Estereológico y Citometría de Flujo Caracterización de leucocitos subpoblaciones en Modelos de transitorios o isquemia cerebral permanente

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Summary

Cerebro células mieloides caracterización después del accidente cerebrovascular se puede realizar por estereología utilizando el método del fraccionador óptico, o por un análisis de citometría de flujo de cerebro leucocitos suspensiones. Ambas son técnicas útiles para realizar una distinción fenotípica precisa de los principales subconjuntos de células mieloides que se encuentran en el cerebro isquémico.

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Ballesteros, I., Cuartero, M. I., Moraga, A., de la Parra, J., Lizasoain, I., Moro, M. Á. Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia. J. Vis. Exp. (94), e52031, doi:10.3791/52031 (2014).

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Abstract

Activación de la microglía, así como la extravasación de los macrófagos y neutrófilos hematógena, se cree que desempeñan un papel fundamental en la lesión cerebral después del accidente cerebrovascular. Estas subpoblaciones de células mieloides pueden mostrar diferentes fenotipos y funciones y la necesidad de ser distinguido y caracterizado para estudiar su regulación y su contribución al daño tisular. Este protocolo proporciona dos metodologías diferentes para la caracterización de las células inmunes del cerebro: un enfoque estereológico precisa y un análisis de citometría de flujo. El enfoque estereológicos se basa en el método fraccionador óptico, que calcula el número total de células en un área de interés (cerebro infartado) estimado por un muestreo aleatorio sistemático. El segundo enfoque caracterización proporciona una manera simple para aislar suspensiones de leucocitos cerebro y caracterizar ellos por citometría de flujo, lo que permite la caracterización de microglia, infiltrado de monocitos y neutrófilos del tejido isquémico. Además, también D.etails un modelo de isquemia cerebral en ratones que afecta exclusivamente corteza cerebral, generando infartos altamente reproducibles con una baja tasa de mortalidad, y el procedimiento para el procesamiento histológico del cerebro para caracterizar el volumen de infarto por el método de Cavalieri.

Introduction

Morfológicas, fenotípicas y alteraciones de la expresión génica de microglia, así como la extravasación y la activación de los macrófagos y neutrófilos hematógenas se cree que desempeñan un papel fundamental en la cascada fisiopatológica después de una lesión cerebral 1-4. Este protocolo proporciona dos métodos para estimar el número de diferentes subconjuntos de células mieloides del cerebro isquémico y para llevar a cabo su caracterización fenotípica. Además, también proporciona una descripción de un modelo experimental de isquemia cerebral en ratones, que consiste en la ligadura transitoria o permanente de la arteria cerebral media tanto distal (MCA) y la arteria carótida común (CCA), incluyendo la forma de evaluar el infarto por el método de Cavalieri precisa el uso de un software estereológico.

El primer enfoque para caracterizar subconjuntos de células mieloides del cerebro isquémico es un método estereológico basado en el enfoque fraccionador óptico 5. Este es el máscomúnmente utilizado sonda estereológico en ciencias de la vida y proporciona un alto grado de precisión con bajos coeficientes de error 5-7. Esta es la mejor opción para la cuantificación de células cuando el tejido se corta en secciones, ya que evita el sesgo en la estimación de la célula debido a la fragmentación del tejido en secciones. Este método es una forma muy poderosa para caracterizar los números, la dinámica y los cambios fenotípicos de las subpoblaciones de neutrófilos infiltrados del tejido isquémico 8.

El segundo enfoque se basa en la caracterización de un protocolo modificado de Campanella y colaboradores 9 que proporciona una manera simple para aislar suspensiones de leucocitos cerebrales y caracterizarlos por citometría de flujo. En contraste con las técnicas de inmunohistoquímica convencionales, citometría de flujo caracterización permite diferenciar entre microglia (CD45 lo CD11b +) y se infiltró células mieloides (CD45 hi CD11b +) en función de su difflos niveles de expresión de CD45 erent 9-13. Además, los monocitos proinflamatorios (CD45 hi CD11b + Ly-6G - hi Ly-6C), neutrófilos (CD45 hi CD11b + Ly-6G +) y otros leucocitos subconjuntos del tejido isquémico se pueden distinguir. Este enfoque proporciona un ensayo rápido y fiable para evaluar la neuroinflamación en modelos experimentales de isquemia cerebral. Sin embargo, el procesamiento de tejido puede influir en el estado de activación y los números de las diferentes poblaciones de células que se encuentran en el tejido isquémico proporcionar una caracterización semi-cuantitativa.

Protocol

NOTA: Todos los protocolos experimentales adherido a las directrices del Comité de Bienestar Animal de la Universidad Complutense (siguiendo directivas de la UE 86/609 / CEE y 2003/65 / CE).

1. Isquemia Cerebral Modelo

NOTA: El modelo de isquemia cerebral en este documento implica la oclusión permanente o transitoria de ambos CCA (arteria carótida común) y MCA (arteria cerebral media) por ligación con una sutura de nylon.

  1. Preparaciones prequirúrgicas
    1. Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos en autoclave o con un esterilizador de cuentas de vidrio. Desinfectar el área quirúrgica con etanol al 70% también.
    2. Anestesiar el ratón con los anestésicos apropiados. Lograr la inducción por isoflurano 2,5% y mantener con isoflurano por 1,5% en una mezcla de 80% de aire / 20% de oxígeno utilizando un vaporizador. Aplicar lágrimas artificiales para los ojos ratones para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia.
    3. Coloque el ratón sobre una almohadilla eléctrica que está vinculado a una tarifadback dispositivo con una sonda de temperatura colocado en el recto y la temperatura fijada en los niveles fisiológicos (36,5 ± 0,5 ºC) durante el procedimiento quirúrgico.
  2. Oclusión de la arteria carótida común mediante ligación
    1. Coloca el ratón en decúbito dorsal e inmovilizar con cinta adhesiva. Desinfectar la piel con etanol al 70% o povidona-yoduro y cortar el pelo de la parte ventral superior.
    2. Bajo un microscopio quirúrgico, hacer una incisión en la línea media de 1 cm alrededor de la superficie ventral del cuello.
    3. Tire de tejidos blandos (aparte de todo el tejido glandular incluyendo submaxilar, sublingual y las glándulas parótidas) e identificar la izquierda la arteria carótida común (CCA), que se localiza lateral a la tráquea. Retraer los músculos y exponer CCA izquierda. Diseccionar cuidadosamente del nervio vago.
    4. Una vez disecado, ocluir el CCA dejado por una ligadura con sutura 6/0 nylon. Ligar con un nudo permanente o un nudo corredizo (para permitir la reperfusión si se desea un modelo de isquemia cerebral transitoria).
    5. Coloque el tejido glandular en su posición original y cerrar la incisión en la piel del cuello con una sutura de nylon 6/0.
      NOTA: Los animales de simulación se someten al mismo procedimiento quirúrgico como animales MCAO pero la CCA no está ocluida.
  3. Oclusión distal de la arteria cerebral media por ligación
    1. Coloque el ratón sobre su lado derecho e inmovilizar con cinta adhesiva. Desinfectar la piel de la cabeza con etanol al 70% o povidona-yodo y cortar el pelo de la cabeza del ratón (quitar el pelo después de cortar).
    2. Bajo un microscopio quirúrgico, hacer una incisión en la piel entre el ojo y el oído. Mueva la piel de distancia y manténgalo con cinta adhesiva.
    3. Haga una incisión horizontal en el músculo temporal desde la derecha a la izquierda. Luego, hacer una segunda incisión vertical en el lado derecho del músculo temporal (tener cuidado de evitar la vena temporal corte). Separe el músculo temporal del cráneo y sostenerlo con una sutura para mantener una superficie del cráneo limpio.
    4. Limpie la superficie del cráneocon solución salina estéril fría para detectar la posición exacta de la arteria cerebral media izquierda (MCA) a través de la transparencia cráneo. Realice una craneotomía redonda (1 mm de diámetro) con una fresa de acero inoxidable en el lóbulo frontal entre el arco cigomático y el hueso escamoso. Retire cuidadosamente el cráneo y exponer la MCA.
    5. Aplicar una pequeña cantidad de solución salina estéril fría a la superficie del cerebro y eliminar las meninges (duramadre y aracnoides) mediante el uso de fórceps.
    6. Realizar la ligadura de la ACM izquierda en el tronco distal justo antes de la bifurcación entre el frontal y ramas posteriores de MCA. Ocluir el MCA dejado por una ligadura con sutura 9/0 nylon. Ligar con un nudo permanente o un nudo corredizo (para permitir la reperfusión si se desea un modelo de isquemia cerebral transitoria). El período de tiempo entre la CCA y oclusión de la ACM es de aproximadamente 10 a 20 minutos, dependiendo de la experiencia del operador.
    7. Coloque el músculo temporal en su posición original y cierre la incision en la piel del cuello con una sutura de nylon 6/0.
    8. Devuelva el ratón a la jaula para recuperarse de la anestesia (generalmente 5-10 min) e inyectar el ratón con buprenorfina intraperitoneal (IP) (0,3 mg / kg).
      1. Monitorear el ratón para varias horas para detectar cualquier molestia (no deje el ratón sin atención hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal). Dado que el peso post-quirúrgica perdido se observa generalmente, puré de colocar los alimentos en un plato de Petri para facilitar la alimentación.
    9. Cuando el animal está totalmente recuperado, volverá a la compañía de otros animales.
    10. Si se desea un modelo MCAO transitoria, anestesiar el ratón de nuevo y eliminar el nudo corredizo de la CCA y el MCA para permitir la reperfusión (por lo general entre 0,5 a 2 horas (Figura 1)).
      NOTA: Los animales de simulación están sometidos al mismo procedimiento quirúrgico como animales MCAO pero la MCA no se ocluye.

2. Perfusión y SECTIcañoning en el tejido cerebral

  1. 24 o 48 horas después de MCAO, sacrificar el ratón con una dosis letal de anestésico (por ejemplo, el pentobarbital sódico, IP 86 mg / kg o una sobredosis con isoflurano).
  2. Perfundir el ratón con tampón fosfato 0,1 M, seguido de 4% de paraformaldehído (PFA) en tampón de fosfato (pH 7,4).
  3. Retire el cerebro como sigue:
    1. Decapitar al animal justo por encima de la médula espinal.
    2. Hacer una incisión posterior-anterior en la piel de la cabeza para exponer el cráneo. Hacer dos cortes laterales en la unión de las paredes laterales y la base del cráneo y retire la pequeña pieza de hueso.
    3. Haga un corte a través del cráneo a lo largo de la sutura sagital.
    4. Retire el cráneo que recubre cada hemisferio utilizando unas pinzas para exponer el cerebro. Use una espátula para separar el cerebro del cráneo y la transfiere en solución PFA 4%.
  4. Post-fix durante 3 horas en una solución de PFA 4% a 4 ºC.
  5. Retire la solución PFA y incubate el cerebro durante 48 horas en una solución de sacarosa al 30% a cryoprotect el cerebro.
  6. Retire solución de sacarosa y congelar el cerebro rápidamente en isopentano frío (-40 ºC). Tienda congelado a -80 ºC cerebro.
  7. Obtener las secciones del cerebro coronal (30 micras) con un micrótomo de congelación. Recoge diez conjuntos de serie en una solución de crioconservación. Cada conjunto de serie se compone de alrededor de 14 a 16 cortes coronales con una distancia entre cortes de 300 micras que una muestra adecuada del cerebro de ratón entre 1,94 y -2,46 posterior al bregma.

3. La tinción de Nissl y la estimación del volumen del infarto

  1. Tinción de Nissl por violeta de cresilo
    1. Mount secciones del cerebro en un portaobjetos SuperFrost. Para la determinación del volumen del infarto por el método de Cavalieri en secciones teñidas con Nissl, utilice una fracción 1/20 rebanada-muestreo (1/2 partes de uno de los diez conjuntos de serie recogidos en el paso 2.7, aproximadamente, un total de 7-8 secciones con una distancia entre cortes de 600 μ; Se utilizan m). Tenga cuidado de mantener la orientación anterior-posterior adecuada (área infartada se coloca en el lado derecho).
    2. Realizar tinción de Nissl convencional como sigue:
      1. Permitir secciones de diapositivas montadas se sequen durante varias horas.
      2. Rehidratar secciones deslizables montados y manchar con solución de violeta de cresilo 0,1% durante 5 min.
      3. Deshidratar con una serie graduada de EtOH (70%, 90% y 100%; 5 min por cambio). Limpie las secciones de diapositivas montadas con xileno, añadir distrene-80 plastificante xileno (DPX) medios de montaje y cubrir con un cubreobjetos de vidrio.
  2. El uso de software estereológico para estimar el volumen de infarto por el método de Cavalieri en Nissl-manchado secciones seriadas
    1. Usar parámetros que se muestran en la Tabla 1 para cuantificar el volumen del infarto por el método de Cavalieri 14 y un sistema de estereología, que consta de un microscopio equipado con una cámara, una etapa ordenador XYZ motorizado, y el software estereológicos (La principalinstrucciones que se facilitan a continuación se relacionan a las PC, pero las instrucciones podrían diferir para otros sistemas operativos).
    2. Encienda el PC, microscopio, controlador de fase y la cámara en el orden apropiado. Inicie el software estereológico.
    3. Mueva el objetivo de 10X en su sitio y seleccionar el 10X de la gota objetivo menú.
    4. Desplazarse por la primera sección de Nissl-manchado y encontrar un punto de referencia adecuado. Haga clic en el ratón para establecer el punto de referencia (para moverse hay que activa el botón libre de la alegría).
    5. Estimar el "espesor de la sección montada" (el espesor de corte real teniendo en cuenta la contracción). Pulsar el botón "Posición de enfoque Meter" y calcular el espesor de la parte inferior a la parte superior de la sección.
    6. Crear una herramienta de contorno para la contralesional y áreas ipsilesional y la zona infartada.
      1. Haga clic en el menú "Ver" y seleccione "Configuración de pantalla". Esto abre tél Visualizar diálogo de Configuración.
      2. Seleccione la pestaña "Contornos" y haga clic en el botón "añadir tipo de contorno".
      3. Crear un contorno para cada región para cuantificar y hacerlos visibles en el contorno en el menú desplegable. Haga clic en Aceptar.
    7. Crear una herramienta de marcador para el contralesional y hemisferios ipsilesional y la zona infartada.
      1. Haga clic en el menú "Ver" y seleccione "Configuración de pantalla" para abrir el cuadro de diálogo Configuración de pantalla.
      2. Seleccione la pestaña "Marcadores" y cambiar los marcadores de nombrar al hacer doble clic sobre los marcadores disponibles. Haz que sean visibles en la barra de marcadores. Haga clic en Aceptar.
    8. Active el gerente de la sección.
      1. Haga clic en el menú "Herramientas / Serial Sección Manager". Añadir una nueva sección con el botón "nuevo capítulo". Este botón abre el cuadro de diálogo "Configuración de la Sección de serie".
      2. Ajuste el "Bloque avance" como 30 micras. Ajuste el"Espesor de la sección montada" con el valor estimado en el paso 3.2.5.
      3. Ajuste la "Evaluación Intervalo" como 20. Utilice una fracción de muestreo 1.20 rebanada.
      4. Ajuste "el número de la sección de partida" como 1. Establecer el "valor del eje Z de la parte superior de la primera sección" como 0. Haga clic en Aceptar.
    9. Dibuja un contorno para delinear el hemisferio contralateral.
      1. Seleccione la herramienta hemisferio contralesional (previamente creada en el paso 3.2.6) del contorno en el menú desplegable.
      2. Dibuja un contorno para delinear el hemisferio contralateral.
      3. Para terminar de trazar el hemisferio contralesional, haga clic derecho del ratón y seleccione "Cerrar contorno".
    10. Estimar el contorno hemisferio contralesional por Cavalieri.
      1. Haga clic en el menú "sondas" y seleccione Cavalieri Estimador. Ajuste "Espaciado de cuadrícula" como 100 micras. Set "Rotación Grid" como 0. Establecer la "Bbloquear Avance "como 30 micras. Haga clic en Aceptar.
      2. Seleccione "El contralesional hemisferio" botón de la barra de marcadores. Haga clic derecho en el interior del contorno contralesional hemisferio.
      3. Seleccione "Paint Cavalieri Modo Marcadores". Haga clic derecho en el interior del contorno hemisferio contralesional nuevo y seleccione "Paint marcadores en contorno".
      4. Desactivar Cavalieri Estimador haciendo clic en sondas y Cavalieri Estimador y desactivar el botón marcador contralesional de la barra de marcadores.
    11. Repita el mismo procedimiento para el hemisferio ipsilesional y el área infartada (pasos 3.2.7 y 3.2.8). Guarde los datos después de la estimación del área de cada sección.
    12. Calcular las áreas contralateral, ipsilesional y infartados en el resto de la sección manchada de Nissl.
      1. Crear una nueva sección como en el paso 3.2.6. No modifique los valores introducidos en el cuadro de diálogo "Serial sección Configuración". Haga clic en Aceptar.
      2. Repita los pasos 3.2.7-3.2.8 en la nueva sección.
    13. Exportar los resultados de la cuantificación en un archivo de hoja de cálculo.
      1. Haga clic en "sondas" en el menú de Investigador estéreo. Seleccione "Mostrar lista Run Probe". Esto abre la "Anterior Estereológico ejecuta el diálogo".
      2. Seleccione todas las secciones haciendo clic sobre ellos. Pulse el "Ver Resultados" Button. Esto abre "el Cavalieri Estimador de Resultados", donde se muestran el área y el volumen estimado para cada región.
      3. Para exportar los resultados a un archivo de hoja de cálculo, haga clic en la "copia todos los resultados al portapapeles" y pegarlo a un archivo de Excel con los principales resultados obtenidos de cada región (Tabla 2).
    14. El volumen del infarto Express como mm3 o como% del hemisferio que está infartada (% IH) utilizando la fórmula 15% IH = InfVol / ContrVol * 100, donde
ove_content "> InfVol (Volumen tejido infartado) = ΣInfArea i,
ContrVol (Hemisferio contralesional Volumen) = ΣContrArea i

4. Cuantificación de Estereológico infiltrada Los neutrófilos después de la isquemia cerebral por el fraccionador óptico

  1. La tinción de las secciones del cerebro:
    1. Para estimar el número total de neutrófilos infiltrados después de MCAO por el fraccionador óptico 16, utilizar una fracción de muestreo décimo rebanada. Neutrófilos inmunotinción mediante el uso de técnicas de inmunofluorescencia convencionales con el anticuerpo de rata anti-Ly6G (1A8) y el anticuerpo secundario a la derecha en secciones de libre flotación. Además, una contratinción con un fabricante nuclear como DAPI o TOPRO, aunque no es necesario para la identificación de los neutrófilos, puede hacer más fácil de detectar la zona infartada.
    2. Mount secciones del cerebro en un portaobjetos SuperFrost con el área infartada se coloca en el lado derecho.
  2. Quantificación de los leucocitos infiltrados en el cerebro isquémico por el fraccionador óptico
    1. Utilice los parámetros que se muestran en la Tabla 3 para cuantificar los leucocitos infiltrados en el cerebro isquémico por el enfoque fraccionador óptico con un sistema estereología. Repita los pasos 3.2.1-3.2.5 de la sección 3.
    2. Crear una herramienta de contorno para la zona infartada como se ha descrito en el paso 3.2.6 de la sección 3.
    3. Crear una herramienta de marcador para los neutrófilos como se ha descrito en el paso 3.2.7 de la sección 3.
    4. Active el gerente de la sección y crear una nueva sección que en el paso 3.2.8. En este caso, establezca la "Evaluación Intervalo" como 10 (una fracción de muestreo 1/10 rebanada se utiliza para estimar el número de neutrófilos).
    5. Seleccione la opción "Infartado Area" herramienta de contornos (creado previamente en el paso 4.2.1) del contorno en el menú desplegable. Dibuja un contorno para delinear el área infartada en 10X objetivo. Cambie el objetivo de 100X para realizar neutrophil cuantificación (no se olvide de seleccionar el 100X de la gota objetivo menú hacia abajo).
    6. Haga clic en "sondas" del menú y seleccione la opción "fraccionador óptico". Ajuste el "XY Colocación de contar Frames" como 230 para X e Y tamaño de la cuadrícula. Set "Rotación Grid" como 0. Ajuste el "Bloque de Avance" como 30 micras. Haga clic en Aceptar.
    7. Seleccione el botón "neutrófilos" de la barra de marcadores. Marcos manchada neutrófilos en la zona infartada. Una vez acabado, desactive la sonda fraccionador óptico haciendo clic en "sondas" y "fraccionador óptico". Desactivar el botón de neutrófilos desde la barra de marcadores.
    8. Repita el mismo procedimiento para cada sección (4.2.4-4.2.9).
    9. Exportar los resultados de la cuantificación en un archivo de hoja de cálculo.
      1. Haga clic en "sondas" en el menú de Investigador estéreo. Seleccione "Mostrar la lista Run Probe" para abrir el "Corre estereológicos anteriores"diálogo.
      2. Seleccione todas las secciones haciendo clic sobre ellos. Pulse el "Ver Resultados" para abrir "fraccionador Resultados ópticas", donde se muestra el número estimado de los neutrófilos.
      3. Exportar los resultados a un archivo de hoja de cálculo haciendo clic en el "copiar todos los resultados al portapapeles" y pegarlo en un archivo de hoja de cálculo.

Análisis 5. Cerebro disociación y Citometría de Flujo

NOTA: mieloide caracterización subpoblación por citometría de flujo en el tejido cerebral fresco se puede utilizar como una alternativa a la caracterización de neutrófilos previo realizado en secciones de cerebro fijos y inmunoteñidas.

  1. Disociación Cerebro y preparación suspensión de células individuales
    1. Hacer 10 ml / animal de un (RPMI) RPMI solución -Percoll que contiene 8 ml de RPMI, 1 ml de 30% de Percoll y 1 ml de una (solución salina tamponada con fosfato) 10x PBS.
    2. Rcerebro de ratón emove después de MCAO como se describe en la etapa 2.3.
    3. Bajo el microscopio, diseccionar áreas centrales y peri-infarto de la corteza ipsilateral de cerebro de ratón isquémico (o una región similar de farsa y los animales no tratados previamente) del cerebro. Peso tejido cerebral y colocarlo en 5 ml de RPMI enfriado con hielo-Percoll (el paso de peso puede llevar a cabo para la normalización entre los grupos experimentales).
    4. Disociar el tejido en una suspensión de células individuales utilizando un triturador de tejidos de tipo Potter Elvehjem con manos de mortero de teflón.
    5. Transferencia de suspensiones de células a un tubo de ultracentrífuga 50 ml y añadir 5 ml más de solución de RPMI-Percoll a las muestras.
    6. Centrifugar las suspensiones de células a 7800 xg durante 30 min a 25 ºC. Después de la centrifugación, asegurar una capa de color blanco correspondiente a la mielina aparece en la parte superior de la solución.
    7. Eliminar la capa de mielina cuidadosamente y filtrar las suspensiones de células enteras, incluyendo las células sedimentadas, a través de 40-m Straine de malla de nylonr.
    8. Añadir 10 ml de RPMI en el colador para asegurar que todas las células se filtran y colocar la solución en un tubo de 50 ml. Añadir 30 ml de RPMI y centrifugar los 50 ml de suspensión celular a 600 xg durante 10 min a TA.
    9. Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento de leucocitos con 1 ml de PBS. Añadir 4 ml de tampón de lisis (150 mM NH 4 Cl, 10 mM NaHCO 3 y EDTA 0,1 mM) y se incuban las células durante 2-3 min a TA para lisar los eritrocitos de la suspensión celular. Centrifugar la solución a 600 xg durante 10 min a 4 ºC.
  2. Tinción celular y citometría de flujo
    1. Preparar un cóctel de etiquetado para citometría de flujo, que contiene 200 l de PBS-BSA (1%) 1: 100 Fc-Block, 01:40 anti-CD45-PerCP rata, 1:40 anti-Ly6G-APC rata, uno y cuarenta contra CD11b-FITC de rata y 01:40 anti-Ly-6C-PE de rata por muestra.
    2. Resuspender las células en el cóctel de etiquetado e incubar las muestras durante 45 min en hielo.
    3. Lave el cóctel etiquetadocon 1 ml de PBS frío y centrifugar las células a 600 xg durante 10 min a 4 ºC. Resuspender el precipitado con 100 l de flujo FACS y adquirir la totalidad de la suspensión celular por citometría de flujo.
    4. Utilice un software de análisis de citometría de flujo para caracterizar y cuantificar las poblaciones de células.
      1. Los subconjuntos de leucocitos correspondientes al cóctel de etiquetado preparados en este protocolo se pueden caracterizar de la siguiente manera: + CD45 lo CD11b: células microgliales residentes; CD45 hi CD11b + Ly-6G +: neutrófilos; CD45 hi CD11b + Ly-6G - Ly-6C hi: monocitos proinflamatorios.

Representative Results

El modelo de isquemia cerebral que se muestra aquí genera infartos visto exclusivamente en la corteza, sin afectar el tejido estriatal desde las ramas lenticulostriatal de la MCA que irrigan el cuerpo estriado no se ocluyen (Figura 1). Por tinción de Nissl, el área dañada puede ser identificado como un área cortical hipocrómica (Figura 2). Este modelo se caracteriza por volúmenes de infarto altamente reproducibles a las 24 horas después de MCAO (% IH 15,89 ± 0,28) estimado por el método de Cavalieri en secciones teñidas con Nissl (Figura 2). Estimación del volumen infartado por el método de Cavalieri es un enfoque preciso con un bajo error que se refleja en el coeficiente de error (CE) de Gundersen en los hemisferios contralesional y ipsilesional así como en el área infartada (Tabla 2). Volumen de tejido dañado puede ser expresada en mm 3, sino también como% IH usando la fórmula en la sección 3.2.13. Además, la estimacióndel volumen total de las regiones ipsilesional y contralesional permite el cálculo del índice de edema de corregir el volumen infartado y para evitar una sobreestimación del tejido dañado (Tabla 2).

Dado el procesamiento de seccionamiento de serie del tejido cerebral, esto puede ser aprovechado para llevar a cabo una estimación exacta del número total de las subpoblaciones de células, como los neutrófilos infiltrados, en el área isquémica, utilizando el enfoque fraccionador óptico (Figura 3 y Tabla 4) con los parámetros que se muestran en la Tabla 3. Este protocolo se estima un total de neutrófilos (células Ly6G-positivos) en el área infartada de 23.328 ± 3.623 a las 24 horas y 82 856 ± 8143 a las 48 h en ratones después pMCAO (Figura 3D). De acuerdo con estudios anteriores, la infiltración de neutrófilos se correlaciona directamente con el tamaño del infarto (Figura 3E). Estimación de tél número de neutrófilos por el método fraccionador óptico es un enfoque preciso con un bajo error que se refleja por la CE de Gundersen (Tabla 4).

El aislamiento de leucocitos y citometría de flujo protocolo de caracterización permite el aislamiento de 47.922 ± 23.174 células mieloides a partir de la corteza del hemisferio ipsilesional de los ratones isquémicos. Esto comprende el 10-30% de los eventos totales se encuentran en la suspensión celular. La gran mayoría de los eventos capturados utilizando este protocolo presente un parámetro bajo FSC, asociado a restos celulares (Figura 4). Tinción CD11b muestra que las células CD11b + tienen un valor FSC más alto (Figura 4), ​​lo que sugiere que los restos celulares no está etiquetado con este marcador y, como se ha indicado anteriormente, que se puede excluir del análisis adicional ajustando el umbral FSC en 200 9. La cantidad variable de los residuos celulares obtenidos con este método sugiere que las diferencias en el proceso de la muestraING (tiempo, la conservación del tejido, temperatura de la muestra, la eliminación de mielina eficiente, etc.) puede dar cuenta de ello. Además, también se necesita el uso de filtros celulares para evitar la presencia de abrazaderas celulares en las muestras; este paso se debe hacer antes de la tinción celular. Usando la estrategia gating se muestra en la Figura 5 que se basa en CD11b y CD45 expresión, podemos discriminar entre residente y células mieloides infiltrado en el tejido isquémico. Este CD11b + aumento de la población en el hemisferio isquémico en comparación con la ingenua y con el grupo de simulación, en el que estas células se asocian principalmente a una baja expresión de CD45 indica que la microglia está proliferando después de la isquemia (Figura 4, Figura 5 y Tabla 5) . Esta diferencia es probablemente debido a la infiltración de células de la periferia, como se evidencia por la aparición de una subpoblación de células CD11b + hi CD45 en el cerebro isquémico (Figura 4, La Figura 5 y la Tabla 5), que es de bajo número en ingenuo y en el cerebro simulado. La contribución de los infiltrados a la población de células CD11b + en la isquemia cerebral es un proceso muy dinámico 4. En el modelo MCAO por ligadura, que puede variar de 30% a 60% del total de células CD11b +, dependiendo del tamaño de la lesión y del tiempo cuando la caracterización se ha hecho. Los neutrófilos, caracterizadas como células Ly-6G +, son los más numerosos de la población de células infiltradas encontrado a las 24 horas después de MCAO en el cerebro isquémico ratón usando este modelo de isquemia cerebral, ya que constituyen el 70-80% de la CD11b + CD45 hi. El resto de las células son en su mayoría una subpoblación de CD11b + CD45 hi Ly-6G - Ly-6C hi monocitos proinflamatorios. En este modelo, esta población se incrementará en número en las áreas cerebrales isquémicos de 24 a 48 horas después de MCAO.


Figura 1:. Procedimiento quirúrgico para la ligadura de MCA (A) después de la retracción del músculo temporal, un pequeño craneotomía se lleva a cabo en el cráneo del ratón. MCA es ligado por un nudo o un nudo corredizo con sutura 9/0. (B) Imágenes representativas de la lesión cortical generada por el modelo MCAO. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Cuantificación de volumen de infarto por Cavalieri. (A) Imágenes representativas de secciones del cerebro teñidas con Nissl 24 horas después de la ligadura permanente MCA. El gran aumento muestra el área hipocromatic después de la tinción de Nissl queidentifica el área dañada (núcleo) después de MCAO. También se muestra la (PI) región peri-infarto. (B) Cuantificación del volumen del infarto representado como% hemisferio infartado (IH%) utilizando el método de Cavalieri en secciones teñidas con Nissl de serie, 24 horas después de MCAO (n = 50 ratones ).

Figura 3
Figura 3: la cuantificación Estereológico de neutrófilos en el área infartada 24 y 48 hr después de la ligadura, utilizando el método fraccionador óptico. (A) Imagen Representante de neutrófilos (células infiltradas Ly6G-positivos) en el área isquémica en 24 horas después de MCAO. Delimitación muestra el área infartada. (B, C) ​​Ejemplos de un disector óptico para la cuantificación de neutrófilos por el fraccionador óptico. (D) Cuantificación de los neutrófilos totales en la región infartada a las 24 y 48 h (n = 4 ratones). (E)La correlación del número de neutrófilos con el tamaño del infarto a las 24 y 48 horas después de la ligadura de MCA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4:. Representante análisis de dispersión punto de parcelas de leucocitos cerebrales obtenido de hemisferios ingenuo, farsa y isquémica (24 horas después de MCAO) sobre la base de parámetros físicos (SSC y FSC) Se identificó una población de eventos que expresan CD11b (rojo) en todos los grupos. Esta población fue cerrada y caracteriza de acuerdo a la expresión de CD45. Las células que expresan bajos niveles de CD45 (verde) estaban presentes en la corteza cerebral isquémica y no isquémica y correspondían a las células microgliales. En contraste, las células que expresan altos niveles de CD45 (amarillo) eran sóloque se encuentra en el hemisferio isquémico y en menor medida en grupo simulado. Un análisis más detallado de la población de alta CD11b + CD45 indica que los neutrófilos (Ly-6G + células, azul) y pro-inflamatorias monocitos (células hi Ly-6C, naranja) son los principales subpoblaciones de células que se encuentran en el cerebro se infiltra en las 24 horas después del accidente cerebrovascular. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5:. Gating estrategias para diferenciar residente a partir de células mieloides infiltrado en el tejido isquémico celular CD11b + fueron cerrada primero de acuerdo con la intensidad de fluorescencia de isotipo (A). Un gráfico de puntos representativos de las suspensiones de células del cerebro isquémico se muestra en la esquina superior derecha del panel. EnAdemás, los valores típicos para el número total de eventos y para el número de CD11b + eventos adquiridos usando esta técnica se muestra (no de células / hemisferio cerebral isquémico;. (A) análisis de intensidad de fluorescencia CD45 de las células CD11b + se muestra en el panel B. Un análisis representativo gráfico de puntos de CD45 y CD11b expresión de la cerrada subpoblación CD11b + se muestra en la esquina superior derecha del panel. Además, el número típico de células CD45 hi lo CD45 adquiridos por el hemisferio cerebral isquémico utilizando esta técnica se muestra (B).

Los parámetros utilizados para el método de Cavalieri
Sección Espesor (t) 30 micras
Objetivo 10X
Fracción de muestreo de la rebanada (SSF) 1/ 20
Distancia entre secciones 600 micras
Espaciado de cuadrícula 100 micras

Tabla 1: Parámetros utilizados para la cuantificación estereológicos del tejido infartado.

Resultados Contralesional Ipsilesional Infarto
Superficie (μm²) 151460000 155060000 22600000
Volumen (μm³) 90876000000 93036000000 13560000000
Volumen corregido por
A lo largo de la proyección (μm³)
89957100000 92046300000 <strong> 13416600000
Coeficiente de error (Gundersen),
m = 0
0,068 0,077 0,067
Coeficiente de error (Gundersen),
m = 1
0,015 0,017 0,015
Coeficiente de error (Gundersen),
alfa (q)
0,068 0,077 0,067
% Hemisferio Infartado 14.90
Cerebral Edema (Ips Vol / Vol Cont) 1.02

Tabla 2: Ejemplos representativos de volúmenes contralesional, ipsilesional y de infarto por el método de Cavalieri utilizar el Software Investigador estéreo.

Parámetros utilizados para el fraccionador óptico
Sección Espesor (TSF) 30 micras
Objetivo 100X
Fracción de muestreo de la rebanada (SSF) 1/10
Contando Cuadro Altura 40 micras
Contando Ancho de marco 40 micras
Tamaño de la cuadrícula X 230 micras
Tamaño de la cuadrícula X 230 micras
Safe Guard 2 micras
Óptico Disector Altura 14 micras

Tabla 3: Parámetros utilizados para la cuantificación estereológico de neutrófilos infiltrados tras la isquemia cerebral con la sonda fraccionador óptico utilizando el Software Investigador estéreo.

Estimación de neutrófilos por el fraccionador óptico
Número de sitios de muestreo 430
Forma Factor 6.24
Marcadores totales Contado 166
Los neutrófilos Estimados fraccionador óptico 117,608.03
Coeficiente de error (Gundersen), m = 0 0.22
Coeficiente de error (Gundersen), m = 1 0.09

Tabla 4: Ejemplo representativo de los neutrófilos infiltrados estimados después de la isquemia cerebral con la sonda fraccionador óptico utilizando el Software Investigador estéreo.

CD11b + Los neutrófilos Los monocitos La microglía
Ingenuo 25863 ± 4,575.8 473 ± 75.8 525 ± 191,4 19012 ± 1523
Sham 24 horas 24563 ± 5263 873 ± 192,5 1.124 ± 391,5 23734 ± 2910
pMCAO 24 horas 47922 ± 23174 4.874 ± 748,7 4,826 ± 1,345 35395 ± 10833

Tabla 5: Los resultados representativos de las células mieloides estimados después de la isquemia cerebral con la citometría de flujo enfoque.

Discussion

El modelo de isquemia cerebral introducido aquí da los volúmenes de infarto altamente reproducibles determinaron 24-48 horas y 7 días después de la ligadura de MCA por diferentes enfoques 8,15,17. Este modelo MCAO tiene una tasa de mortalidad baja (menos del 1%) en comparación con otros, minimizando el número de animales utilizados en los estudios. Un paso crítico para obtener esta baja tasa de mortalidad es de asepsia adecuadas para evitar las infecciones que pudieran afectar la supervivencia después del accidente cerebrovascular inducción. Este modelo MCAO no sólo se puede utilizar como un modelo MCAO permanente, que se considera un modelo relevante para la investigación clínica de traslación 18, sino también como un modelo transitorio por la ligadura transitoria de la CCA y MCA con un nudo corredizo y la reperfusión posterior en el tiempo deseado 19. Este método ha sido utilizado con éxito en ratones y ratas 17,20. Todo esto evidencia indica que MCAO por la ligadura es un modelo versátil alta de la isquemia cerebral con múltiples aplicaciones. Un critiCal paso de esta técnica es que requiere cirugía invasiva bajo un microscopio estereoscópico; la craneotomía debe realizarse con mucho cuidado para no dañar el hueso cigomático, así como la MCA. Sin embargo, (no se realiza que están sometidos a la técnica quirúrgica sino CCA y MCA ligadura) el uso de animales de simulación proporciona una herramienta útil para discriminar los efectos del procedimiento dependiente quirúrgicos. La extensión de la lesión cerebral después de esta técnica puede ser cuantificada por varios métodos. Nuestro protocolo de seccionamiento cerebro, la tinción de Nissl y posterior estimación del volumen por Cavalieri permite una cuantificación exacta de la región dañada y minimiza el número de ratones utilizados en este tipo de estudios, ya que las secciones del cerebro de serie también se pueden utilizar para diferentes análisis inmunohistoquímico. Para un mejor rendimiento de esta metodología, es fundamental para elegir los parámetros adecuados utilizados en el software estereología (Tabla 1), que será necesario para la estimación ªe volumen de las diferentes regiones por la fórmula: V = 1 / SSF * a * f * t ΣP i (SSF es la fracción de muestreo rebanada, t es el espesor medio de las secciones, una f es el área de la separación de la red y ΣP el número de puntos que golpean la estructura).

El MCAO distal por la ligadura puede ser útil para caracterizar los leucocitos infiltrados y subpoblaciones de células inmunes 8,13 que participan en el proceso inflamatorio después de una lesión cerebral 1-4. Aquí, se proponen dos metodologías diferentes para la caracterización de las células inmunes del cerebro, un enfoque estereológico precisa y un análisis de citometría de flujo para una mejor caracterización de varias subpoblaciones de leucocitos.

Tomando ventaja de seccionamiento cerebro de serie, la cuantificación del número total de neutrófilos se puede lograr por el método del fraccionador óptico 16, que estima el número total de células a partir del número de células en la muestra del ingenioha muestreo aleatorio (SRS) conjunto sistemático de espacios virtuales imparciales de conteo que cubren toda la región de interés, en nuestro caso la región del infarto, con una distancia uniforme entre los espacios virtuales de conteo imparciales en las direcciones X, Y y Z. Este método proporciona una herramienta precisa para estimar el número total de neutrófilos en el cerebro isquémico en diferentes momentos después de la ligadura. Aunque no se ha demostrado en este estudio, este protocolo también se puede utilizar para la estimación de las diferentes subpoblaciones de neutrófilos después de la isquemia y 21 para una cuantificación exacta de cualquier otra población de células que se encuentra en el cerebro isquémico como otros leucocitos infiltrados (monocitos / macrófagos) así como la estimación neuronas supervivientes o incluso para la cuantificación neurogénesis después del accidente cerebrovascular. El paso más importante para una estimación precisa en el área deseada es la selección de los parámetros adecuados, como los que se muestran en la Tabla 3 para la cuantificación de los neutrófilos en la zona isquémica.Estos parámetros se utilizan para que el software estereología para calcular el número total de células positivas (N) mediante el uso de la ecuación N = ΣQ- x 1 / ssf x 1 / asf x 1 / TSF (ΣQ- es el número total de células contadas con fraccionador, ssf es la fracción de muestreo sección, asf es el área fracción de muestreo, y TSF es el espesor fracción de muestreo) 5. Aunque esta metodología es más lenta que otras técnicas de cuantificación (por ejemplo, el análisis de marcadores de los neutrófilos por mg de tejido, densitometría de imágenes o el número de neutrófilos por campo de representación), tiene la ventaja de ser un imparcial y una técnica sólida que proporciona una precisa la cuantificación del número de células.

El enfoque de aislamiento de leucocitos cerebro permite una identificación y cuantificación simultánea de varios subtipos de células inmunes sin la necesidad de sesgo del sistema por tinción in vivo o manipulaciones genéticas. Tras la clasificación celular de la p mieloide caracterizadoopulations o su separación inmunomagnética se pueden utilizar para múltiples aplicaciones posteriores, tales como nuevos estudios sobre expresión de genes o proteínas. La caracterización precisa de neutrófilos, monocitos y microglía obtenido con este método proporciona una alta especificidad con respecto a los métodos existentes, tales como los estudios de inmunohistoquímica, una ventaja que permite la asignación de funciones específicas a las diferentes células mieloides que median cerebro respuesta inmune innata. Además, se puede ampliar aún más para caracterizar otras poblaciones cerebrales con la etiqueta apropiada, como sangre nacido macrófagos (CD11b + CD45 hi CD68 +), y se puede aplicar para el estudio de otras patologías del SNC o lesiones. Por lo tanto, esta técnica proporciona una herramienta esencial para explorar la heterogeneidad de la respuesta inflamatoria en el cerebro. Una limitación principal de esta técnica reside en la preparación de las suspensiones de leucocitos a partir de tejido cerebral fresco, que puede alterar laestado de activación de las células o su alteración antígeno. Aunque esta técnica permite una caracterización cualitativa más detallada en comparación con los estudios inmunohistoquímicos, que proporciona una cuantificación precisa menos basado en el aislamiento de células. A pesar de esto, la eficacia de nuestro protocolo de aislamiento de células es similar a otras metodologías publicadas 9 y puede ser utilizado de manera eficiente para detectar diferencias en el número de células inmunes del cerebro entre el control y los grupos de MCAO o incluso entre los grupos MCAO sometidas a diferentes tratamientos 8.

Los pasos críticos de este protocolo son la disección del tejido, el procedimiento de interrupción del tejido, y la retirada de mielina. En cuanto a la recogida de tejidos, una etapa de normalización puede ser incluido (pesando el tejido recogido) para evitar la variabilidad debido a las diferentes actuaciones de disección. Además, la normalización entre los diferentes grupos MCAO también puede ocurrir a través de el volumen de infarto (determinado previamente por Magnetic Resonance). Otra manera de resolver este problema es utilizar todo el hemisferio ipsilateral de ambos grupos isquémicos y de control, o incluso usar el hemisferio contralateral del ratón isquémico como un control para minimizar el número de animales utilizados. Si bien este enfoque evita diferencias entre cada disección, tiene una desventaja principal; un factor de dilución se añade mediante el aumento del número total de células, pero no el número de células mieloides que se encuentran exclusivamente en las áreas centrales y peri-infarto de la corteza ipsilateral. En cuanto a la interrupción del tejido, este protocolo ilustra los pasos para la ruptura mecánica de las células del cerebro, evitando tratamientos enzimáticos y prevenir antígeno de superficie alteración 9,22, una cuestión esencial para su posterior análisis cualitativo y cuantitativo de las subpoblaciones de células inflamatorias. Además de la preparación de la suspensión celular de interés, la eliminación de mielina de muestras de cerebro es un paso muy recomendable para evitar interferencias con downstresma aplicaciones, tales como la separación de células inmunomagnética o citometría de flujo 23,24. Esto se puede lograr usando diferentes métodos, como sacarosa o gradientes de Percoll, o perlas anti-mielina. Aquí, y en base a estudios previos que comparan diferentes métodos para el aislamiento de suspensión de células del cerebro, rotura mecánica en combinación con el uso de Percoll para eliminar la mielina se utiliza para mejorar el rendimiento y la viabilidad celular 25.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Photonic Led F1 WPI 571329-8 Equipment
Temp Controller  Panlab  HB 101/2 Equipment
Volvere GX NSK Ne22L Equipment
Microscope WPI PZMIII-BS Equipment
Stainless Steel Burrs FST 19007-14 Surgical material
Forceps Dumont #5/45  FST 11251-35 Surgical material
Forceps Dumont #5SF FST 11252-30 Surgical material
Suture 6/0 LorcaMarin 55108 Surgical material
Suture 9/0 LorcaMarin 61966 Surgical material
Nikon Eclipse  Nikon TE300 Equipment
Isoflurane Esteve 571329-8 Chemical
Sodium Pentobarbital Vetoquinol 570681 Chemical
Freezing microtome Leica Microsystems GmbH SM2000R Equipment
Superfrost slides Thermo Scientific  2014-07 Lab material
Cresyl violet acetate Sigma C5042 Chemical
Microscope  Nikon Nikon Eclipse TE300 Equipment
XYZ motorized computer stage and controller Ludl electronics Products Equipment
Stereo Investigator System Microbrightfield Version 7.003 software Software
5 ml Tissue Grinder, Potter-Elv with teflon pestle Thomas Scientific 0913X70 Lab Material
Polypropylene 50 ml Oak Ridge Centrifuge Tube Nalgene 3119-0050  Lab material
Percoll Sigma p1644-100 Chemical
RPMI 1640 Lonza BE12-702F Chemical
Beckman Ultracentrifugue Beckman Coulter Equipment
Beckman Coulter ultracentrifuge rotor 45 Ti Beckman Coulter Equipment
BD Sterile Cell Strainer, 40 Micron BD BD 352340 Lab Material
Bovine Serum Albumin Sigma A3733-500G Reagment
FcR Blocking Reagent, mouse Miltenyi 130-092-575 Antibody
CD11b-FITC, human and mouse Miltenyi 130-098-085 Antibody
CD45-PE, mouse Miltenyi 130-102-596 Antibody
Anti-Ly-6G-APC, mouse Miltenyi 130-102-936 Antibody
PerCP/Cy5.5 anti-mouse Ly-6C Biolegend 128012 Antibody
BD FACS Flow BD 342003 Reagment
BD FACSCalibur; 4-color BD 342975 Equipment
BD Cell Quest Pro Software BD Software
FlowJo software Treestar inc. Software

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References

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