
  11. Coin 50 pi d'anticorps de souris anti-biotine (1:200 dans TSBSA) par lamelle couvre-objet sur les nouvelles lames de verre, et des lamelles couvre-incuber à l'envers, pour la quatrième étape d'incubation pendant 30 min à température ambiante dans une chambre noire TST-humidifié.
  12. Transfert retour à lamelles couvre-plaques de 6 puits et laver 2 x 5 min avec TST.
  13. Place 50 ul d'anticorps d'âne anti-souris conjugués à la rhodamine (1:250 dans TSBSA) par lamelle sur les nouvelles lames de verre, et incuber lamelles envers pour l'étape d'incubation cinquième pendant 30 min à température ambiante dans une chamb sombre TST-humidifiéer.
  14. Transfert retour à lamelles couvre-plaques de 6 puits et laver 2 x 5 min avec TST.
  15. Place 50 ul d'anticorps de chèvre anti-cheval conjugué à la rhodamine (1:250 dans TSBSA) par lamelle sur les nouvelles lames de verre, et incuber lamelles envers pour la sixième étape de l'incubation pendant 30 min à température ambiante dans une chambre sombre TST-humidifié . REMARQUE: l'anticorps de chèvre anti-cheval de reconnaître l'anticorps d'âne anti-souris; quand à la disposition du chercheur, un anticorps de chèvre anti-âne fonctionnera aussi bien.
  16. Transfert retour à lamelles couvre-plaques de 6 puits et laver 2 x 5 min avec TST. Laver supplémentaire de 5 min avec du Tris-saline (TS).
  17. Déshydrater les cellules par une incubation ultérieure dans l'éthanol 70% pendant 3 min, de l'éthanol à 90% pendant 3 min et 100% d'éthanol pendant 3 min. Retirez les lamelles de plaques de 6 puits, et laisser sécher à l'air pendant plusieurs minutes.
  18. Repérer une goutte de milieu de montage avec DAPI (voir réactifs) sur une lame de verre, et ajouter la lamelle à l'envers sur le dessus. Sceller diapositives avec du vernis à ongles etévaluer les résultats du FISH par microscopie à fluorescence (Figure 1).

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Representative Results

En utilisant le protocole mentionné ci-dessus pour la combinaison de l'ADN-ARN FISH, nous avons pu visualiser inactivation du chromosome X dans la différenciation des cellules souches embryonnaires de sexe féminin. Figure 1 montre un exemple représentatif d'une expérience FISH ADN-ARN, où nous avons détecté la fois Xist (qui est visible en tant que dite ARN Xist nuage sur le chromosome X inactif et une transcription basale ponctuelle sur le chromosome X actif), et une région du chromosome X, qui est visible en tant que signal de pointe d'épingle. Notez que l'un des signaux d'épingles est situé dans le Xist nuage, ce qui montre que le nuage Xist est en effet la localisation le long, et le revêtement de la X chromosome. Dans plus de 99% des cellules, nous détectons l'aide de notre protocole, un signal d'ADN correcte (données non présentées). Par rapport à l'ARN-FISH, nuages ​​Xist visualisés à l'aide de l'ADN-ARN procédure combinée FISH regarde parfois plus grande, comme l'ADN dénaturé semble occuper une plus grande surface. Nous avons obmaintenu des résultats similaires en utilisant des cellules souches embryonnaires humaines, les lymphocytes humains et diverses lignées cellulaires de fibroblastes de diverses espèces, et le même protocole a été appliqué pour étudier l'expression des gènes de différents loci liée à l'X, y compris Rnf12. En outre, lors de ce protocole a été appliqué à des cellules ES non différenciées par des femmes, l'expression de Xist basal des deux chromosomes X a pu être détecté, ce qui montre que l'utilisation de ce protocole également les gènes exprimés à un faible niveau peuvent être visualisées (données non présentées).

Figure 1
Figure 1. Combinée ADN-ARN FISH différenciées des cellules ES femelles. Les résultats représentatifs obtenus après le protocole décrit ici pour combiné ADN-ARN FISH. Le chromosome X (X chr.) Est détecté en utilisant une sonde marquée à la digoxigénine BAC, qui est visualisé en utilisant des anticorps conjugués à FITC (panneau vertal). Dans presque toutes les cellules, deux chromosomes X sont détectés. Xist ARN est détecté en utilisant une sonde d'ADNc marquée à la biotine, qui est visualisé en utilisant des anticorps conjugués à la rhodamine (signal rouge). Les deux grandes accumulations de Xist sur ​​le chromosome X inactif (nuages ​​Xist) et l'expression de Xist base du chromosome X actif (des petits points de Xist) sont détectés (note: lors de la différenciation cette expression de Xist base est a cessé sur l'avenir actif chromosome X, et donc pas détecté dans chaque noyau). Les noyaux sont DAPI (bleu). La barre d'échelle représente 10 um. Cliquez ici pour agrandir l'image.

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Discussion

Combiné ADN-ARN FISH peut être techniquement difficile, que des conditions appropriées pour l'ADN FISH peuvent être trop sévère pour les molécules d'ARN moins stables. Plusieurs approches ont été appliquées pour étudier à la fois l'ADN et l'ARN dans la même cellule, contournant le besoin d'incubation simultanée avec des sondes de détection à la fois l'ADN et l'ARN. Par exemple, dans une approche de superposition, premier poisson d'ARN est réalisée, et les cellules sont imagée, et les coordonnées sont prises. Par la suite, les mêmes lames sont utilisées pour l'ADN FISH, au cours de laquelle le signal de l'ARN FISH est perdue. Après ADN FISH, les cellules sont à nouveau imagés, et les images obtenues à la fois de l'ARN et de l'ADN FISH sont superposées. Bien que cette approche fonctionne dans presque tous les cas, comme l'ADN des cellules fixes est stable et n'est pas affectée par le traitement nécessaire pour les poissons d'ARN initial, il s'agit d'une approche très laborieuse qui coûtera au moins quatre jours. Dans une autre approche, d'abord le FISH ARN est réalisée, le signal FISH ARN est fixé par addition ofixateurs de f, après quoi l'ADN FISH est appliquée. Bien que cette approche peut aussi travailler, une partie du signal fluorescent provenant de l'ARN FISH peut être perdue lors de la fixation. Ceci peut en particulier empêcher la détection de transcrits qui ne sont exprimés à un faible niveau. L'approche présentée ici est optimisée pour la détection simultanée à la fois un ARN cible et une cible d'ADN dans une expérience de FISH unique, et présente l'avantage que les deux résultats peuvent être obtenus dans une expérience unique dans les deux jours, avec des résultats fiables.

Plusieurs étapes du protocole de FISH sont essentiels pour obtenir des résultats optimaux. Tout d'abord, lorsque le traitement avec des molécules d'ARN, il faut veiller à ne pas introduire RNAse dans tout tampon ou solution utilisée. Ainsi, un environnement de travail propre doit être établi, et des conseils de filtre doit être utilisé lorsque les réactifs de pipetage utilisés pour les poissons. Il faut prendre soin d'utiliser des composés sans RNase (par exemple RNase eau libre, catégorie de culture cellulaire PBS, absoluesment éthanol pur, etc.) Lorsque ces règles simples sont suivies, il n'est généralement pas nécessaire d'utiliser des inhibiteurs de RNAse supplémentaires s'ajoutent aux réactifs utilisés. En second lieu, la procédure de perméabilisation en utilisant de la pepsine est un équilibre délicat entre trop peu ou trop de perméabilisation. Selon le type de cellule particulier utilisé, il peut être nécessaire d'optimiser le temps alloué pour la perméabilisation, ou les concentrations de la pepsine. Ce dernier dépend aussi de votre lot particulier de la pepsine, que l'activité peut varier. Comme alternative, la perméabilisation utilisant 0,1% Triton-X100/PBS de 5 résultats min dans de bons résultats dans certaines conditions, et a l'avantage que les poissons en utilisant cette méthode de perméabilisation peut être combiné avec immunomarquage pour détecter les protéines nucléaires ou cytoplasmiques. Dans un troisième aspect important de FISH, les températures vieillissement, dénaturation, hybridation et de lavage doivent être maintenus constants. Même de faibles écarts par rapport à la température cible peut entraîner moins effisamment dénaturation, hybridation, lavages ou moins strictes, ce qui se traduira par plus coloration de fond. Comme alternative à l'étape de vieillissement de 1 heure à 65 ° C suivi par une dénaturation à 65 ° C pendant 2 min, également une dénaturation initiale à 80 ° C pendant 5 minutes, sans vieillissement, peut donner de bons résultats. Nous préférons le processus de vieillissement, comme en général cette procédure donne des signaux ADN FISH plus fiables. Enfin, certaines sondes d'ADN seront tellement précis, de ne pas nécessiter trois couches d'anticorps pour la détection suffisante. Cela devrait être testée empiriquement pour chaque sonde nouvellement généré.

Bien que le protocole actuel fonctionne robuste dans l'étude de l'inactivation du chromosome X et de la détection de Xist, la détection combinée de l'ARN et de l'ADN pourrait être plus compliqué dans d'autres contextes. Cela pourrait être le cas lorsque les espèces d'ARN qui vise à détecter est seulement exprimés à des niveaux très faibles en particulier, est plein de séquences répétées ou est relativement courtetranscription. Dans ces situations, il peut être assez difficile de concevoir une sonde optimale, qui va permettre l'hybridation efficace à une quantité limitée disponible, pas de cible optimale. Dans de telles situations, il peut être intéressant d'optimiser premières conditions de l'ARN FISH. Plusieurs sondes alternatives pourraient être jugés, et la durée de l'étiquetage de la sonde par Nick-traduction pourraient être titrés, d'optimiser la quantité d'haptènes incorporés. Fait important, il convient de vérifier que l'ARN visé est exprimé dans les cellules à étudier, par exemple pour vérifier l'expression par RT-PCR. De même, lorsque l'analyse d'un type de cellules différentes, il est essentiel d'inclure les cellules dans lesquelles l'expression a déjà été détectés comme contrôles positifs, car cela pourrait permettre la distinction entre un problème technique, FISH liées, ou la simple absence d'expression dans le nouveau type des cellules analysées. Lorsque, malgré l'expression vérifiées, l'utilisation de différentes sondes et l'optimisation des conditions d'étiquetage, de l'ARN FISH ne nrésultat ot dans un signal clair, il pourrait être utile de modifier les conditions d'hybridation, en faisant varier la quantité de formamide utilisé, ou de la durée et de la température de la sonde d'hybridation. En variante, des sondes oligonucléotidiques marquées peuvent être directement utilisés 9-10. Les mêmes étapes d'optimisation peuvent ensuite être appliquées pour améliorer la FISH de l'ADN, et la détection simultanée de l'ADN et de l'ARN.

En utilisant le protocole FISH ADN-ARN combinée, nous avons pu étudier inactivation du chromosome X dans la différenciation des cellules ES femelles. Des résultats similaires ont été obtenus dans nos études utilisant différents types de cellules et d'embryons, et nous sommes en train d'optimiser encore les conditions pour appliquer combinée FISH ADN-ARN sur des coupes de tissus. Comme le rôle important des ARN non-codants dans de nombreux processus biologiques devient de plus en plus apprécié, nous prévoyons que le même protocole peut probablement être utilisé pour étudier d'autres ARN non-codants dans le cadre de leur chromatine spécifique.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
female mouse embryonic stem cells will be made available upon request
mouse embryonic fibroblasts can be derived from E13.5 embryos, or via commercial sources e.g. Millipore
ES cell culture medium DMEM, 15% fetal calf serum, 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin, non-essential amino acids, 0.1 mM γ-mercaptoethanol, and 1,000 U/ml LIF. Filter sterilize and store at 4 °C for maximum of 2 weeks.
LIF Chemicon ESG1107
DMEM Invitrogen 11960085
Fetal Calf Serum Invitrogen 10099141
Penicillin–streptomycin (100x) Invitrogen 15140-122
Non-essential aminoacids Invitrogen 11140-050
γ-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M7522
ES cell differentiation medium IMDM-Glutamax, 15% heat inactivated fetal calf serum, 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin, non-essential amino acids, 37.8 μl/L monothioglycerol and 50 μg/ml ascorbic acid
IMDM-Glutamax Invitrogen 31980-030
Ascorbic acid (50 mg/ml) Sigma-Aldrich A4403
monothioglycerol Sigma-Aldrich M6145
T25 cell culture dishes Greiner Bio-one 690160
6-well cell culture dishes Greiner Bio-one 662160
cell culture grade PBS Sigma-Aldrich D8537
Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) trypsin/0.2% (w/v) EDTA in PBS Gibco 25200-056
Falcon tubes Falcon 352196
24 x 24 mm coverslips Menzle 780882
gelatin Sigma-Aldrich G1890-100G prepare a 0.2% gelatin/cell culture PBS solution, and autoclave
Pepsin Sigma-Aldrich P7000 Dilute to 0.2% in 0.01 M HCl (pH 2.0)
absolute 100% ethanol Sigma-Aldrich 32221-2.5L use absolute 100% ethanol and RNAse free water to make 70% and 90% ethanol solutions
RNAse free water Baxter TKF7114
sterile filter tips Rainin Bio Clean GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F
digoxigenin-labeling kit (DIG-Nick translation) Roche 11745816910
biotin-labeling kit (Biotin Nick translation) Roche 11745824910
Sephadex G50 Sigma-Aldrich G5080
2 ml syringe BD Plastipak 300013
sterilized cotton
Eppendorf tubes Eppendorf 30120086
yeast tRNA 10 mg/ml Invitrogen 15401-029
Salmon Sperm DNA 10 mg/ml Invitrogen 15632-011
mouse cot-1 DNA 1 mg/ml Invitrogen 18440-016
Eppendorf bench top microcentrifuge Eppendorf Model 5417R
Eppendorf refrigerated centrifuge Eppendorf Model 5810R
2 M NaAc, pH 5.6 Sigma-Aldrich S7670
50+ hybridization solution 50% formamide, 2x SSC, 50 mM phosphate buffer pH 7, 10% dextran sulfate pH 7
formamide Acros organics 3272350000
dextran sulfate Fluka 31403
10 mM phosphate buffer, pH 7 add 57.7 ml of 1 M Na2HPO4 and 42.3 ml 1 M NaH2PO4; use DEPC treated water and autoclave
denaturation buffer 70% formamide/2x SSC/10 mM phosphate buffer pH 7
Tween-20 Sigma-Aldrich P2287
2 M Tris pH 7.5 solution
Tris-saline-Tween washing solution (TST) 100 ml 10x saline, 50 ml 2M Tris, 500 μl Tween-20, add RNAse free water till 1 L
10x saline solution dissolve 85 g NaCl in 1 L RNAse free H2O, and autoclave
Tris-saline-BSA (TSBSA) 500 μl 10x saline, 250 μl 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3.25 ml RNAse free H2O
BSA, purified, 100x New England Biolabs B9001S
sheep-anti-dig antibody Roche diagnostics use 1:500 diluted in TSBSA
rabbit-anti-sheep antibody conjugated with FITC Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
goat-anti-rabbit antibody conjugated with FITC Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
mouse-anti-biotin antibody Roche diagnostics use 1:200 diluted in TSBSA
donkey-anti-mouse antibody conjugated with Rhodamine Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
goat-anti-horse antibody conjugated with Rhodamine Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
Tris-saline washing solution (TS) 10 ml 10x saline, 5 ml 2 M Tris, 85 ml RNAse free H2O
Vectashield mounting medium with DAPI Vectorlabs H-1200
nail varnish
fluorescent miscroscope

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References

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