ADN-ARN combinado fluorescente

Biology

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Summary

La hibridación fluorescente in situ (FISH) permite la detección de ácidos nucleicos en su ambiente nativo dentro de las células. Se describen un protocolo para el combinado, la detección simultánea de ARN y ADN por medio de pescado, que se puede utilizar para estudiar inactivación del cromosoma X en las células madre embrionarias de ratón.

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Barakat, T. S., Gribnau, J. Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (88), e51628, doi:10.3791/51628 (2014).

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Abstract

La hibridación fluorescente in situ (FISH) es una técnica molecular que permite la detección de ácidos nucleicos en las células. FISH de ADN se utiliza a menudo en la citogenética y el diagnóstico del cáncer, y puede detectar aberraciones del genoma, que a menudo tiene importantes implicaciones clínicas. ARN FISH se puede usar para detectar moléculas de ARN en las células y se ha proporcionado información importante en la regulación de la expresión génica. La combinación de ADN y ARN FISH dentro de la misma célula es técnicamente difícil, ya que las condiciones adecuadas para el ADN de pescado podría ser demasiado fuertes para moléculas de ARN de cadena simple frágiles. Damos a conocer un protocolo de fácil aplicación que permite a la combinada, la detección simultánea de Xist ARN y el ADN codificado por los cromosomas X. Este protocolo FISH de ADN-ARN combinado probable que se puede aplicar a otros sistemas en los que necesitan tanto ARN como ADN para ser detectado.

Introduction

El estudio de las células y los tejidos mediante hibridación in situ fluorescente (FISH), desde su introducción a finales de 1970 1, permite a los investigadores estudiar los genes, la organización de la cromatina y la expresión génica a nivel subcelular. FISH ADN se utiliza con frecuencia en citogenética, cariotipo 2, el diagnóstico del cáncer 3 y antes de la implantación de cribado genético 4, y tiene un papel importante en la investigación molecular de 5-6, ya que permite la detección de ácidos nucleicos en su ambiente nativo. Análisis de la expresión de células individuales por ARN FISH puede detectar transcritos primarios nativas y RNAs no codificantes que se transcribe a partir de cromosomas, y ofrece ventajas a otras técnicas que evalúan la expresión génica a nivel de población, incluyendo, por ejemplo, RT-PCR cuantitativa, análisis de expresión de todo el genoma o transferencia Northern . Mediante la visualización de las transcripciones de ARN procedentes directamente de sus sitios de origen, ha sido, por ejemplo,se dio cuenta de que la expresión génica es estocástico 7, y, a veces puede ser específica de alelo 8. Las mejoras en la técnica incluso han permitido la detección y cuantificación de moléculas de ARNm individuales dentro de las células 9-11.

El principio básico de peces consiste en la hibridación de ácidos nucleicos dentro de la célula a una sonda de ácido nucleico por medio de Watson y Crick de apareamiento de bases altamente específica. La sonda puede ser ya sea directa o indirectamente detectado, dando como resultado una señal que puede ser visualizada microscópicamente. Los intentos iniciales consistieron de sondas marcadas radiactivamente, que tenían inconvenientes sobre la base de las cuestiones de seguridad, resolución espacial limitada y la capacidad de detectar sólo un objetivo a la vez 12-14. El desarrollo posterior de las etiquetas no radiactivos, incluidos fluorocromos, haptenos, y enzimas, ha permitido que el uso generalizado de FISH como una técnica de biología molecular de rutina. La sonda FISH o bien se puede marcar directamente con fluorochromes por reticulación química de moléculas fluorescentes a secuencias de ácido nucleico 15 y la integración de los nucleótidos marcados con fluorescencia 16-19, o la sonda puede ser visualizada indirectamente después de la integración de haptenos (incluyendo biotina y digoxigenina) y detección inmunológica de haptenos por anticuerpos específicos conjugados con haptenos reportero fluorescente moléculas 20-21. El último enfoque permite la amplificación de la señal mediante el uso de varias capas de anticuerpos marcados con fluorescencia que se utilizan para mejorar la señal original, y permite la detección de especies de ARN que se expresan en niveles bajos. Mediante la combinación de técnicas de etiquetado directos e indirectos y diversos haptenos, varios objetivos se pueden visualizar simultáneamente dentro de la misma célula.

Uno de los pasos más importantes en los protocolos de pescado es la hibridación de la sonda con su diana. Aunque, en teoría, una sonda específicamente se unirá sólo a su objetivo, en la práctica, esta especificidadno siempre es logrado, como sondas pueden unirse a regiones homólogas, y condiciones de hibridación no siempre será ideal para una especie determinada región de ADN o de ARN. Los lavados post-hibridación son por lo tanto de particular importancia, ya que pueden aumentar el rigor del procedimiento de FISH, y pueden prevenir la unión no específica de sondas FISH, que daría lugar a un alto nivel de ruido de fondo. Como las moléculas de ARN son de cadena simple que puede ser fácilmente hibridó con una sonda de FISH. En contraste, la molécula de ADN de doble hebra primero necesita una etapa de desnaturalización, después de lo cual una sonda se puede hibridar. Esto se consigue normalmente por calentamiento de la muestra, lo que resulta en la desnaturalización del ADN. Sin embargo, bajo estas duras condiciones, moléculas de ARN de cadena simple frágiles podrían perderse. Por lo tanto, ADN-ARN combinado FISH requiere la optimización significativa de las condiciones, y es técnicamente más difícil en comparación con la detección separada de sólo ARN o ADN.

Aquí Presenta protocolo detallado de combinado, FISH simultánea de ADN-ARN que ha permitido estudiar la inactivación del cromosoma X (XCI) en la diferenciación de células madre embrionarias de ratón hembra 22-24. XCI es un mecanismo epigenético crucial para el desarrollo embrionario hembra 25, y los resultados en heterochromatinization y por lo tanto, el silenciamiento de uno de los dos cromosomas X en individuos femeninos 26-27. Esencial para este proceso es el ARN no codificante de Xist 28-30, que está regulada por los RNF12 22-23 y REX1 24 proteínas. Expresión de Xist se convierte en upregulated en el futuro cromosoma X inactivo (XI) durante el desarrollo embrionario o la diferenciación de células ES in vitro , y pueden expandirse a lo largo del cromosoma X y, por tanto atraer enzimas remodelación de la cromatina que se traducen en el cierre de la transcripción del cromosoma X 31. Esta difusión de Xist ARN pueden ser visualizados por ARN FISH como un revestimiento de la cromosoma Xalgunos, que también se conoce como una nube de Xist. Dado que las células madre embrionarias femeninas pueden perder uno de sus cromosomas X, debido a la inestabilidad genómica, nosotros y otros han empleado combinado de ADN-ARN FISH para estudiar XCI, para asegurarse de que las células sólo cariotípicamente estables son evaluados en el análisis de este importante proceso 22,32 -34. Al igual que con todas las técnicas de la biología molecular, varios protocolos excelentes diferentes han sido publicados 35-38. Aquí presentamos nuestro método, a partir de la inducción de la diferenciación en células ES de ratón, la fijación de las células, el etiquetado de sondas FISH por traslación de mella, el tratamiento previo de las células fijadas para permitir la permeabilización y captación de sonda posterior, la hibridación de la sonda a la objetivo, y finalmente la detección de la sonda por anticuerpos marcados con fluorescencia. El protocolo aquí presentado permite la fiel detección de Xist ARN y el cromosoma X dentro de un período de dos días, y los fundamentos de esta técnica probablemente se puede adaptar a otsus sistemas y áreas de investigación.

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Protocol

1. Inducción de la diferenciación de células madre embrionarias Mujer para inducir inactivación del cromosoma X

NOTA: las células madre embrionarias de ratones hembra (disponibles bajo petición) se cultivan en condiciones normales de células ES en placas de cultivo gelatinizados recubiertas con fibroblastos de embriones de ratón (MEFs). Estamos aquí, suponemos que el lector está familiarizado con las técnicas de cultivo celular convencionales 39-41. Para inducir la diferenciación, las células ES cultivadas en placas de T25 serán separados de las MEFs, y se colocaron en placas en medio de diferenciación.

  1. Retire medio ES a partir del cultivo de células ES, y lavar dos veces con PBS cultivo celular.
  2. Añadir 1,5 ml de tripsina-EDTA (pre-calentado a 37 ° C), y se incuban las células a 37 º C durante 7 min. Después de 3,5 min, agitar el plato suavemente para romper las colonias.
  3. Inactivar la tripsina-EDTA mediante la adición de 3,5 ml de medio de diferenciación a las células. Células de pipeta hacia arriba y abajo para obtener una solución de una sola célula, y recogenen un tubo de 15 ml. Centrifugar durante 5 min a 200 xg, y recoger las células en 10 ml de medio de diferenciación.
  4. Añadir suspensión celular a una placa de cultivo no gelatinizado, y se incuba durante 1 hora en una incubadora de cultivo celular. NOTA: MEFs serán capaces de adherirse a la placa de cultivo no gelatinizado, mientras que las células ES permanecerán en suspensión.
  5. Mientras tanto, añadir cubreobjetos de vidrio esterilizados (24 x 24 mm) para placas de 6 pocillos, agregar 0.2% de gelatina, y se incuba durante un mínimo de 5 minutos a temperatura ambiente.
  6. Después de 1 hora, recoger el sobrenadante del cultivo de células ES pre-plateado, que consistirá principalmente en no adherentes células madre embrionarias. Placa células madre embrionarias a placas de 6 pocillos que contienen cubreobjetos. NOTA: El uso ⅙ ª de un plato T25 confluente de 6 pocillos de una placa de 6 pocillos. Esto permitirá una diferenciación confluentes bien después de 3 días de diferenciación. Cambio de medio en una base diaria. Para los cursos más largos de tiempo, la diferenciación de la placa pre-chapada células ES en medio de diferenciación en platos bacterianas y incubcomió en un agitador de células integrado en la incubadora de cultivo celular. Esto permitirá que las células para formar cuerpos embrioides, que pueden sembrarse a cubreobjetos de 1-2 días antes de la fijación.

2. Fijación de células diferenciadas embrionarias para su posterior análisis FISH de ADN-ARN

  1. Retire medio de diferenciación a partir de cultivos de diferenciación, y lavar dos veces con PBS cultivo celular. NOTA: Agregar PBS con cuidado para evitar que las células se lavan.
  2. Eliminar cultivo celular PBS y fijar las células mediante la adición de 4% de paraformaldehído (PFA) / PBS, y se incuba durante 10 min a temperatura ambiente. PRECAUCIÓN: PFA es tóxico y puede causar riesgo significativo para la salud cuando se inhala o al entrar en contacto con la piel o los ojos. Además, PFA es cancerígeno.
  3. Eliminar 4% de PFA / PBS, y lavar 3x cubreobjetos con etanol al 70%. NOTA: El lavado correcto es importante, ya que cualquier rastro de PFA interfiera con los pasos posteriores de FISH. Los cubreobjetos se pueden almacenar en etanol al 70% a -20 ° C durante varios meses antes de la FEl análisis de ISH.

3. Etiquetado de sondas de ADN para experimentos de FISH

NOTA: Obtenga un fragmento de ADN del gen de interés (longitud mínima> 2 kb de ARN FISH, o> 20 kb de ADN FISH), o una tasa de alcoholemia que abarca el gen de interés. Para la detección de ARN, una sonda más pequeña puede ser suficiente en comparación con la detección de ADN, ya que la mayoría de la transcripción probablemente resultará en múltiples transcripciones, que pueden ser detectados simultáneamente. Para una señal fuerte en la cadena de ADN de copia única, se requiere una sonda más larga, para ser capaz de detectar un número suficiente de haptenos incorporados. Preferiblemente, una región genómica no transcrita se elige para el diseño de la sonda de ADN. Además, cuando se utiliza una sonda más pequeña para detectar el ARN, se puede prevenir que se está detectando la loci del genoma a partir del cual se transcribe el ARN en el enfoque de FISH de ADN-ARN combinado, aunque esto no puede ser totalmente excluido. Para detectar ratón Xist, se utilizó una sonda de ADNc de 5,5 kb. Para detección del cromosoma X, se pueden utilizar varias sondas de BAC. Buenos resultados se han obtenido con una mezcla de BAC RP23-100E1 y BAC CT7-474E4, que se encuentra en estrecha proximidad con el locus de Xist. En función del gen o cromosoma de interés, varias sondas diferentes podrían ser necesarias para obtener resultados óptimos. Cuando se trabaja con materiales que se utilizarán para el ARN-FISH, utilice puntas estériles de filtro, RNAsa H 2 O gratis, y el trabajo en un ambiente limpio.

  1. Tomar 1 g de ADN y se diluye en H 2 O en un volumen total de 16 l. Añadir 4 l de digoxigenina o solución de etiquetado biotina (ver reactivos), mezclar por agitación e incubar a 16 ° C durante 90 min. NOTA: La biotina o nucleótidos marcados con digoxigenina ahora serán incorporados por la mella.
  2. Mientras tanto, preparar columnas G50 para eliminar los nucleótidos no integrados. Tome una jeringa de 2 ml, quite el estampador, y agregue algodón esterilizado en la jeringa. Añadir bolas de G50 en solución de to llenar la jeringa, colocar la jeringa en un tubo de 15 ml y centrifugar a 642 xg durante 1 min. NOTA: En torno al 80% de la jeringa ahora debe estar lleno de G50. Repita cuando menos G50 está presente.
  3. Después de 90 minutos, añadir 40 l de H2O a la mezcla de reacción de la mella, y añade que la reacción a la columna de la G50. Añadir un tubo vacío en la columna, y centrifugar a 642 xg durante 2 min. Recoger el flujo a través de un tubo de reacción.
  4. Medir el volumen del flujo a través con una pipeta, y añadir H2O para llegar a un volumen total de 200 l. Precipitar el flujo a través mediante la adición de 13,3 l de ADN de esperma de salmón (10 mg / ml), 13,3 l de ARNt de levadura (10 mg / ml), 26,7 l ratón ADN Cot-1 (1 mg / ml) y 28 l 2 M de NaAc, pH 5.6. Mezclar por agitación y añadir 533 l de hielo etanol frío al 100%. Agitar el tubo y centrifugar a 16.200 xg durante 30 min a 4 ° C.
  5. Eliminar el sobrenadante y lavar pellet dos veces con etanol al 70%. Se centrifuga a 16200 × g durante 5 min a4 ° C, y el aire seco el sedimento. Añadir 50 l de solución de 50 + de hibridación, y se incuba a 37 ° C durante 30 min para facilitar la disolución. NOTA: sonda marcada se puede almacenar durante varios años a -20 ° C. PRECAUCIÓN: 50 solución de hibridación contiene formamida +, que es tóxico, puede irritar la piel, los ojos y el sistema respiratorio, y también es un teratógeno.

4. Permeabilización, Pre-tratamiento y la hibridación de células fijadas para el Combinado de ADN-ARN FISH

  1. Rehidrate células fijadas en cubreobjetos, mediante la eliminación de etanol al 70% y la adición de cultivo de células de PBS a las placas de 6 pocillos. Incubar durante 5 min. Repita en el total de tres veces.
  2. Eliminar el cultivo de células de PBS, y añadir 0,2% de pepsina a las placas de 6 pocillos, para permeabilizar las células. Incubar las placas de 6 pocillos en un baño de agua a 37 ° C durante 4 min. Retire la pepsina, e inactivar con RNAsa H 2 O. libre
  3. Células post-fix por incubación con 4% PFA / PBS durante 5 min a temperatura ambiente. Después FIJACIÓNen, lavar dos veces con el cultivo de células de PBS durante 5 min.
  4. Deshidratar las células por incubación con etanol al 70% durante 3 min, etanol al 90% durante 3 min y etanol al 100% durante 3 min. Transferencia cubreobjetos de placas de 6 pocillos y cubreobjetos secar al aire durante varios minutos.
  5. Células Edad cubreobjetos incubando a 65 º C durante 1 hora en un plato de calor.
  6. Pre-hibridar la sonda FISH con ratón ADN Cot-1 sumando para cada cubreobjetos para ser analizados, 25 l de solución de hibridación de 50 +, 0,5 l ratón ADN Cot-1, 1 l de sonda de Xist marcado con biotina y 1 l de digoxigenina BAC sonda marcada detectar el cromosoma X. Mezclar por agitación, y desnaturalizar a 99 ° C durante 5 min. Incubar inmediatamente a 37 ° C durante 45 min, para permitir Cot-1 de ADN para hibridar a repetir secuencias presentes en las sondas.
  7. Después del envejecimiento, detectar 50 l de tampón de desnaturalización (que consta de 70% formamide/2x tampón de fosfato SSC/10 mM) en un portaobjetos de vidrio, y poner cubreobjetos en la parte superior con las células frente towarDS El tampón de desnaturalización. Incubar a 65 ° C durante 2 min.
  8. Añadir cubres la espalda a placas de 6 pocillos y las células post-fix incubando en hielo frío etanol al 70% durante 5 min.
  9. Deshidratar las células por incubación posterior en etanol 70% durante 3 min, etanol al 90% durante 3 min y etanol al 100% durante 3 min. Retire cubreobjetos de placas de 6 pocillos y dejar secar al aire durante varios minutos.
  10. Detectar la sonda pre-hibridó en un portaobjetos de vidrio, y se incuba el cubreobjetos en la parte superior. Colocar los portaobjetos en una cámara húmeda llena con 50 ml 50% formamide/2x SSC, y se incuba durante la noche a 37 ° C.

5. Los lavados post-hibridación y detección de anticuerpos mediada por la sonda

  1. Rellene placas de 6 pocillos con 2x SSC, y pre-caliente hasta 42 ° C. Añadir cubreobjetos después de la incubación durante la noche, y se incuba a 42 ° C durante 5 min.
  2. Eliminar 2x SSC, y se incuba cubreobjetos con 50% de SSC formamide/2x durante 10 min a 42 ° C. Repetir un total de 3 veces (30 min de lavado por completo). Retire 50% formamide/2x SSC, y lavar los portaobjetos con Tris-solución salina-Tween (TST) para 2 x 5 min a temperatura ambiente.
  3. Punto 50 l Tris-solución salina-BSA (TSBSA) por cubreobjetos sobre las nuevas placas de vidrio, y se incuba cubreobjetos boca abajo para bloquear durante 30 minutos a temperatura ambiente en una cámara oscura TST-humidificado.
  4. Transferencia cubreobjetos de nuevo a placas de 6 pocillos y lavar 2 x 5 minutos con TST.
  5. Punto 50 l de anticuerpo de oveja anti-dig (1:500 en TSBSA) por cubreobjetos sobre las nuevas placas de vidrio y se incuba cubreobjetos revés para el primer paso de la incubación durante 30 min a temperatura ambiente en una cámara oscura TST-humidificado.
  6. Transferencia cubreobjetos de nuevo a placas de 6 pocillos y lavar 2 x 5 minutos con TST.
  7. Punto 50 l de anticuerpo de conejo anti-oveja conjugado con FITC (1:250 en TSBSA) por cubreobjetos en nuevos portaobjetos de vidrio, y se incuba cubreobjetos boca abajo para la segunda etapa de incubación durante 30 min a temperatura ambiente en una cámara oscura TST-humidificado .
  8. Transfer cubreobjetos de nuevo a placas de 6 pocillos y lavar 2 x 5 minutos con TST.
  9. Punto 50 l de anticuerpo de cabra anti-conejo conjugado con FITC (1:250 en TSBSA) por cubreobjetos sobre las nuevas placas de vidrio, y se incuba cubreobjetos boca abajo durante la tercera etapa de incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente en una cámara oscura TST-humidificado .
  10. Transferencia cubreobjetos de nuevo a placas de 6 pocillos y lavar 2 x 5 minutos con TST.
  11. Punto 50 l de ratón-anti-biotina de anticuerpos (1:200 en TSBSA) por cubreobjetos sobre las nuevas placas de vidrio y se incuba cubreobjetos boca abajo durante la cuarta etapa de la incubación durante 30 min a temperatura ambiente en una cámara oscura TST-humidificado.
  12. Transferencia cubreobjetos de nuevo a placas de 6 pocillos y lavar 2 x 5 minutos con TST.
  13. Punto 50 l de anticuerpo de burro anti-ratón conjugados con rodamina (1:250 en TSBSA) por cubreobjetos sobre las nuevas placas de vidrio y se incuba cubreobjetos boca abajo durante la quinta etapa de la incubación durante 30 min a temperatura ambiente en un chamb oscura humidificado-TSTer.
  14. Transferencia cubreobjetos de nuevo a placas de 6 pocillos y lavar 2 x 5 minutos con TST.
  15. Punto 50 l de anticuerpo de cabra-anti-caballo conjugada con rodamina (1:250 en TSBSA) por cubreobjetos en nuevos portaobjetos de vidrio, y se incuba cubreobjetos boca abajo para la sexta etapa de incubación durante 30 min a temperatura ambiente en una cámara oscura TST-humidificado . NOTA: el anticuerpo de cabra anti-caballo va a reconocer el anticuerpo de burro anti-ratón; cuando esté disponible para el investigador, un anticuerpo de cabra anti-burro funcionará tan bien.
  16. Transferencia cubreobjetos de nuevo a placas de 6 pocillos y lavar 2 x 5 minutos con TST. Lavar 5 min con Tris-salino (TS).
  17. Deshidratar las células por incubación posterior en etanol 70% durante 3 min, etanol al 90% durante 3 min y etanol al 100% durante 3 min. Retire cubreobjetos de placas de 6 pocillos y dejar secar al aire durante varios minutos.
  18. Detectar una gota de medio de montaje con DAPI (ver reactivos) en un portaobjetos de vidrio, y añade cubreobjetos boca abajo en la parte superior. Selle las diapositivas con el barniz de uñas yevaluar los resultados de FISH por microscopía de fluorescencia (Figura 1).

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Representative Results

Usando el protocolo antes mencionado para combinado de ADN-ARN FISH, hemos sido capaces de visualizar inactivación del cromosoma X en la diferenciación de células madre embrionarias femeninas. Figura 1 muestra un ejemplo representativo de un experimento FISH de ADN-ARN, donde se detectó tanto Xist (que es visible como una llamada de Xist ARN nube en el cromosoma X inactivo y un puntito basal de transcripción en el cromosoma X activo), y una región del cromosoma X, que es visible como una señal milimétrica. Tenga en cuenta que una de las señales en forma de puntos se encuentra dentro de la nube de Xist, demostrando así que el Xist nube es, en efecto localizando a lo largo de, y el recubrimiento de la cromosoma X. En más de 99% de las células, se detecta utilizando nuestro protocolo de una señal de ADN correcta (datos no mostrados). En comparación con el ARN-FISH, Xist nubes visualizaron utilizando el procedimiento FISH de ADN-ARN combinado mira a veces más grande, como el ADN desnaturalizado parece ocupar un área más grande. Hemos obcontenida resultados similares usando células madre embrionarias humanas, linfocitos humanos y varias líneas celulares de fibroblastos de diversas especies, y el mismo protocolo se ha aplicado para estudiar la expresión génica de varios loci ligada al cromosoma X, incluyendo Rnf12. Además, cuando este protocolo se aplicó a indiferenciada hembra células ES, la expresión de Xist basales de ambos cromosomas X podría ser detectada, lo que demuestra que el uso de este protocolo también los genes expresados ​​en niveles bajos se pueden visualizar (datos no mostrados).

Figura 1
Figura 1. Combinada de ADN-ARN FISH en células ES diferenciadas femeninos. Los resultados representativos obtenidos después del protocolo descrito en este documento para la combinación de ADN-ARN FISH. El cromosoma X (X CHR.) Se detecta usando una sonda marcada con digoxigenina BAC, que se visualizó usando anticuerpos conjugados con FITC (verde signoal). En casi todas las células, se detectan dos cromosomas X. Xist ARN se detecta usando una sonda de ADNc marcado con biotina, que se visualizó usando anticuerpos conjugados con rodamina (señal roja). Se detectan dos grandes acumulaciones Xist en el cromosoma X inactivo (Xist nubes) y la expresión Xist basal del cromosoma X activo (puntitos Xist) (nota: la diferenciación esta expresión Xist basal se dejó sobre el futuro del cromosoma X activo, y por lo tanto no se detecta en cada núcleo). Los núcleos se counterstained con DAPI (azul). La barra de escala representa 10 micras. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

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Discussion

Combinado de ADN-ARN FISH puede ser técnicamente difícil, ya que las condiciones adecuadas para el ADN FISH pueden ser demasiado fuertes para las moléculas de ARN menos estables. Varios enfoques se han aplicado al estudio de ambos ADN y el ARN en la misma célula, evitando la necesidad de incubación simultánea con sondas de detectar tanto el ADN y el ARN. Por ejemplo, en un enfoque de superposición, se realiza primero FISH ARN y las células son expuestas, y se toman las coordenadas. Posteriormente, los mismos portaobjetos se utilizan para FISH de ADN, durante el cual la señal de ARN FISH se pierde. Después de FISH de ADN, las células están de nuevo reflejados, y las imágenes obtenidas a partir de tanto el ARN y FISH de ADN se superponen. Aunque este enfoque funciona en casi todos los casos, como el ADN de las células fijas es estable, y no se ve afectada por el tratamiento necesario para FISH inicial de ARN, este es un enfoque muy laborioso que costará al menos cuatro días. En otro enfoque, primero se lleva a cabo la FISH ARN, la señal de FISH ARN se fija por adición Ofijadores f, después de lo cual se aplica FISH ADN. Aunque también este enfoque puede funcionar, algunos de la señal fluorescente derivado del ARN FISH se puede perder en la fijación. Esto podría especialmente dificultar la detección de transcripciones que sólo se expresan en un nivel bajo. El enfoque presentado en este documento está optimizado para la detección simultánea de tanto una diana de ARN y una diana de ADN en un solo experimento FISH, y tiene la ventaja de que ambos resultados se pueden obtener en un solo experimento dentro de dos días, con resultados fiables.

Varias etapas del protocolo de FISH son cruciales para obtener resultados óptimos. En primer lugar, al tratar con las moléculas de ARN, uno debe tener cuidado de no introducir RNAsa en cualquier tampón o solución utilizada. Por lo tanto, un ambiente de trabajo limpio debe establecerse, y puntas con filtro se debe utilizar cuando los reactivos de pipeteado se utilizan para FISH. Se debe tener cuidado de usar compuestos libres de RNAsa (por ejemplo, RNasa libre de agua, PBS grado de cultivo celular, absolutosetanol mente pura, etc.) Cuando se siguen estas reglas simples, generalmente no es necesario el uso de inhibidores de RNAsa adicionales añadidos a los reactivos utilizados. En segundo lugar, el procedimiento de permeabilización utilizando pepsina es un equilibrio suave entre demasiado poco o demasiado permeabilización. Dependiendo del tipo celular particular utilizado, puede ser necesario para optimizar el tiempo permitido para la permeabilización, o las concentraciones de pepsina. Este último también depende de su lote particular de la pepsina, ya que la actividad puede variar. Como alternativa, la permeabilización usando 0,1% Triton-X100/PBS durante 5 min en resultados buenos resultados bajo ciertas condiciones, y tiene la ventaja de que FISH utilizando este método de permeabilización puede combinarse con inmunotinción para detectar las proteínas nucleares o citoplasmáticas. Como tercer aspecto importante de FISH, las temperaturas de envejecimiento, de desnaturalización, hibridación y lavado deben mantenerse constantes. Incluso las pequeñas variaciones de la temperatura objetivo puede resultar en menos eficient desnaturalización, hibridación, o lavados menos estrictas, lo que se traducirá en más tinción de fondo. Como una alternativa a la etapa de envejecimiento de 1 hora a 65 ° C seguido de desnaturalización a 65 ° C durante 2 min, también una desnaturalización inicial a 80 ° C durante 5 min, sin envejecimiento, puede dar buenos resultados. Preferimos el proceso de envejecimiento, ya que, en general, este procedimiento da señales de FISH ADN más fiables. Por último, ciertas sondas de ADN serán tan específico, que no requerirán tres capas de anticuerpos para la detección suficiente. Esto debe ser probado empíricamente para cada sonda recién generado.

Aunque el protocolo actual funciona con firmeza en el estudio de la inactivación del cromosoma X y la detección de Xist, la detección combinada de ARN y ADN podría ser más complicado en otros entornos. Esto puede ser especialmente el caso cuando las especies de ARN, y se destina a detectar sólo se expresa en niveles muy bajos, está lleno de secuencias repetidas o es un tiempo relativamente cortotranscripción. En estas situaciones, puede ser bastante difícil diseñar una sonda óptima, lo que permitirá la hibridación eficiente para una cantidad limitada disponible, no óptima del objetivo. En tales situaciones, puede ser que valga la optimización primeras condiciones para ARN FISH. Varias sondas alternativas podrían ser juzgados, y la duración de la sonda de etiquetado por Nick-traducción podría titularse, para optimizar la cantidad de haptenos incorporadas. Es importante destacar, que debe ser verificada que el ARN dirigida se expresa en las células a ser investigadas, por ejemplo para la verificación de la expresión por RT-PCR. También en el análisis de un tipo diferente de células, es esencial incluir células en las que la expresión ha sido previamente detectados como controles positivos, ya que esto podría permitir la distinción entre un pez relacionado problema técnico, o la simple ausencia de expresión en el nuevo tipo de células analizadas. Cuando, a pesar de la expresión verificada, el uso de varias sondas y optimización de las condiciones de etiquetado, el ARN FISH tiene nresultado ot en una clara señal, podría valer la pena el cambio de las condiciones de hibridación, mediante la variación de la cantidad de formamida utilizada, o la duración y la temperatura de la hibridación de la sonda. Alternativamente, las sondas de oligonucleótidos marcadas directamente podrían utilizarse 9-10. Los mismos pasos de optimización posteriormente se pueden aplicar para mejorar FISH de ADN, y la detección simultánea de ADN y ARN.

Utilizando el protocolo FISH de ADN-ARN combinado, hemos sido capaces de estudiar inactivación del cromosoma X en la diferenciación de células ES femeninos. Resultados similares se han obtenido en nuestros estudios utilizando diferentes tipos de células y embriones, y actualmente estamos optimizando aún más las condiciones para aplicar combinada FISH ADN-ARN en cortes de tejido. A medida que el papel importante de los ARN no codificantes en muchos procesos biológicos se vuelve más y más apreciado, prevemos que el mismo protocolo probable puede ser usado para estudiar otros ARN no codificantes en el contexto de su cromatina específica.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
female mouse embryonic stem cells will be made available upon request
mouse embryonic fibroblasts can be derived from E13.5 embryos, or via commercial sources e.g. Millipore
ES cell culture medium DMEM, 15% fetal calf serum, 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin, non-essential amino acids, 0.1 mM γ-mercaptoethanol, and 1,000 U/ml LIF. Filter sterilize and store at 4 °C for maximum of 2 weeks.
LIF Chemicon ESG1107
DMEM Invitrogen 11960085
Fetal Calf Serum Invitrogen 10099141
Penicillin–streptomycin (100x) Invitrogen 15140-122
Non-essential aminoacids Invitrogen 11140-050
γ-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M7522
ES cell differentiation medium IMDM-Glutamax, 15% heat inactivated fetal calf serum, 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin, non-essential amino acids, 37.8 μl/L monothioglycerol and 50 μg/ml ascorbic acid
IMDM-Glutamax Invitrogen 31980-030
Ascorbic acid (50 mg/ml) Sigma-Aldrich A4403
monothioglycerol Sigma-Aldrich M6145
T25 cell culture dishes Greiner Bio-one 690160
6-well cell culture dishes Greiner Bio-one 662160
cell culture grade PBS Sigma-Aldrich D8537
Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) trypsin/0.2% (w/v) EDTA in PBS Gibco 25200-056
Falcon tubes Falcon 352196
24 x 24 mm coverslips Menzle 780882
gelatin Sigma-Aldrich G1890-100G prepare a 0.2% gelatin/cell culture PBS solution, and autoclave
Pepsin Sigma-Aldrich P7000 Dilute to 0.2% in 0.01 M HCl (pH 2.0)
absolute 100% ethanol Sigma-Aldrich 32221-2.5L use absolute 100% ethanol and RNAse free water to make 70% and 90% ethanol solutions
RNAse free water Baxter TKF7114
sterile filter tips Rainin Bio Clean GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F
digoxigenin-labeling kit (DIG-Nick translation) Roche 11745816910
biotin-labeling kit (Biotin Nick translation) Roche 11745824910
Sephadex G50 Sigma-Aldrich G5080
2 ml syringe BD Plastipak 300013
sterilized cotton
Eppendorf tubes Eppendorf 30120086
yeast tRNA 10 mg/ml Invitrogen 15401-029
Salmon Sperm DNA 10 mg/ml Invitrogen 15632-011
mouse cot-1 DNA 1 mg/ml Invitrogen 18440-016
Eppendorf bench top microcentrifuge Eppendorf Model 5417R
Eppendorf refrigerated centrifuge Eppendorf Model 5810R
2 M NaAc, pH 5.6 Sigma-Aldrich S7670
50+ hybridization solution 50% formamide, 2x SSC, 50 mM phosphate buffer pH 7, 10% dextran sulfate pH 7
formamide Acros organics 3272350000
dextran sulfate Fluka 31403
10 mM phosphate buffer, pH 7 add 57.7 ml of 1 M Na2HPO4 and 42.3 ml 1 M NaH2PO4; use DEPC treated water and autoclave
denaturation buffer 70% formamide/2x SSC/10 mM phosphate buffer pH 7
Tween-20 Sigma-Aldrich P2287
2 M Tris pH 7.5 solution
Tris-saline-Tween washing solution (TST) 100 ml 10x saline, 50 ml 2M Tris, 500 μl Tween-20, add RNAse free water till 1 L
10x saline solution dissolve 85 g NaCl in 1 L RNAse free H2O, and autoclave
Tris-saline-BSA (TSBSA) 500 μl 10x saline, 250 μl 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3.25 ml RNAse free H2O
BSA, purified, 100x New England Biolabs B9001S
sheep-anti-dig antibody Roche diagnostics use 1:500 diluted in TSBSA
rabbit-anti-sheep antibody conjugated with FITC Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
goat-anti-rabbit antibody conjugated with FITC Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
mouse-anti-biotin antibody Roche diagnostics use 1:200 diluted in TSBSA
donkey-anti-mouse antibody conjugated with Rhodamine Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
goat-anti-horse antibody conjugated with Rhodamine Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
Tris-saline washing solution (TS) 10 ml 10x saline, 5 ml 2 M Tris, 85 ml RNAse free H2O
Vectashield mounting medium with DAPI Vectorlabs H-1200
nail varnish
fluorescent miscroscope

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References

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