Kombinierte DNA-RNA-Leuchtstoff

Biology

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Summary

Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) erlaubt den Nachweis von Nukleinsäuren in ihrer natürlichen Umgebung innerhalb der Zellen. Wir beschreiben ein Protokoll für den kombinierten, gleichzeitigen Nachweis von RNA und DNA mit Hilfe von FISH, die verwendet werden können, um X-Chromosom Inaktivierung in embryonalen Maus-Stammzellen zu untersuchen.

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Barakat, T. S., Gribnau, J. Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (88), e51628, doi:10.3791/51628 (2014).

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Abstract

Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) ist eine Technik, die die molekularen Nachweis von Nukleinsäuren in Zellen ermöglicht. FISH DNA ist oft in der Zytogenetik und Krebsdiagnostik verwendet und können Aberrationen des Genoms, die oft wichtige klinische Auswirkungen erkennen. RNA-FISH können verwendet werden, um RNA-Moleküle in Zellen zu erfassen und wichtige Einblicke in die Regulation der Genexpression zur Verfügung gestellt. Die Kombination von DNA-und RNA FISH innerhalb der gleichen Zelle ist technisch anspruchsvoll, da die Bedingungen für DNA-FISH vielleicht zu hart für zerbrechlich, einzelsträngige RNA-Moleküle sein. Wir präsentieren hier eine leicht anwendbare Protokoll, das die kombinierte, simultane Detektion von Xist RNA und DNA von den X-Chromosomen kodiert ermöglicht. Diese kombinierte DNA-RNA-FISH-Protokoll kann wahrscheinlich andere Systeme, bei denen sowohl RNA und DNA nachgewiesen werden müssen aufgebracht werden.

Introduction

Studieren Zellen und Gewebe mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) hat sich seit ihrer Einführung in den späten 1970er Jahren ein, konnten die Forscher um Gene, Chromatin-Organisation und Genexpression auf subzellulärer Ebene zu studieren. DNA-FISH wird häufig in Zytogenetik, Karyotypisierung 2, 3 und Krebsdiagnostik Präimplantations-Screening-4 verwendet wird, und hat eine wichtige Rolle in der Molekularforschung 6.5, da es die Detektion von Nukleinsäuren in ihrer natürlichen Umgebung ermöglicht. Einzelzell-Expressionsanalyse von RNA-FISH können native primären Transkripte zu erkennen und nicht-kodierenden RNAs transkribiert Chromosomen aus und bietet Vorteile gegenüber anderen Techniken, die Genexpression auf Bevölkerungsebene Einschätzung liegen, wie beispielsweise quantitative RT-PCR, genomweite Expressionsanalyse oder Northern Blot . Durch die Visualisierung RNA-Transkripte, die direkt aus ihren Ursprungsorten hat es zum Beispiel gewesen,bemerkt, dass die Genexpression stochastischen 7, und kann manchmal allelspezifische 8 sein. Verbesserungen in der Technik sogar erlaubt den Nachweis und die Quantifizierung der einzelnen mRNA-Moleküle innerhalb von Zellen 9-11.

Das Grundprinzip besteht aus FISH-Hybridisierung von Nukleinsäuren in der Zelle zu einer Nukleinsäuresonde mittels hochspezifische Watson und Crick Basenpaarung. Die Sonde kann entweder direkt oder indirekt erfasst, was zu einem Signal, das mikroskopisch sichtbar gemacht werden kann. Anfängliche Versuche bestand aus radioaktiv markierten Sonden, die Nachteile der Grundlage von Sicherheitsfragen, begrenzte räumliche Auflösung und die Fähigkeit, nur ein Ziel zu einer Zeit zu erfassen 12-14 hatten. Die weitere Entwicklung der nicht-radioaktiven Labels, darunter Fluorochrome, Haptene, und Enzyme, hat die weit verbreitete Nutzung von FISH als Routine Molekularbiologie Technik erlaubt. Die FISH-Sonde kann entweder direkt mit fluoroch gekennzeichnet werdenromes durch chemische Verknüpfung der Fluoreszenzmoleküle an Nukleinsäure-Sequenzen 15 und die Integration der fluoreszierend markierten Nucleotide 16-19, oder die Sonde kann indirekt nach Integration Haptene (wie Biotin und Digoxigenin) und immunologischen Nachweis von Haptenen durch Hapten spezifischen Antikörper konjugiert visualisiert fluoreszierenden Reportermoleküle 20-21. Der letztere Ansatz erlaubt eine Signalverstärkung durch die Verwendung mehrerer Schichten aus fluoreszenzmarkierten Antikörpern, die verwendet werden, um das ursprüngliche Signal zu verstärken, und ermöglicht den Nachweis von RNA-Spezies, die auf niedrigem Niveau exprimiert werden. Durch die Kombination von direkten und indirekten Markierungstechniken und verschiedene Haptene können mehrere Ziele gleichzeitig innerhalb der gleichen Zelle sichtbar gemacht werden.

Einer der wichtigsten Schritte bei der FISH-Protokolle ist die Hybridisierung der Sonde an ihr Ziel. Obwohl in der Theorie, eine Sonde zu binden, die spezifisch nur an sein Ziel in der Praxis diese Spezifitätist nicht immer erreicht, da Sonden, um homologe Regionen binden und Hybridisierungsbedingungen nicht immer ideal für eine bestimmte DNA-Region oder RNA Spezies. Post-Hybridisierungswaschanlagen sind daher von besonderer Bedeutung, da sie die Stringenz der FISH-Verfahren zu erhöhen, und kann nicht-spezifische Bindung von FISH-Sonden, die in einem hohen Pegel von Hintergrundrauschen führen würde. Wie RNA-Moleküle werden Einzelstrang können sie leicht zu einer FISH-Sonde hybridisiert werden. Im Gegensatz dazu benötigt das doppelsträngige DNA-Molekül einen ersten Denaturierungsschritt, wonach eine Sonde hybridisieren kann. Dies wird normalerweise durch Erhitzen der Probe, die Denaturierung der DNA Ergebnisse erzielt. Doch unter diesen harten Bedingungen kann zerbrechlich, einsträngige RNA-Moleküle verloren. Daher kombinierten DNA-RNA-FISH erfordert erhebliche Optimierung der Bedingungen und ist technisch anspruchsvoll gegenüber der getrennten Erkennung von nur RNA oder DNA.

Hier haben wir Präsentationta detailliertes Protokoll der kombinierten, gleichzeitigen DNA-RNA-FISH, die uns erlaubt hat, X-Chromosom-Inaktivierung (XCI) bei der Differenzierung von weiblichen Maus embryonale Stammzellen 22-24 studieren. XCI ist ein entscheidender epigenetischen Mechanismus für weibliche Embryonalentwicklung 25 und führt heterochromatinization und somit Silencing eines der beiden X-Chromosomen in weiblichen Individuen 26-27. Wesentlich für dieses Verfahren ist die nicht-kodierende RNA Xist 28-30, die durch die RNF12 22-23 und 24 REX1 Proteine ​​reguliert wird. Xist Expression wird über die Zukunft inaktiven X-Chromosom (Xi) während der embryonalen Entwicklung oder bei der ES-Zelldifferenzierung in vitro hochreguliert und kann entlang der X-Chromosom verteilt und dadurch gewinnen Chromatin Remodeling Enzyme, die in der Transkriptionsherunterfahren des X-Chromosoms 31 führen. Diese Ausbreitung Xist RNA durch RNA-FISH als Beschichtung des X-Chromosom visualisierteinige, die auch als Xist Wolke bezeichnet wird. Da weibliche ES-Zellen können einem ihrer X-Chromosomen durch genomische Instabilität zu verlieren, wir und andere kombinierte DNA-RNA-FISH eingesetzt haben, XCI zu untersuchen, um sicherzustellen, dass nur karyotypisch stabile Zellen werden in der Analyse dieses wichtigen Prozesses 22,32 bewertet -34. Wie in jedem molekularbiologischen Technik haben mehrere ausgezeichnete Protokolle veröffentlicht 35-38. Hier präsentieren wir unsere Methode, ausgehend von der Induktion der Differenzierung in Maus-ES-Zellen, Fixierung von Zellen, die Kennzeichnung von FISH-Sonden durch Nick-Translation, Vorbehandlung von fixierten Zellen zu ermöglichen Permeabilisierung und anschließender Sondenaufnahme, Hybridisierung der Sonde an die Ziel und schließlich Detektion der Sonde durch Fluoreszenz-markierten Antikörpern. Die hier vorgestellte Protokoll ermöglicht die Gläubigen Erkennung von Xist RNA und das X-Chromosom innerhalb einer Frist von zwei Tagen, und die Grundlagen dieser Technik kann wahrscheinlich angepasst werden otihre Systeme und Forschungsbereiche.

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Protocol

1. Induktion der Differenzierung in weiblich embryonalen Stammzellen zu X-Chromosom-Inaktivierung herbei

HINWEIS: Weiblich embryonalen Stammzellen der Maus (auf Anfrage erhältlich) werden unter Standardbedingungen auf ES-Zellkulturschalen verkleistert mit embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) beschichtet gewachsen. Wir hier davon aus, dass der Leser mit Standardzellkulturtechniken 39-41 vertraut ist. Um die Differenzierung zu induzieren, werden ES-Zellen in T25 Schalen gezüchtet aus den MEFs getrennt werden, und wird in Differenzierungsmedium plattiert werden.

  1. Entfernen ES-Medium aus der ES-Zell-Kultur, und zweimal waschen mit Zellkultur PBS.
  2. 1,5 ml Trypsin-EDTA (37 ° C vorgewärmt) und inkubieren Zellen bei 37 ° C für 7 min. Nach 3,5 min, schütteln die Schale vorsichtig, brechen die Kolonien.
  3. Inaktivierung des Trypsin-EDTA durch Zugabe von 3,5 ml Differenzierungsmedium zu den Zellen. Pipette Zellen nach oben und unten, um eine einzelne Zelle Lösung zu erhalten, und sammelnin einem 15-ml-Tube. Spin für 5 min bei 200 × g gesammelt und Zellen in 10 ml Differenzierungsmedium.
  4. Hinzufügen Zellsuspension auf eine nicht-gelatinierten Kulturschale, und Inkubation für 1 h in einem Zellkulturbrutschrank. HINWEIS: MEFs in der Lage, mit dem nicht-gelatinierten Kulturschale anhaften, während ES-Zellen in Suspension verbleiben.
  5. In der Zwischenzeit, fügen sterilisierte Glasdeckgläser (24 x 24 mm) auf 6-Well-Platten mit 0,2% Gelatine und inkubieren minimal 5 min bei Raumtemperatur.
  6. Nach 1 Stunde Sammeln des Überstands des vorgalvanisierten ES-Zellkultur, die hauptsächlich aus wird der nichthaftenden ES-Zellen. Platte ES-Zellen zu 6-well-Platten mit Deckgläsern. HINWEIS: Verwenden Sie ⅙ th einer konfluenten T25 Gericht für 6 Vertiefungen einer 6-Well-Platte. Dies wird eine Differenzierung konfluenten gut nach 3 Tagen der Differenzierung zu ermöglichen. Änderungsmedium auf einer täglichen Basis. Für längere Zeit Differenzierungskurse, Platte vor, vernickelt ES-Zellen in Differenzierungsmedium in bakteriellen Gerichte und incubaß auf einem Schüttler Zelle in den Zellkulturbrutschrank integriert. Dies ermöglicht es den Zellen, embryonale Körper, die 1-2 Tage vor der Fixierung auf Deckgläsern ausplattiert werden können zu bilden.

2. Fixierung von differenzierten ES-Zellen für spätere DNA-RNA-FISH-Analyse

  1. Entfernen Differenzierungsmedium von Differenzierung Kulturen, und zweimal waschen mit Zellkultur PBS. HINWEIS: In den PBS sorgfältig verhindern, dass die Zellen weggewaschen.
  2. Entfernen Zellkultur PBS und fixieren Zellen durch Zugabe von 4% Paraformaldehyd (PFA) / PBS und Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur. ACHTUNG: PFA ist giftig und kann erhebliche gesundheitliche Risiken verursachen, wenn sie eingeatmet oder wenn sie in Kontakt mit Haut oder Augen. Darüber hinaus ist PFA krebserregend.
  3. Entfernen Sie 4% PFA / PBS und Deckgläser 3x waschen mit 70% Ethanol. HINWEIS: Richtig Waschen ist wichtig, da eine Spur von PFA wird mit anschließender FISH Schritte stören. Deckgläser in 70% Ethanol bei -20 ° C für mehrere Monate vor der F gespeichert werdenISH-Analyse.

3. Markierung von DNA-Sonden für FISH Experimente

HINWEIS: Besorgen Sie sich ein DNA-Fragment mit dem Gen von Interesse (Mindestlänge> 2 kb für die RNA-FISH, oder> 20 kb für die DNA-FISH), oder eine BAC für das Gen von Interesse. Für RNA-Nachweis kann eine kleinere Sonde ausreichend sein im Vergleich zu den DNA-Nachweis, da wahrscheinlich die Transkription in mehreren Transkripte, die gleichzeitig detektiert werden können führen. Für ein starkes Signal auf der Einzelkopie-DNA-Strang wird eine längere Sonde erforderlich ist, um eine ausreichende Anzahl von einge Haptene erkennen. Vorzugsweise wird ein nicht-transkribierte genomische Region für die Gestaltung der DNA-Sonde ausgewählt. Wenn außerdem die Verwendung einer kleineren Sonde, um die RNA zu detektieren, wird es verhindert, dass die genomische Loci von der die RNA transkribiert wird, die in der kombinierten DNA-RNA-FISH Ansatz erkannt, obwohl dies nicht ganz ausgeschlossen werden kann. Um zu erkennen, Maus Xist wurde ein 5,5 kb cDNA-Sonde verwendet. Für detbschnitt des X-Chromosoms, BAC mehrere Sonden verwendet werden. Gute Ergebnisse wurden mit einer Mischung aus BAC RP23-100E1 und 474E4-BAC CT7, die in der Nähe des Ortes angeordnet sind Xist ermittelt. Je nach dem Gen oder Chromosom von Interesse ist, kann mehrere unterschiedliche Sonden erforderlich, um optimale Ergebnisse zu erhalten. Immer, wenn die Arbeit mit Materialien, die für RNA-FISH verwendet werden soll, verwenden Sie sterile Filterspitzen, RNase-freiem H 2 O, und die Arbeit in einer sauberen Umgebung.

  1. Nimm 1 ug DNA und verdünnt in H 2 O in einem Gesamtvolumen von 16 ul. In 4 ul von Digoxigenin oder Biotin Markierungslösung (siehe Reagenzien), durch Vortexen mischen und Inkubation bei 16 ° C für 90 min. HINWEIS: Die Biotin oder Digoxigenin markierten Nukleotiden wird nun durch Nick-Translation eingebaut werden.
  2. In der Zwischenzeit bereiten G50 Spalten auf nicht-integrierte Nukleotide zu entfernen. Nehmen Sie ein 2-ml-Spritze, entfernen Sie den Stempel, und fügen sterilisiert Baumwolle in die Spritze. In G50-Kugeln in Lösung to Füllen der Spritze, Spritze in einem 15 ml-Zentrifugenrohr und bei 642 g für 1 min. HINWEIS: Rund 80% der Spritze sollte jetzt mit G50 gefüllt werden. Wiederholen Sie, wenn weniger G50 vorhanden ist.
  3. Nach 90 min werden 40 ul H 2 O zu der Nick-Translation Reaktionsgemisch, und fügen Sie die Reaktion auf die Säule G50. Fügen Sie ein Leerrohr unter der Spalte und Zentrifugieren bei 642 g für 2 min. Die Strömung durch Sammeln in einem Reaktionsrohr.
  4. Messung des Volumens der Strömung durch mit einer Pipette, und geben H 2 O auf ein Gesamtvolumen von 200 &mgr; l zu erreichen. Ausfällung der Strömung durch Zugabe von 13,3 ul Lachssperma-DNA (10 mg / ml), 13,3 ul Hefe-tRNA (10 mg / ml), 26,7 &mgr; l Maus Cot-1-DNA (1 mg / ml) und 28 ul 2 M NaAc, pH-Wert 5.6. Mischen durch Vortexen, und fügen Sie 533 ul eiskaltem 100% Ethanol. Schütteln des Röhrchens und Zentrifuge bei 16.200 × g für 30 min bei 4 ° C
  5. Entfernen Sie den Überstand und Wasch Pellet zweimal mit 70% Ethanol. Zentrifugieren bei 16.200 × g für 5 min bei4 ° C und an der Luft trocknen die Pellets. Dann werden 50 &mgr; l Hybridisierungslösung + 50, und bei 37 ° C für 30 min bis Auflösen zu erleichtern. HINWEIS: Die markierte Sonde kann für mehrere Jahre bei -20 ° C gelagert werden ACHTUNG: 50 + Hybridisierungslösung enthält Formamid, das giftig ist, kann die Haut, die Augen und die Atemwege reizen, und ist auch ein teratogen.

4. Permeabilisierungs, Vorbehandlung und Hybridisierung der fixierten Zellen für den kombinierten DNA-RNA-FISH

  1. Rehydrieren fixierten Zellen auf Deckgläsern, indem 70% Ethanol und die Zugabe von Zellkultur PBS auf die 6-well-Platten. Inkubation für 5 min. Wiederholen insgesamt drei Mal.
  2. Zellkultur-PBS entfernen, und fügen Sie 0,2% Pepsin zu den 6-Well-Platten, um die Zellen permeabilisiert. Inkubieren Platten mit 6 Vertiefungen in einem Wasserbad bei 37 ° C für 4 min. Entfernen Pepsin, und inaktivieren mit RNAse freien H 2 O.
  3. Postfix-Zellen durch Inkubation mit 4% PFA / PBS für 5 min bei Raumtemperatur. Nach fixatiauf, zweimal waschen mit Zellkultur PBS für 5 min.
  4. Dehydratisieren Zellen durch Inkubation mit 70% Ethanol für 3 min, 90% Ethanol 3 min und 100% Ethanol für 3 min. Überdeckgläser aus der 6-Well-Platten und an der Luft trocknen Deckgläser für einige Minuten.
  5. Alter Zellen durch Inkubation Deckgläser bei 65 ° C für 1 Stunde auf einer Wärmeplatte.
  6. Pre-FISH-Sonde hybridisieren, mit Maus-Cot-1 DNA durch Addition zu jedem Deck analysiert, 25 ul 50 + Hybridisierungslösung, 0,5 &mgr; l Maus-Cot-1-DNA, 1 &mgr; l Biotin-markierten Sonde Xist und 1 &mgr; l Digoxigenin markierten BAC-Sonde Erfassung der X-Chromosom. Vortexen und Denaturierung bei 99 ° C für 5 min. Inkubation sofort auf 37 ° C für 45 min, damit Cot-1-DNA zu hybridisieren, um in den Sonden vorhandenen Sequenzen wiederholen.
  7. Nach der Alterung Stelle 50 ul Denaturierungspuffer (bestehend aus 70% formamide/2x SSC/10 mM Phosphatpuffer) auf einem Glasträger und Deckgläser gelegt oben mit Zellen gegen towards Denaturierung Puffer. Inkubieren bei 65 ° C für 2 min.
  8. In Deckgläser wieder auf 6-Well-Platten, und Post-fix-Zellen durch Inkubation in eiskaltem 70% Ethanol für 5 min.
  9. Dehydratisieren Zellen durch anschließende Inkubation in 70% Ethanol für 3 min, 90% Ethanol 3 min und 100% Ethanol für 3 min. Deckgläser entfernen von 6-Well-Platten und der Luft trocknen lassen für einige Minuten.
  10. Finde Pre-hybridisierten Sonde auf einem Glasobjektträger und Deckglas auf inkubiert. Die Objektträger in einer feuchten Kammer mit 50 ml 50% formamide/2x SSC gefüllt und inkubiert über Nacht bei 37 ° C.

5. Post-Hybridisierung Waschanlagen und Antikörper-vermittelte Erkennung von Probe

  1. Füllen 6-Well-Platten mit 2x SSC und Pre-warmen bis 42 ° C Hinzufügen Deck nach Inkubation über Nacht, und Inkubieren bei 42 ° C für 5 min.
  2. Entfernen 2x SSC, und Inkubieren Deckgläser mit 50% formamide/2x SSC für 10 min bei 42 ° C. Wiederholen Sie insgesamt 3-mal (30 min Waschen insgesamt). Entfernen von 50% formamide/2x SSC und Waschen Folien mit Tris-Kochsalzlösung-Tween (TST) für 2 x 5 min bei Raumtemperatur.
  3. Punkt 50 ul Tris-Kochsalzlösung-BSA (TSBSA) pro Deckglas auf neue Glasobjektträger, Deckgläser und Inkubation Kopf für die Sperrung während 30 Minuten bei Raumtemperatur in einer TST-befeuchteten dunkle Kammer.
  4. Überdeckgläser wieder auf 6-Well-Platten, und waschen 2 x 5 min mit TST.
  5. Punkt 50 ul Schaf-anti-Dig-Antikörper (1:500 in TSBSA) pro Deckglas auf neue Glasobjektträger, Deckgläser und Inkubation upside-down für den ersten Schritt der Inkubation während 30 Minuten bei Raumtemperatur in einer TST-befeuchteten dunkle Kammer.
  6. Überdeckgläser wieder auf 6-Well-Platten, und waschen 2 x 5 min mit TST.
  7. Punkt 50 ul Kaninchen-Anti-Schaf-Antikörper konjugiert mit FITC (1:250 in TSBSA) pro Deckglas auf neue Glasobjektträger, Deckgläser und Inkubation Kopf für den zweiten Schritt der Inkubation während 30 Minuten bei Raumtemperatur in einer TST-befeuchteten dunkle Kammer .
  8. Transfer Deckgläser wieder auf 6-Well-Platten, und waschen 2 x 5 min mit TST.
  9. Spot 50 ul Ziege-anti-Kaninchen-Antikörper, konjugiert mit FITC (1:250 in TSBSA) pro Deckglas auf neue Glasobjektträger und Deckgläser inkubieren Kopf zum dritten Inkubationsschritt bei 30 min bei Raumtemperatur in einem TST-befeuchteten Dunkelkammer .
  10. Überdeckgläser wieder auf 6-Well-Platten, und waschen 2 x 5 min mit TST.
  11. Punkt 50 ul Maus-Anti-Biotin-Antikörper (1:200 in TSBSA) pro Deckglas auf neue Glasobjektträger, Deckgläser und Inkubation Kopf für den vierten Schritt während der Inkubation 30 Minuten bei Raumtemperatur in einer TST-befeuchteten dunkle Kammer.
  12. Überdeckgläser wieder auf 6-Well-Platten, und waschen 2 x 5 min mit TST.
  13. Punkt 50 ul Esel-Anti-Maus-Antikörper konjugiert mit Rhodamin (1:250 in TSBSA) pro Deckglas auf neue Glasobjektträger, Deckgläser und Inkubation Kopf zum fünften Inkubationsschritt während 30 Minuten bei Raumtemperatur in einer TST-befeuchtet dunklen chambäh.
  14. Überdeckgläser wieder auf 6-Well-Platten, und waschen 2 x 5 min mit TST.
  15. Punkt 50 ul Ziege-anti-Pferd-Antikörper konjugiert mit Rhodamin (1:250 in TSBSA) pro Deckglas auf neue Glasobjektträger, Deckgläser und Inkubation Kopf zum sechsten Schritt die Inkubation während 30 Minuten bei Raumtemperatur in einer TST-befeuchteten dunkle Kammer . HINWEIS: die Ziege-anti-Pferd-Antikörper die Esel-anti-Maus-Antikörper zu erkennen; wenn verfügbar, um den Forscher, wird ein Ziege-anti-Antikörper Esel so gut funktionieren.
  16. Überdeckgläser wieder auf 6-Well-Platten, und waschen 2 x 5 min mit TST. Waschen Sie weitere 5 min mit Tris-Kochsalzlösung (TS).
  17. Dehydratisieren Zellen durch anschließende Inkubation in 70% Ethanol für 3 min, 90% Ethanol 3 min und 100% Ethanol für 3 min. Deckgläser entfernen von 6-Well-Platten und der Luft trocknen lassen für einige Minuten.
  18. Spot eine Tropfen Eindeckmedium mit DAPI (siehe Reagenzien) auf einen Objektträger und Deckglas fügen Kopf an der Spitze. Siegel Dias mit Nagellack undbeurteilen FISH-Ergebnisse durch Fluoreszenzmikroskopie (Abbildung 1).

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Representative Results

Verwendung des vorstehend erwähnten Protokolls für den kombinierten DNA-RNA-FISH, waren wir in der Lage, X-Chromosom Inaktivierung der Differenzierung embryonaler Stammzellen weiblichen visualisieren. Fig. 1 zeigt ein repräsentatives Beispiel für ein DNA-RNA-FISH-Experiment, wo wir beide Xist (was detektiert als sogenannte Xist RNA Wolke auf dem inaktiven X-Chromosom und einem basalen Transkriptionspunkt auf dem aktiven X-Chromosom) und einer Region des X-Chromosoms, die als punktSignal sichtbar ist sichtbar. Beachten Sie, dass eine der punkt Signale innerhalb des Xist Wolke befindet, was zeigt, dass die Wolke Xist tatsächlich Lokalisierung entlang, und Beschichten des X-Chromosoms. In mehr als 99% der Zellen detektieren wir unser Protokoll eine korrekte DNA-Signal (Daten nicht gezeigt). Im Vergleich zu RNA-FISH, visualisiert Xist Wolken mit Hilfe der kombinierten DNA-RNA-FISH-Verfahren aussehen manchmal größer, als die denaturierte DNA scheint eine größere Fläche einnehmen. Wir haben OBenthaltenen ähnliche Ergebnisse unter Verwendung von menschlichen ES-Zellen, Lymphozyten und verschiedenen menschlichen Fibroblastenzelllinien von verschiedenen Spezies, und das gleiche Protokoll wurde angewendet, um die Genexpression von verschiedenen X-chromosomale Loci, einschließlich Rnf12 studieren. Zusätzlich, wenn dieses Protokoll wurde undifferenzierten weibliche ES-Zellen angewendet wird, könnte die basale Expression Xist von beiden X-Chromosomen nachgewiesen werden, was zeigt, daß bei niedrigen Konzentrationen exprimiert, die dieses Protokoll auch Gene sichtbar gemacht werden kann (Daten nicht gezeigt).

Figur 1
Abbildung 1. Combined DNA-RNA-FISH in differenzierten weiblichen ES-Zellen. Nach dem hier beschriebenen Protokoll für den kombinierten DNA-RNA-FISH erhalten repräsentativen Ergebnisse. Das X-Chromosom (X chr.) Wird mit einem Digoxigenin-markierten BAC-Sonde, die Verwendung von Antikörpern gegen FITC konjugiert visualisiert wird (grüne Zeichen erkanntal). In fast jeder Zelle werden zwei X-Chromosomen nachgewiesen. Xist RNA wird mit einer Biotin-markierten cDNA-Sonde, die mit Antikörpern gegen Rhodamin (rotes Signal) konjugiert visualisiert wird erkannt. Beide großen Xist Ansammlungen auf dem inaktiven X-Chromosom (Xist Wolken) und basale Xist Ausdruck aus dem aktiven X-Chromosom (Xist Genauigkeiten) nachgewiesen werden (Anmerkung: auf die Differenzierung dieser basalen Xist Ausdruck wird über die Zukunft aktiv X-Chromosom nicht mehr, und deshalb nicht erkannt in jedem Zellkern). Die Zellkerne sind mit DAPI (blau) gegengefärbt. Maßstabsbalken entspricht 10 um. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

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Discussion

Kombinierte DNA-RNA-FISH technisch eine Herausforderung sein, die Bedingungen für DNA-FISH können zu hart für weniger stabile RNA-Moleküle sein. Es wurden verschiedene Ansätze angewendet, um sowohl DNA als auch RNA in einer Zelle zu untersuchen, unter Umgehung der Notwendigkeit einer gleichzeitigen Inkubation mit Sonden Erfassen sowohl der DNA und RNA. Beispielsweise in einer Überlagerungsansatz wird zuerst RNA-FISH durchgeführt, und die Zellen abgebildet werden, und die Koordinaten genommen werden. Anschließend werden die gleichen Objektträger für DNA-FISH verwendet wird, während der das Signal von RNA-FISH verloren. Nach der DNA-FISH, werden die Zellen wieder abgebildet wird, und die sowohl von der RNA-und DNA-FISH erhaltenen Bilder überlagert sind. Obwohl dieser Ansatz funktioniert in fast allen Fällen, wie die DNA der fixierten Zellen stabil ist, und wird nicht von der für die anfängliche RNA-FISH benötigte Behandlung betroffen sind, ist dies eine sehr mühsame Ansatz, die mindestens vier Tage kostet. In einem anderen Ansatz wird zunächst die RNA-FISH durchgeführt wird, die RNA-FISH-Signal wird durch Zugabe o Festf Fixiermittel, nach der DNA-FISH angewendet wird. Obwohl auch dieser Ansatz funktionieren kann, kann ein Teil des Fluoreszenzsignals von der RNA abgeleitet FISH bei Fixierung verloren. Dies könnte insbesondere behindern die Erkennung von Transkripten, die nur auf niedrigem Niveau exprimiert werden. Die hier vorgestellte Ansatz ist für den gleichzeitigen Nachweis von RNA sowohl ein Ziel-und ein Ziel-DNA in einem einzigen Experiment FISH optimiert und hat den Vorteil, dass beide Ergebnisse können in einem einzigen Experiment innerhalb von zwei Tagen erhalten werden, wobei zuverlässige Ergebnisse.

Mehrere Schritte in der FISH-Protokoll sind entscheidend, um optimale Ergebnisse zu erzielen. Erstens, wenn Umgang mit RNA-Molekülen, sollte man darauf achten, nicht in jedem RNAse-Puffer oder der verwendeten Lösung einzuführen. Daher sollte eine saubere Arbeitsumgebung geschaffen werden, und Filterspitzen verwendet werden sollte, wenn Pipettieren Reagenzien für FISH eingesetzt. Es ist darauf zu RNAse freien Verbindungen (zB RNAse freies Wasser, Zellkulturqualität PBS, absolute verwendenly reinem Ethanol etc.). Wenn diese einfachen Regeln befolgt werden, ist es im allgemeinen nicht erforderlich, zusätzliche RNAse-Inhibitoren auf die verwendeten Reagenzien ergänzt verwenden. Zweitens ist das Verfahren der Permeabilisierung mit Pepsin eine sanfte Gleichgewicht zwischen zu wenig oder zu viel Permeabilisierung. Abhängig von der bestimmten Zelltyp verwendet wird, könnte es erforderlich, die Zeit zur Permeabilisierung erlaubt, oder die Pepsin-Konzentrationen optimiert werden. Letzteres hängt auch von Ihrem bestimmten Charge von Pepsin, wie die Aktivität kann variieren. Als Alternative Permeabilisierung mit 0,1% Triton-X100/PBS für 5 min führt zu guten Ergebnissen, die unter bestimmten Bedingungen, und hat den Vorteil, dass FISH mit dieser Methode der Permeabilisierung mit Immunfärbung auf nukleare oder zytoplasmatische Proteine ​​nachzuweisen kombiniert werden. Als dritte wichtige Aspekt FISH sollten die Alterung, Denaturierung, Hybridisierung und Waschen bei Temperaturen konstant gehalten werden. Selbst kleine Abweichungen von der Soll-Temperatur kann in weniger eff führeniziente Denaturierung, Hybridisierung oder weniger stringenten Waschschritten, die in mehr Hintergrundfärbung führt. Als Alternative zu dem Alterungsschritt 1 h bei 65 ° C, gefolgt von einer Denaturierung bei 65 ° C für 2 Minuten, auch eine anfängliche Denaturierung bei 80 ° C für 5 min, ohne Alterung, können gute Ergebnisse liefern. Wir bevorzugen den Alterungsverfahren, wie dies im allgemeinen Verfahren gibt zuverlässigere DNA-FISH-Signale. Schließlich werden bestimmte DNA-Sonden so spezifisch sein, dass sie nicht erfordern drei Schichten von Antikörpern zur Detektion ausreichend. Dies sollte empirisch für jeden neu erzeugten Sonde getestet werden.

Obwohl die aktuelle Protokoll arbeitet robust in der Studie von X-Chromosom Inaktivierung und Detektion Xist, kombinierten Nachweis von RNA und DNA könnte in anderen Einstellungen komplizierter. Dies könnte insbesondere dann der Fall, wenn die RNA-Spezies, die angestrebt wird, nachgewiesen werden nur in sehr geringen Mengen exprimiert werden, ist von Wiederholungssequenzen oder eine relativ kurzeTranskript. In diesen Situationen kann es relativ schwierig sein, eine optimale Sonde, die die effiziente Hybridisierung an eine begrenzte, nicht optimal verfügbare Menge an Ziel ermöglichen entwerfen. In solchen Situationen könnte es sich lohnen Optimierung ersten Bedingungen für die RNA-FISH. Mehrere alternative Sonden könnte versucht werden, und die Dauer der Sondenmarkierung von Nick-Übersetzung könnte titriert werden, um die Menge des einge Haptene optimieren. Wichtig ist, sollte verifiziert werden, dass die Ziel-RNA in den Zellen exprimiert zu untersuchen, indem zum Beispiel die Überprüfung Expression durch RT-PCR. Auch bei der Analyse eine andere Art von Zellen, ist es wichtig, Zellen, in denen die Expression wurde bereits als positive Kontrollen festgestellt worden, da dies die Unterscheidung zwischen einem technischen, FISH Problem, oder die einfache Abwesenheit von Ausdruck in der neuen Art ermöglichen umfassen von Zellen analysiert. Wenn trotz prüften Ausdruck, die Verwendung von verschiedenen Sonden und Optimierung der Markierungsbedingungen, tut RNA-FISH not Ergebnis in ein klares Signal, könnte es sich lohnen die Änderung der Hybridisierungsbedingungen zu sein, indem die Menge an Formamid verwendet werden, oder die Dauer und die Temperatur der Sondenhybridisierung. Alternativ könnte direkt markierten Oligonukleotidsonden 9-10 verwendet werden. Die gleiche Optimierungsschritte können anschließend verwendet werden, um DNA-FISH und den gleichzeitigen Nachweis von DNA und RNA zu verbessern.

Mit der kombinierten DNA-RNA-FISH-Protokoll haben wir in der Lage, X-Chromosom-Inaktivierung bei der Differenzierung von ES-Zellen weiblichen studieren. Ähnliche Ergebnisse wurden in unseren Studien gewonnen wurden mit verschiedenen Zelltypen und Embryonen, und wir sind derzeit weitere Optimierung Bedingungen kombiniert DNA-RNA-FISH an Gewebeschnitten anzuwenden. Die wichtige Rolle von nicht-kodierenden RNAs in vielen biologischen Prozessen wird mehr und mehr geschätzt, sehen wir, dass das gleiche Protokoll kann verwendet werden, um andere wahrscheinlich nicht-kodierenden RNAs im Rahmen der spezifischen Chromatin zu untersuchen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
female mouse embryonic stem cells will be made available upon request
mouse embryonic fibroblasts can be derived from E13.5 embryos, or via commercial sources e.g. Millipore
ES cell culture medium DMEM, 15% fetal calf serum, 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin, non-essential amino acids, 0.1 mM γ-mercaptoethanol, and 1,000 U/ml LIF. Filter sterilize and store at 4 °C for maximum of 2 weeks.
LIF Chemicon ESG1107
DMEM Invitrogen 11960085
Fetal Calf Serum Invitrogen 10099141
Penicillin–streptomycin (100x) Invitrogen 15140-122
Non-essential aminoacids Invitrogen 11140-050
γ-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M7522
ES cell differentiation medium IMDM-Glutamax, 15% heat inactivated fetal calf serum, 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin, non-essential amino acids, 37.8 μl/L monothioglycerol and 50 μg/ml ascorbic acid
IMDM-Glutamax Invitrogen 31980-030
Ascorbic acid (50 mg/ml) Sigma-Aldrich A4403
monothioglycerol Sigma-Aldrich M6145
T25 cell culture dishes Greiner Bio-one 690160
6-well cell culture dishes Greiner Bio-one 662160
cell culture grade PBS Sigma-Aldrich D8537
Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) trypsin/0.2% (w/v) EDTA in PBS Gibco 25200-056
Falcon tubes Falcon 352196
24 x 24 mm coverslips Menzle 780882
gelatin Sigma-Aldrich G1890-100G prepare a 0.2% gelatin/cell culture PBS solution, and autoclave
Pepsin Sigma-Aldrich P7000 Dilute to 0.2% in 0.01 M HCl (pH 2.0)
absolute 100% ethanol Sigma-Aldrich 32221-2.5L use absolute 100% ethanol and RNAse free water to make 70% and 90% ethanol solutions
RNAse free water Baxter TKF7114
sterile filter tips Rainin Bio Clean GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F
digoxigenin-labeling kit (DIG-Nick translation) Roche 11745816910
biotin-labeling kit (Biotin Nick translation) Roche 11745824910
Sephadex G50 Sigma-Aldrich G5080
2 ml syringe BD Plastipak 300013
sterilized cotton
Eppendorf tubes Eppendorf 30120086
yeast tRNA 10 mg/ml Invitrogen 15401-029
Salmon Sperm DNA 10 mg/ml Invitrogen 15632-011
mouse cot-1 DNA 1 mg/ml Invitrogen 18440-016
Eppendorf bench top microcentrifuge Eppendorf Model 5417R
Eppendorf refrigerated centrifuge Eppendorf Model 5810R
2 M NaAc, pH 5.6 Sigma-Aldrich S7670
50+ hybridization solution 50% formamide, 2x SSC, 50 mM phosphate buffer pH 7, 10% dextran sulfate pH 7
formamide Acros organics 3272350000
dextran sulfate Fluka 31403
10 mM phosphate buffer, pH 7 add 57.7 ml of 1 M Na2HPO4 and 42.3 ml 1 M NaH2PO4; use DEPC treated water and autoclave
denaturation buffer 70% formamide/2x SSC/10 mM phosphate buffer pH 7
Tween-20 Sigma-Aldrich P2287
2 M Tris pH 7.5 solution
Tris-saline-Tween washing solution (TST) 100 ml 10x saline, 50 ml 2M Tris, 500 μl Tween-20, add RNAse free water till 1 L
10x saline solution dissolve 85 g NaCl in 1 L RNAse free H2O, and autoclave
Tris-saline-BSA (TSBSA) 500 μl 10x saline, 250 μl 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3.25 ml RNAse free H2O
BSA, purified, 100x New England Biolabs B9001S
sheep-anti-dig antibody Roche diagnostics use 1:500 diluted in TSBSA
rabbit-anti-sheep antibody conjugated with FITC Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
goat-anti-rabbit antibody conjugated with FITC Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
mouse-anti-biotin antibody Roche diagnostics use 1:200 diluted in TSBSA
donkey-anti-mouse antibody conjugated with Rhodamine Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
goat-anti-horse antibody conjugated with Rhodamine Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
Tris-saline washing solution (TS) 10 ml 10x saline, 5 ml 2 M Tris, 85 ml RNAse free H2O
Vectashield mounting medium with DAPI Vectorlabs H-1200
nail varnish
fluorescent miscroscope

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References

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