Gecombineerde DNA-RNA-TL

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Fluorescente in situ hybridisatie (FISH) maakt de detectie van nucleïnezuren in hun eigen omgeving binnen cellen. We beschrijven hier een protocol voor gecombineerde, gelijktijdige detectie van RNA en DNA door middel van FISH, die kan worden gebruikt om X-chromosoom inactivatie in muis embryonale stamcellen.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Barakat, T. S., Gribnau, J. Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (88), e51628, doi:10.3791/51628 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Fluorescente in situ hybridisatie (FISH) is een moleculaire techniek die de detectie van nucleïnezuren in cellen mogelijk maakt. DNA FISH wordt vaak gebruikt in cytogenetica en kankerdiagnostiek en kunnen afwijkingen van het genoom, die vaak belangrijke klinische implicaties detecteren. RNA FISH kunnen worden gebruikt om RNA-moleculen te detecteren in cellen en heeft belangrijke inzichten in regulatie van genexpressie verschaft. De combinatie van DNA en RNA FISH binnen dezelfde cel is technisch uitdagend, als omstandigheden die geschikt zijn voor DNA FISH te hard voor fragiele, enkelstrengs RNA-moleculen zou kunnen zijn. We stellen hier een gemakkelijk toepasbare protocol dat de gecombineerde gelijktijdige detectie van Xist RNA en DNA gecodeerd door de X-chromosomen mogelijk maakt. Deze gecombineerde DNA-RNA FISH protocol kan waarschijnlijk worden toegepast op andere systemen waar zowel RNA als DNA moeten worden gedetecteerd.

Introduction

Studeren cellen en weefsels door middel van fluorescente in situ hybridisatie (FISH) is sinds de invoering ervan in de late jaren 1970 1, mogen onderzoekers genen, chromatine organisatie en de genexpressie te bestuderen op het subcellulaire niveau. DNA FISH wordt vaak gebruikt in cytogenetica, karyotypering 2, kankerdiagnostiek 3 en pre-implantatie genetische screening 4, en heeft een belangrijke rol in moleculair onderzoek 5-6 aangezien het de detectie van nucleïnezuren in hun eigen omgeving. Enkele cel expressie analyse op RNA FISH kunnen inheemse primaire transcripten en niet-coderende RNA's worden afgeschreven van chromosomen, en biedt voordelen voor andere technieken die op populatieniveau genexpressie te beoordelen, met inbegrip van bijvoorbeeld kwantitatieve RT-PCR, genoom-wijde expressie analyse of Northern blotting . Door het visualiseren van RNA-transcripten die rechtstreeks afkomstig zijn van hun sites van herkomst, heeft het bijvoorbeeld geweestgemerkt dat genexpressie stochastische 7 en soms allelspecifieke 8 zijn. Verbeteringen in de techniek zijn ook toegestaan ​​de detectie en kwantificering van afzonderlijke mRNA-moleculen in de cellen 9-11.

Het basisprincipe van FISH bestaat uit hybridisatie van nucleïnezuren in de cel een nucleïnezuur probe door zeer specifieke Watson en Crick baseparing. De probe kan direct of indirect gedetecteerd, waardoor een signaal dat microscopisch kan worden gevisualiseerd. Initiële pogingen bestond uit radioactief gemerkte probes die nadelen had gebaseerd op veiligheid, beperkte ruimtelijke resolutie en de mogelijkheid om slechts een doelwit tegelijk 12-14. De verdere ontwikkeling van niet-radioactieve labels, waaronder fluorochromen, haptenen, en enzymen, heeft geleid tot de brede verspreiding gebruik van FISH als een routine moleculaire biologie techniek. De FISH probe kan direct worden gelabeld met fluorochromes door chemische koppeling van fluorescerende moleculen nucleïnezuur sequenties 15 en integratie van fluorescent gemerkte nucleotiden 16-19, of de sonde kan indirect worden gevisualiseerd na integratie van haptenen (zoals biotine en digoxigenine) en immunologische detectie van haptenen met hapteen antilichamen geconjugeerd aan fluorescerende reportermoleculen 20-21. Deze aanpak maakt signaalversterking door verscheidene lagen fluorescerend gemerkte antilichamen die worden gebruikt om het originele signaal te versterken, en maakt de detectie van RNA-soorten die worden uitgedrukt op lage niveaus. Door directe en indirecte labeling technieken en diverse haptenen kunnen meerdere doelen gelijktijdig worden gevisualiseerd binnen dezelfde cel.

Een van de belangrijkste stappen in FISH protocollen is de hybridisatie van de probe aan het doelwit. Hoewel in theorie een probe specifiek alleen binden aan zijn doel in praktijk specificiteitniet altijd bereikt, als probes binden aan homologe gebieden en hybridisatieomstandigheden niet altijd ideaal voor een bepaalde DNA-gebied of RNA soort. Post-hybridisatie wassingen zijn daarom van bijzonder belang, aangezien zij de stringentie van de FISH procedure kan verhogen, en kan voorkomen dat niet-specifieke binding van FISH probes die resulteert in een hoge mate van achtergrondgeluiden. Als RNA-moleculen enkel zijn gestrand zij gemakkelijk kunnen worden gehybridiseerd met een FISH probe. In tegenstelling, het dubbelstrengs DNA-molecuul heeft een eerste denaturatiestap, waarna een probe hybridiseren. Dit wordt gewoonlijk bereikt door verhitting van het monster, waardoor denaturatie van het DNA. Echter, onder deze zware omstandigheden, breekbaar, enkelstrengs RNA-moleculen kunnen verloren gaan. Daarom gecombineerde DNA-RNA FISH vereist aanzienlijke optimalisering van de omstandigheden en is technisch uitdagend vergelijking met de afzonderlijke detectie van enkel RNA of DNA.

Hier presentatie weta gedetailleerd protocol van gecombineerde, gelijktijdige DNA-RNA FISH die heeft ons toegestaan ​​om X-chromosoom inactivatie (XCI) studeren in het onderscheiden vrouwelijke muis embryonale stamcellen 22-24. XCI is een cruciaal epigenetisch mechanisme voor vrouwelijke embryonale ontwikkeling 25, en resulteert in heterochromatinization en dus zwijgen van een van de twee X-chromosomen in vrouwelijke individuen 26-27. Van essentieel belang om dit proces is het niet-coderende RNA Xist 28-30, die wordt gereguleerd door de RNF12 22-23 en REX1 24 eiwitten. Xist expressie wordt gereguleerd op de toekomst inactieve X-chromosoom (Xi) tijdens de embryonale ontwikkeling of bij ES celdifferentiatie in vitro en kunnen zich langs de X-chromosoom en daardoor chromatine remodeling enzymen die leiden tot transcriptionele uitschakeling van het X-chromosoom 31 te trekken. Deze verspreiding van Xist RNA kan door RNA FISH worden gevisualiseerd als een bekleding van de X-chromosommige, die ook wel een Xist cloud. Aangezien vrouwelijke ES-cellen een van hun X-chromosomen als gevolg van instabiliteit van het genoom kan verliezen, hebben wij en anderen werkzaam gecombineerde DNA-RNA FISH om XCI bestuderen, om ervoor te zorgen dat alleen karyotypisch stabiele cellen worden beoordeeld in de analyse van dit belangrijke proces 22,32 -34. Zoals bij elke moleculaire biologie technieken, hebben verschillende uitstekende protocollen gepubliceerd 35-38. Hier presenteren we onze werkwijze, uitgaande van de inductie van differentiatie in muizen ES cellen, fixatie van cellen, kenmerken van FISH probes door nick-translatie, voorbehandeling van gefixeerde cellen om permeabilisatie en daaropvolgende opname probe, hybridisatie van de probe aan de doel, en tenslotte detectie van de probe met fluorescent gemerkte antilichamen. De hierin gepresenteerde protocol kan de gelovigen detectie van Xist RNA en het X-chromosoom binnen een termijn van twee dagen, en de basis van deze techniek kan waarschijnlijk worden aangepast aan othaar systemen en onderzoeksgebieden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Inductie van differentiatie in vrouwelijke embryonale stamcellen aan X-chromosoom inactivatie Braken

OPMERKING: Vrouw muis embryonale stamcellen (op aanvraag) worden geteeld onder standaard ES-cel voorwaarden ontsloten kweekschalen gecoat met muis embryonale fibroblasten (MEF). Wij hier aannemen dat de lezer bekend is met standaard celkweek technieken 39-41. Om differentiatie induceren, wordt ES cellen gekweekt in T25 gerechten worden gescheiden van de MEFs en worden uitgeplaat in differentiatiemedium.

  1. Verwijder ES medium uit de ES-cel cultuur, en twee keer wassen met celkweek PBS.
  2. Voeg 1,5 ml trypsine-EDTA (voorverwarmd tot 37 ° C) en incubeer cellen bij 37 ° C gedurende 7 minuten. Na 3,5 minuten, schud de schotel voorzichtig te breken van de kolonies.
  3. Inactivatie van het trypsine-EDTA door toevoegen van 3,5 ml differentiatiemedium aan de cellen. Pipet cellen omhoog en omlaag om een ​​enkele cel oplossing te verkrijgen, en het verzamelen vanin een 15 ml buisje. Centrifugeren gedurende 5 min bij 200 xg en cellen te verzamelen in 10 ml differentiatiemedium.
  4. Voeg celsuspensie aan een niet-gegeleerd kweekschaal en incubeer gedurende 1 uur in een celkweek incubator. OPMERKING: MEF kunnen toetreden tot de niet-gegeleerde kweekschaal wordt, dat ES cellen in suspensie blijven.
  5. Ondertussen voeg gesteriliseerde glazen dekglaasjes (24 x 24 mm) tot 6-well platen, voeg 0,2% gelatine en incubeer gedurende minimaal 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
  6. Na 1 uur, verzamel de bovenstaande vloeistof van de pre-plated ES celcultuur, die hoofdzakelijk bestaan ​​uit niet-hechtende ES-cellen. Plate ES cellen 6-well platen met dekglaasjes. OPMERKING: Gebruik ⅙ e van een confluente T25 schotel voor 6 putjes van een 6-wells plaat. Dit zal een samenvloeiing differentiatie mogelijk te maken en na 3 dagen van differentiatie. Verander medium op een dagelijkse basis. Voor langere differentiatie tijd cursussen, plaat pre-plated ES-cellen in differentiatiemedium in bacteriële gerechten, en incubaten op een cel shaker geïntegreerd in de celkweek incubator. Hierdoor kan de cellen embryoid organen, waarvan dekglaasjes kunnen worden uitgeplaat 1-2 dagen voor fixatie vormen.

2. Bevestiging van gedifferentieerde ES cellen voor latere DNA-RNA FISH analyse

  1. Verwijder differentiatiemedium uit differentiatie culturen, en tweemaal wassen met celkweek PBS. OPMERKING: Voeg PBS voorzichtig om te voorkomen dat cellen worden weggespoeld.
  2. Verwijder celkweek PBS en zet cellen door toevoeging van 4% paraformaldehyde (PFA) / PBS en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. LET OP: PFA is giftig en kan significant risico voor de gezondheid opleveren wanneer ze ingeademd of wanneer het in contact op de huid of ogen. Bovendien PFA is kankerverwekkend.
  3. Verwijder 4% PFA / PBS, en was dekglaasjes 3x met 70% ethanol. OPMERKING: Correct wassen is belangrijk, omdat elk spoor van PFA zal interfereren met latere FISH stappen. Dekglaasjes worden opgeslagen in 70% ethanol bij -20 ° C gedurende enkele maanden voor FISH analyse.

3. Labeling van DNA probes voor FISH Experimenten

LET OP: Zorg voor een DNA-fragment van het gen van belang (minimale lengte> 2 kb voor RNA FISH, of> 20 kb voor DNA FISH), of een BAC die het gen van belang. Voor RNA-detectie, kan een kleinere sonde voldoende opzichte DNA detectie, aangezien waarschijnlijk transcriptie zal leiden tot meervoudige transcripten, die gelijktijdig kunnen worden gedetecteerd. Voor een sterk signaal op de kopie DNA-streng, is een langere probe nodig, kunnen voldoende opgenomen haptenen detecteren. Bij voorkeur wordt een niet-getranscribeerde genomisch gebied gekozen ontwerpen van de DNA probe. Bovendien, wanneer een kleinere sonde naar RNA te detecteren, zal worden voorkomen dat de genomische loci waarvan het RNA wordt getranscribeerd wordt gedetecteerd in de gecombineerde DNA-RNA FISH benadering, hoewel dit niet volledig worden uitgesloten. Om muis Xist detecteren, werd een 5,5 kb cDNA-probe gebruikt. Voor detectie van het X-chromosoom, kan verschillende BAC probes worden gebruikt. Goede resultaten zijn verkregen met een mengsel van BAC RP23-100E1 en BAC CT7-474E4, die zich bevinden in de nabijheid van de Xist locus. Afhankelijk van het gen of chromosoom plaats kan verschillende probes vereist voor optimale resultaten. Wanneer het werken met materialen die zullen worden gebruikt voor RNA-FISH, gebruik steriel filter tips, RNAse vrij H 2 O, en werken in een schone omgeving.

  1. Neem 1 ug DNA en verdund in H2O in een totaal volume van 16 pl. Voeg 4 ul van digoxigenine of biotine etikettering oplossing (zie reagentia), meng door vortexen en incubeer bij 16 ° C gedurende 90 minuten. OPMERKING: De biotine of digoxigenine-gelabelde nucleotiden zal nu door nick-translatie worden opgenomen.
  2. In de tussentijd bereiden G50 kolommen aan niet-geïntegreerde nucleotiden te verwijderen. Neem een ​​spuit 2 ml, verwijder de stamper en voeg gesteriliseerd katoen in de spuit. Voeg G50 ballen in oplossing to vul de spuit, plaats spuit in een 15 ml buis en centrifugeer bij 642 xg gedurende 1 minuut. OPMERKING: Ongeveer 80% van de spuit moet nu worden gevuld met G50. Herhaal wanneer minder G50 aanwezig is.
  3. Na 90 min, voeg 40 ui H2O de nick-translatie reactiemengsel en voeg de reactie op de kolom G50. Voeg een lege buis onder de kolom en centrifugeer bij 642 xg gedurende 2 minuten. Verzamel de stroom door een reactiebuis.
  4. Meet het volume van de stroming door met een pipet en voeg H2O tot een totaal volume van 200 pi te bereiken. Neerslag de doorstroming door toevoeging van 13,3 ul zalmsperma DNA (10 mg / ml), 13,3 ul tRNA (10 mg / ml), 26,7 pl muis Cot-1 DNA (1 mg / ml) en 28 ui 2 M NaAc, pH 5.6. Meng door vortexen, en voeg 533 ul ijskoude 100% ethanol. Schud de buis en centrifugeer bij 16.200 xg gedurende 30 min bij 4 ° C.
  5. Verwijder de supernatant en was de pellet twee keer met 70% ethanol. Centrifugeer bij 16.200 xg gedurende 5 minuten bij4 ° C en de lucht droog de pellet. Voeg 50 ul van 50 + hybridisatie-oplossing en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten om het oplossen te vergemakkelijken. OPMERKING: Gemerkte probe kan worden opgeslagen voor meerdere jaren bij -20 ° C. LET OP: 50 + hybridisatie-oplossing bevat formamide, dat giftig is, kan de huid, ogen en luchtwegen irriteren, en is ook een teratogeen.

4. Permeabilisatie, Voorbehandeling en hybridisatie van Vaste Cellen voor gecombineerde DNA-RNA FISH

  1. Hydrateren gefixeerde cellen op dekglaasjes, door het verwijderen van 70% ethanol en toevoeging van celkweek PBS om de 6-well platen. Incubeer gedurende 5 minuten. Herhaal in totaal drie keer.
  2. Verwijder celkweek PBS en voeg 0,2% pepsine de 6-well platen, om de cellen te permeabiliseren. Incubeer 6-well platen in een waterbad bij 37 ° C gedurende 4 minuten. Verwijder pepsine en inactiveren met RNAse vrij H2O
  3. Post-fix cellen door incubatie met 4% PFA / PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Na fixatiop, was tweemaal met celkweek PBS gedurende 5 minuten.
  4. Uitdrogen cellen door incubatie met 70% ethanol gedurende 3 min, 90% ethanol gedurende 3 min en 100% ethanol gedurende 3 minuten. Overdracht coverslips van de 6-well platen, en de lucht drogen dekglaasjes gedurende enkele minuten.
  5. Leeftijd cellen door incubatie dekglaasjes bij 65 ° C gedurende 1 uur op een verwarmingsplaat.
  6. Pre-FISH probe hybridiseren met muizen Cot-1 DNA door optelling van elke dekglaasje te analyseren, 25 gl 50 + hybridisatieoplossing, 0,5 pi muis Cot-1 DNA, 1 ui met biotine gelabelde probe Xist en 1 pl digoxigenine BAC gemerkte probe detecteren van het X-chromosoom. Meng door vortexen en denatureren bij 99 ° C gedurende 5 minuten. Onmiddellijk Incubeer bij 37 ° C gedurende 45 minuten, zodat Cot-1 DNA te hybridiseren met sequenties in de probes herhalen.
  7. Na veroudering, spot 50 pl denaturatie buffer (bestaande uit 70% formamide/2x SSC/10 mM fosfaatbuffer) op een glasplaatje, en zet dekglaasjes geplaatst met cellen naar towards de denaturatiebuffer. Incubeer bij 65 ° C gedurende 2 minuten.
  8. Dekglaasjes naar 6-well platen en na correctie cellen toevoegen door incuberen in ijskoude 70% ethanol gedurende 5 minuten.
  9. Uitdrogen cellen door daaropvolgende incubatie in 70% ethanol gedurende 3 min, 90% ethanol gedurende 3 min en 100% ethanol gedurende 3 minuten. Verwijder dekglaasjes van 6-well platen, en laat drogen aan de lucht gedurende een aantal minuten.
  10. Spot vooraf gehybridiseerde probe op een glasplaatje, en incubeer dekglaasje geplaatst. Plaats de glaasjes in een bevochtigde kamer gevuld met 50 ml 50% formamide/2x SSC en incubeer overnacht bij 37 ° C.

5. Post-hybridisatie Wast en antilichaam-gemedieerde Detectie van Probe

  1. Fill 6-well platen met 2x SSC en pre-warm tot 42 ° C. Dekglaasjes Voeg na overnacht incubatie, en incubeer bij 42 ° C gedurende 5 minuten.
  2. Verwijder 2x SSC en incubeer dekglaasjes met 50% formamide/2x SSC gedurende 10 minuten bij 42 ° C. Herhaal dit in totaal 3 keer (30 min wassen in totaal). Verwijder 50% formamide/2x SSC en wassen dia's met Tris-zoutoplossing-Tween (TST) voor 2 x 5 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Spot 50 pl Tris-zout-BSA (TSBSA) per dekglaasje op nieuwe glazen dia's, en incubeer dekglaasjes ondersteboven voor het blokkeren gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in een TST-bevochtigde donkere kamer.
  4. Transfer coverslips terug naar 6-well platen, en was 2 x 5 minuten met TST.
  5. Vlek 50 ul schapen-anti-DIG antistof (1:500 in TSBSA) per dekglaasje nieuwe glasplaatjes en incubeer dekglaasjes ondersteboven de eerste incubatiestap gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in een vochtige TST-donkere kamer.
  6. Transfer coverslips terug naar 6-well platen, en was 2 x 5 minuten met TST.
  7. Spot 50 ul van konijn-anti-schaap antilichaam geconjugeerd met FITC (1:250 in TSBSA) per dekglaasje op nieuwe glazen dia's, en incubeer dekglaasjes ondersteboven voor de tweede incubatie stap gedurende 30 min bij kamertemperatuur in een TST-bevochtigde donkere kamer .
  8. Transfer coverslips terug naar 6-well platen, en was 2 x 5 minuten met TST.
  9. Vlek 50 gl geit-anti-konijn-antilichaam geconjugeerd met FITC (1:250 in TSBSA) per dekglaasje nieuwe glasplaatjes en incubeer dekglaasjes ondersteboven derde incubatiestap gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in een vochtige TST-donkere kamer .
  10. Transfer coverslips terug naar 6-well platen, en was 2 x 5 minuten met TST.
  11. Vlek 50 pl muis anti-biotine antilichaam (1:200 in TSBSA) per dekglaasje nieuwe glasplaatjes en incubeer dekglaasjes ondersteboven vierde incubatiestap gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in een vochtige TST-donkere kamer.
  12. Transfer coverslips terug naar 6-well platen, en was 2 x 5 minuten met TST.
  13. Spot 50 ul van ezel-anti-muis antilichaam geconjugeerd met Rhodamine (1:250 in TSBSA) per dekglaasje op nieuwe glazen dia's, en incubeer dekglaasjes ondersteboven voor de vijfde incubatie stap gedurende 30 min bij kamertemperatuur in een TST-bevochtigde donkere chambER.
  14. Transfer coverslips terug naar 6-well platen, en was 2 x 5 minuten met TST.
  15. Spot 50 ul van geit-anti-paard antilichaam geconjugeerd met Rhodamine (1:250 in TSBSA) per dekglaasje op nieuwe glazen dia's, en incubeer dekglaasjes ondersteboven voor de zesde incubatie stap gedurende 30 min bij kamertemperatuur in een TST-bevochtigde donkere kamer . OPMERKING: de geit-anti-paard antilichaam zal de ezel-anti-muis antilichaam herkennen; bij beschikking van de onderzoeker, zal een geit-anti-ezel antilichaam zo goed werkt.
  16. Transfer coverslips terug naar 6-well platen, en was 2 x 5 minuten met TST. Was eens 5 min met Tris-zoutoplossing (TS).
  17. Uitdrogen cellen door daaropvolgende incubatie in 70% ethanol gedurende 3 min, 90% ethanol gedurende 3 min en 100% ethanol gedurende 3 minuten. Verwijder dekglaasjes van 6-well platen, en laat drogen aan de lucht gedurende een aantal minuten.
  18. Spot een daling van montage medium met DAPI (zie reagentia) op een glasplaatje, en voeg dekglaasje omgekeerd op. Seal dia's met nagellak enFISH resultaten te beoordelen door fluorescentie microscopie (figuur 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Met behulp van bovenstaande protocol voor gecombineerde DNA-RNA FISH, konden we X-chromosoom inactivatie visualiseren differentiëren vrouwelijke embryonale stamcellen zijn. Figuur 1 toont een representatief voorbeeld van een DNA-RNA FISH experiment waarbij we zowel Xist (die herkend zichtbaar als een zogenaamde Xist RNA wolk op het inactieve X-chromosoom en een basale transcriptie lokaliseren op actieve X-chromosoom), en een gebied van het X-chromosoom, die zichtbaar als lokaliseren signaal. Merk op dat een van de pinpoint signalen is gelegen binnen de Xist wolk, daarmee het bewijs dat de Xist cloud inderdaad lokaliseren langs, en het bekleden van het X-chromosoom. In meer dan 99% van de cellen, detecteren we met behulp van ons protocol een correcte DNA-signaal (gegevens niet getoond). In vergelijking met RNA-FISH, Xist wolken gevisualiseerd met behulp van de gecombineerde DNA-RNA FISH procedure kijkt soms groter, als het gedenatureerde DNA lijkt een groter gebied bezetten. We hebben obgehandhaafd soortgelijke resultaten met humane ES-cellen, humane lymfocyten en verschillende fibroblast cellijnen van verschillende soorten, en hetzelfde protocol is toegepast om genexpressie van verschillende loci X-gebonden, waaronder Rnf12 bestuderen. Bovendien, wanneer dit protocol werd toegepast op ongedifferentieerde cellen van vrouwelijke, Xist basale expressie van zowel X-chromosomen worden gedetecteerd, hetgeen aantoont dat met dit protocol ook genen die op een laag niveau kan worden gevisualiseerd (gegevens niet getoond).

Figuur 1
Figuur 1. Gecombineerde DNA-RNA FISH gedifferentieerde vrouwelijke ES-cellen. Representatieve resultaten verkregen na het hierin beschreven protocol voor gecombineerde DNA-RNA FISH. Het X-chromosoom (X chr.) Wordt gedetecteerd met een digoxigenine-gemerkte probe BAC, die gevisualiseerd met behulp van antilichamen geconjugeerd aan FITC (groen bordal). In bijna elke cel worden twee X-chromosomen gedetecteerd. Xist RNA gedetecteerd met biotine gelabelde cDNA-probe, die gevisualiseerd met behulp van antilichamen geconjugeerd aan rhodamine (rood signaal). Zowel grote Xist ophopingen op het inactieve X-chromosoom (Xist wolken) en basale Xist expressie van de actieve X-chromosoom (Xist pinpoints) worden gedetecteerd (let op: na differentiatie deze basale Xist uitdrukking wordt gestaakt op de toekomst actieve X-chromosoom, en dus niet gedetecteerd in elke kern). Kernen zijn tegengekleurd met DAPI (blauw). Schaal balk geeft 10 micrometer. Klik hier voor grotere afbeelding.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Gecombineerde DNA-RNA vis kan worden technisch uitdagend, als omstandigheden die geschikt zijn voor DNA FISH te hard voor minder stabiele RNA-moleculen kunnen worden. Verschillende benaderingen zijn toegepast op zowel DNA als RNA studie in dezelfde cel, omzeilen de noodzaak voor gelijktijdige incubatie met probes detecteren zowel DNA en RNA. Bijvoorbeeld, in een superpositie benadering wordt eerst RNA FISH uitgevoerd en de cellen worden afgebeeld en coördinaten worden genomen. Vervolgens worden dezelfde slides gebruikt voor DNA FISH, waarbij het signaal van RNA FISH verloren. Na DNA FISH worden de cellen opnieuw afgebeeld, en de resultaten van zowel de RNA en DNA FISH beelden worden gesuperponeerd. Hoewel deze benadering werkt in bijna alle gevallen, zoals het DNA van gefixeerde cellen stabiel en wordt niet beïnvloed door de behandeling van initiële RNA FISH, is dit een zeer moeizaam benadering die ten minste vier dagen kost. In een andere benadering wordt eerst de RNA FISH wordt uitgevoerd, de RNA FISH signaal vastgesteld bij toevoeging of fixatieven, waarna DNA FISH toegepast. Hoewel deze benadering kan werken, sommige fluorescerende signaal afgeleid van het RNA FISH verloren kan gaan bij fixatie. Dit kan vooral belemmeren detectie van transcripten die alleen tot expressie op een laag niveau. De hierin gepresenteerde aanpak is geoptimaliseerd voor de gelijktijdige detectie van een RNA-doel en een DNA-doelmateriaal in een FISH experiment, en heeft het voordeel dat beide resultaten kunnen worden verkregen in een enkel experiment binnen twee dagen met betrouwbare resultaten.

Verschillende stappen in het FISH protocol zijn cruciaal om optimale resultaten te verkrijgen. Eerste, wanneer het omgaan met RNA-moleculen, moet men oppassen niet RNAse te voeren in een buffer of oplossing gebruikt. Daarom moet een schone werkomgeving worden vastgesteld, en filter tips moet worden gebruikt bij het pipetteren reagentia worden gebruikt voor FISH. Zorg moeten worden genomen om RNAse vrije verbindingen (bijvoorbeeld RNAse vrij water, celkweek graad PBS, absolute gebruikenly zuivere ethanol enz.). Wanneer deze eenvoudige regels gevolgd, is het meestal niet nodig om extra RNAse remmers aangevuld gebruikte reagentia gebruiken. Ten tweede, de permeabilisatie procedure met pepsine is een zachte balans tussen te weinig of te veel permeabilisatie. Afhankelijk van het specifieke celtype gebruikt, kan het nodig zijn om de termijn voor permeabilisatie, of de pepsine concentraties optimaliseren. De laatste is ook afhankelijk uw specifieke partij pepsine, de activiteit kan variëren. Als alternatief permeabilisatie met 0,1% Triton-X100/PBS gedurende 5 min resulteert in goede resultaten onder bepaalde omstandigheden, en heeft het voordeel dat FISH deze methode van permeabilisatie combineren met immunokleuring nucleaire en cytoplasmatische eiwitten te detecteren. Als derde belangrijke aspect van FISH, dient de veroudering, denaturatie, hybridisatie en wastemperaturen constant gehouden. Zelfs kleine afwijkingen van de gewenste temperatuur tot minder efficient denaturatie, hybridisatie of minder strenge wast, die zal resulteren in meer achtergrondkleuring. Als alternatief voor de 1 uur verouderingsstap bij 65 ° C gevolgd door denaturatie bij 65 ° C gedurende 2 min, ook een initiële denaturatie bij 80 ° C gedurende 5 min, zonder veroudering, kan goede resultaten geven. Wij verkiezen het verouderen procedure, zoals in het algemeen deze procedure geeft meer betrouwbare DNA FISH signalen. Tenslotte zullen bepaalde DNA-probes zo specifiek zijn, dat zij niet drie lagen antilichamen voldoende detectie vereist. Dit moet empirisch worden getest voor elke nieuw gegenereerde probe.

Hoewel het huidige protocol werkt krachtig in de studie van X-chromosoom inactivatie en detectie van Xist, gecombineerde detectie van RNA en DNA kunnen ingewikkelder andere instellingen. Dit kan het geval zijn wanneer het RNA soorten die gericht te detecteren slechts uitgedrukt op zeer lage niveaus bijzonder zijn vol repeat sequenties of een relatief kortetranscript. In deze situaties kan het nogal moeilijk om een ​​optimale sonde, die de efficiënte hybridisatie zal een beperkte, niet optimaal beschikbare hoeveelheid doel ontwerpen. In dergelijke situaties, is het misschien de moeite waard het optimaliseren van de eerste voorwaarden voor RNA FISH. Verschillende alternatieve sondes kunnen worden berecht, en de duur van de sonde etikettering door Nick-vertaling kon worden getitreerd, om de hoeveelheid opgenomen haptens optimaliseren. Belangrijk is, moet worden nagegaan of de beoogde RNA wordt uitgedrukt in de cellen worden onderzocht, bijvoorbeeld door controle expressie door RT-PCR. Ook bij de analyse van een ander type cellen, is het essentieel om cellen waarin de expressie is waargenomen als positieve controle, aangezien dit het onderscheid tussen een technisch FISH gerelateerd probleem of de simpele afwezigheid van expressie van het nieuwe type kan mogelijk zijn geanalyseerde cellen. Wanneer ondanks gecontroleerde expressie, het gebruik van verschillende probes en optimalisatie van etiketteringsvoorwaarden, RNA FISH doet not resulteren in een duidelijk signaal, kan het de moeite waard het veranderen van de hybridisatieomstandigheden worden door variëren van de hoeveelheid formamide gebruikt, of de duur en temperatuur van probe hybridisatie. Als alternatief zou direct gelabelde oligonucleotide probes worden gebruikt 9-10. Dezelfde optimalisaties kunnen vervolgens worden toegepast om DNA FISH en de gelijktijdige detectie van DNA en RNA verbeteren.

Met behulp van de gecombineerde DNA-RNA FISH protocol, hebben we in staat om X-chromosoom inactivatie studeren in het onderscheiden vrouwelijke ES-cellen geweest. Soortgelijke resultaten werden verkregen in onze studies met verschillende celtypes en embryo en we nog verdere optimalisering voorwaarden gecombineerde DNA-RNA FISH toegepast op weefselcoupes. Aangezien de belangrijke rol van niet-coderende RNA's in vele biologische processen wordt steeds meer gewaardeerd voorzien we dat hetzelfde protocol waarschijnlijk kan worden gebruikt om andere niet-coderende RNA's te bestuderen in het kader van hun specifieke chromatine.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
female mouse embryonic stem cells will be made available upon request
mouse embryonic fibroblasts can be derived from E13.5 embryos, or via commercial sources e.g. Millipore
ES cell culture medium DMEM, 15% fetal calf serum, 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin, non-essential amino acids, 0.1 mM γ-mercaptoethanol, and 1,000 U/ml LIF. Filter sterilize and store at 4 °C for maximum of 2 weeks.
LIF Chemicon ESG1107
DMEM Invitrogen 11960085
Fetal Calf Serum Invitrogen 10099141
Penicillin–streptomycin (100x) Invitrogen 15140-122
Non-essential aminoacids Invitrogen 11140-050
γ-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M7522
ES cell differentiation medium IMDM-Glutamax, 15% heat inactivated fetal calf serum, 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin, non-essential amino acids, 37.8 μl/L monothioglycerol and 50 μg/ml ascorbic acid
IMDM-Glutamax Invitrogen 31980-030
Ascorbic acid (50 mg/ml) Sigma-Aldrich A4403
monothioglycerol Sigma-Aldrich M6145
T25 cell culture dishes Greiner Bio-one 690160
6-well cell culture dishes Greiner Bio-one 662160
cell culture grade PBS Sigma-Aldrich D8537
Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) trypsin/0.2% (w/v) EDTA in PBS Gibco 25200-056
Falcon tubes Falcon 352196
24 x 24 mm coverslips Menzle 780882
gelatin Sigma-Aldrich G1890-100G prepare a 0.2% gelatin/cell culture PBS solution, and autoclave
Pepsin Sigma-Aldrich P7000 Dilute to 0.2% in 0.01 M HCl (pH 2.0)
absolute 100% ethanol Sigma-Aldrich 32221-2.5L use absolute 100% ethanol and RNAse free water to make 70% and 90% ethanol solutions
RNAse free water Baxter TKF7114
sterile filter tips Rainin Bio Clean GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F
digoxigenin-labeling kit (DIG-Nick translation) Roche 11745816910
biotin-labeling kit (Biotin Nick translation) Roche 11745824910
Sephadex G50 Sigma-Aldrich G5080
2 ml syringe BD Plastipak 300013
sterilized cotton
Eppendorf tubes Eppendorf 30120086
yeast tRNA 10 mg/ml Invitrogen 15401-029
Salmon Sperm DNA 10 mg/ml Invitrogen 15632-011
mouse cot-1 DNA 1 mg/ml Invitrogen 18440-016
Eppendorf bench top microcentrifuge Eppendorf Model 5417R
Eppendorf refrigerated centrifuge Eppendorf Model 5810R
2 M NaAc, pH 5.6 Sigma-Aldrich S7670
50+ hybridization solution 50% formamide, 2x SSC, 50 mM phosphate buffer pH 7, 10% dextran sulfate pH 7
formamide Acros organics 3272350000
dextran sulfate Fluka 31403
10 mM phosphate buffer, pH 7 add 57.7 ml of 1 M Na2HPO4 and 42.3 ml 1 M NaH2PO4; use DEPC treated water and autoclave
denaturation buffer 70% formamide/2x SSC/10 mM phosphate buffer pH 7
Tween-20 Sigma-Aldrich P2287
2 M Tris pH 7.5 solution
Tris-saline-Tween washing solution (TST) 100 ml 10x saline, 50 ml 2M Tris, 500 μl Tween-20, add RNAse free water till 1 L
10x saline solution dissolve 85 g NaCl in 1 L RNAse free H2O, and autoclave
Tris-saline-BSA (TSBSA) 500 μl 10x saline, 250 μl 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3.25 ml RNAse free H2O
BSA, purified, 100x New England Biolabs B9001S
sheep-anti-dig antibody Roche diagnostics use 1:500 diluted in TSBSA
rabbit-anti-sheep antibody conjugated with FITC Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
goat-anti-rabbit antibody conjugated with FITC Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
mouse-anti-biotin antibody Roche diagnostics use 1:200 diluted in TSBSA
donkey-anti-mouse antibody conjugated with Rhodamine Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
goat-anti-horse antibody conjugated with Rhodamine Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
Tris-saline washing solution (TS) 10 ml 10x saline, 5 ml 2 M Tris, 85 ml RNAse free H2O
Vectashield mounting medium with DAPI Vectorlabs H-1200
nail varnish
fluorescent miscroscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rudkin, G. T., Stollar, B. D. High resolution detection of DNA-RNA hybrids in situ by indirect immunofluorescence. Nature. 265, 472-473 (1977).
  2. Imataka, G., Arisaka, O. Chromosome analysis using spectral karyotyping (SKY). Cell Biochem Biophys. 62, 13-17 (2012).
  3. Ross, F. M., et al. Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders. Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).
  4. Mastenbroek, S., et al. Preimplantation genetic screening: a systematic review and meta-analysis of RCTs. Hum Reprod Update. 17, 454-466 (2011).
  5. Martins-Taylor, K., Xu, R. H. Concise review: Genomic stability of human induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 30, 22-27 (2012).
  6. Rens, W., et al. Resolution and evolution of the duck-billed platypus karyotype with an X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4X5Y5 male sex chromosome constitution. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16257-16261 (2004).
  7. Munsky, B., et al. Using gene expression noise to understand gene regulation. Science. 336, 183-187 (2012).
  8. Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog. Nature. 483, 470-473 (2012).
  9. Kwon, S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: quantitative imaging of single RNA molecules. BMB Rep. 46, 65-72 (2013).
  10. Ji, N., van Oudenaarden, A. Single molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH) of C. elegans worms and embryos. WormBook. 1-16 (2012).
  11. Femino, A. M., et al. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
  12. Buongiorno-Nardelli, M., Amaldi, F. Autoradiographic detection of molecular hybrids between RNA and DNA in tissue sections. Nature. 225, 946-948 (1970).
  13. Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proc Natl Acad Sci U S A. 63, 378-383 (1969).
  14. John, H. A., et al. RNA-DNA hybrids at the cytological level. Nature. 223, 582-587 (1969).
  15. Bauman, J. G., et al. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochromelabelled RNA. Exp Cell Res. 128, 485-490 (1980).
  16. Wiegant, J., et al. In situ hybridization with fluoresceinated DNA. Nucleic Acids Res. 19, 3237-3241 (1991).
  17. Langer, P. R., et al. Enzymatic synthesis of biotin-labeled polynucleotides: novel nucleic acid affinity probes. Proc Natl Acad Sci U S A. 78, 6633-6637 (1981).
  18. Manuelidis, L., et al. High-resolution mapping of satellite DNA using biotin-labeled DNA probes. J Cell Biol. 95, 619-625 (1982).
  19. Kislauskis, E. H., et al. Isoform-specific 3'-untranslated sequences sort alpha-cardiac and beta-cytoplasmic actin messenger RNAs to different cytoplasmic compartments. J Cell Biol. 123, 165-172 (1993).
  20. Singer, R. H., Ward, D. C. Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with a biotinated nucleotide analog. Proc Natl Acad Sci U S A. 79, 7331-7335 (1982).
  21. Corput, M. P., et al. Fluorescence in situ hybridization using horseradish peroxidase-labeled oligodeoxynucleotides and tyramide signal amplification for sensitive DNA and mRNA detection. Histochem Cell Biol. 110, 431-437 (1998).
  22. Jonkers, I., et al. RNF12 is an X-Encoded dose-dependent activator of X chromosome inactivation. Cell. 139, 999-101 (2009).
  23. Barakat, T. S., et al. RNF12 activates Xist and is essential for X chromosome inactivation. PLoS Genet. 7, (2011).
  24. Gontan, C., et al. RNF12 initiates X-chromosome inactivation by targeting REX1 for degradation. Nature. 485, 386-390 (2012).
  25. Lyon, M. F. Gene action in the X-chromosome of the mouse (Mus musculus L). Nature. 190, 372-373 (1961).
  26. Barakat, T. S., Gribnau, J. X. chromosome inactivation in the cycle of life. Development. 139, 2085-2089 (2012).
  27. Augui, S., et al. Regulation of X-chromosome inactivation by the X-inactivation centre. Nat Rev Genet. 12, 429-442 (2011).
  28. Brown, C. J., et al. A gene from the region of the human X inactivation centre is expressed exclusively from the inactive X chromosome. Nature. 349, 38-44 (1991).
  29. Brockdorff, N., et al. Conservation of position and exclusive expression of mouse Xist from the inactive X chromosome. Nature. 351, 329-331 (1991).
  30. Borsani, G., et al. Characterization of a murine gene expressed from the inactive X chromosome. Nature. 351, 325-329 (1991).
  31. Barakat, T. S., Gribnau, J. X chromosome inactivation and embryonic stem cells. Adv Exp Med Biol. 695, 132-154 (2010).
  32. Chaumeil, J., et al. A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced. Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).
  33. Okamoto, I., et al. Eutherian mammals use diverse strategies to initiate X-chromosome inactivation during development. Nature. 472, 370-374 (2011).
  34. Gribnau, J., et al. X chromosome choice occurs independently of asynchronous replication timing. J Cell Biol. 168, 365-373 (2005).
  35. Namekawa, S. H., Lee, J. T. Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos. Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).
  36. Van Tine, B. A., et al. Simultaneous in situ detection of RNA, DNA, and protein using tyramide-coupled immunofluorescence. Methods Mol Biol. 292, 215-230 (2005).
  37. Pollex, T., et al. Live-Cell Imaging Combined with Immunofluorescence, RNA, or DNA FISH to Study the Nuclear Dynamics and Expression of the X-Inactivation Center. Methods Mol Biol. 1042, 13-31 (2013).
  38. Chaumeil, J., et al. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).
  39. Lin, S., Talbot, P. Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 690, 31-56 (2011).
  40. Meissner, A., et al. Derivation and manipulation of murine embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 482, 3-19 (2009).
  41. Nichols, J., Ying, Q. L. Derivation and propagation of embryonic stem cells in serum- and feeder-free culture. Methods Mol Biol. 329, 91-98 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics