Stereologica e Citometria a Flusso Caratterizzazione dei leucociti sottopopolazioni in modelli di transitori o permanenti Cerebral Ischemia

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Summary

Cervello cellule mieloidi caratterizzazione seguente ictus può essere eseguita utilizzando il metodo stereologia frazionatore ottica, o da una analisi citofluorimetrica del cervello leucociti sospensioni. Entrambi sono tecniche utili per effettuare un'accurata distinzione fenotipica delle principali sottopopolazioni di cellule mieloidi trovati nel cervello ischemico.

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Ballesteros, I., Cuartero, M. I., Moraga, A., de la Parra, J., Lizasoain, I., Moro, M. Á. Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia. J. Vis. Exp. (94), e52031, doi:10.3791/52031 (2014).

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Abstract

Attivazione della microglia, così come stravaso di macrofagi e neutrofili ematogene, si ritiene di svolgere un ruolo fondamentale in lesioni cerebrali dopo l'ictus. Queste sottopopolazioni di cellule mieloidi possono visualizzare diversi fenotipi e funzioni e devono essere distinti e caratterizzati per studiare la loro regolazione e il contributo al danno tissutale. Questo protocollo prevede due diverse metodologie per la caratterizzazione delle cellule immunitarie del cervello: un approccio stereologica preciso e citometria a flusso. L'approccio stereologica si basa sul metodo frazionatore ottica, che calcola il numero totale di cellule in una zona di interesse (cervello infartuata) stimato per il campionamento casuale sistematico. Il secondo approccio caratterizzazione fornisce un modo semplice per isolare sospensioni leucociti cervello e caratterizzare loro mediante citometria di flusso, consentendo la caratterizzazione della microglia, infiltrato monociti e neutrofili del tessuto ischemico. Inoltre, anche details un modello ischemia cerebrale nei topi che colpisce esclusivamente la corteccia cerebrale, generando infarti altamente riproducibili con un basso tasso di mortalità, e la procedura per l'elaborazione del cervello istologica di caratterizzare il volume dell'infarto dal metodo Cavalieri.

Introduction

Morfologiche, fenotipiche e alterazioni di espressione genica di microglia, così come stravaso e attivazione dei macrofagi e neutrofili ematogene si ritiene di svolgere un ruolo chiave nella cascata fisiopatologico seguente lesione cerebrale 1-4. Questo protocollo prevede due approcci per stimare il numero di diversi sottoinsiemi di cellule mieloidi del cervello ischemico e per svolgere la loro caratterizzazione fenotipica. Inoltre, fornisce anche una descrizione di un modello sperimentale di ischemia cerebrale in topi, che consiste nella legatura transitoria o permanente di entrambi distale dell'arteria cerebrale media (MCA) e l'arteria carotide comune (CCA), compreso il modo di valutare l'infarto con il metodo Cavalieri accurata utilizzando un software stereologica.

Il primo approccio per caratterizzare sottogruppi di cellule mieloidi del cervello ischemico è un metodo stereologica basato sull'approccio frazionatore ottica 5. Questo è il piùcomunemente usato sonda stereologica in scienze biologiche e fornisce un elevato grado di precisione con bassi coefficienti di errore 5-7. Questa è la scelta migliore per la quantificazione delle cellule quando il tessuto viene tagliato in sezioni, in quanto evita la polarizzazione sulla stima delle cellule a causa della frammentazione del tessuto in sezioni. Questo metodo è un modo molto potente per caratterizzare i numeri, dinamiche e cambiamenti fenotipici di sottopopolazioni neutrofili infiltrati del tessuto ischemico 8.

Il secondo approccio caratterizzazione è basato su protocollo modificato da Campanella e collaboratori 9 che fornisce un modo semplice per isolare cerebrali sospensioni leucociti e caratterizzarli mediante citometria di flusso. In contrasto con tecniche di immunoistochimica convenzionali, citometria a flusso caratterizzazione permette di differenziare tra microglia (CD45 lo CD11b +) e infiltrati cellule mieloidi (CD45 hi CD11b +) in base alla loro difflivelli di espressione di CD45 erente 9-13. Inoltre, monociti pro-infiammatorie (CD45 hi CD11b + Ly-6G - Ly-6C hi), neutrofili (CD45 hi CD11b + Ly-6G +) e altri leucociti sottoinsiemi del tessuto ischemico possono distinguere. Questo approccio fornisce un test affidabile e rapido per valutare neuroinflammation in modelli sperimentali di ischemia cerebrale. Tuttavia, il trattamento del tessuto può influenzare lo stato di attivazione e numero delle diverse popolazioni cellulari presenti nel tessuto ischemico fornire una caratterizzazione semi-quantitativa.

Protocol

NOTA: Tutti i protocolli sperimentali aderito alle linee guida del Comitato della Universidad Complutense benessere degli animali (seguendo le direttive UE 86/609 / CEE e 2003/65 / CE).

1. Cerebral Ischemia Modello

NOTA: Il modello di ischemia cerebrale in questo documento comporta l'occlusione permanente o transitoria sia CCA (comune arteria carotide) e MCA (dell'arteria cerebrale media) mediante legatura con una sutura in nylon.

  1. Preparazioni pre-chirurgiche
    1. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici in autoclave o con una sterilizzatrice perle di vetro. Disinfettare l'area chirurgica con il 70% di etanolo pure.
    2. Anestetizzare il mouse con anestetici appropriati. Ottenere induzione da isoflurano 2,5% e mantenere con isoflurano da 1,5% in una miscela di 80% aria / 20% di ossigeno usando un vaporizzatore. Applicare lacrime artificiali per gli occhi topi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
    3. Posizionare il mouse su una piastra elettrica che è collegato a una tassaDispositivo dback con una sonda di temperatura posizionato nel retto e temperatura impostata a livelli fisiologici (36,5 ± 0,5 ° C) durante la procedura chirurgica.
  2. Common occlusione carotide da legatura
    1. Posizionare il mouse in decubito dorsale e immobilizzarlo con nastro adesivo. Disinfettare la pelle con il 70% di etanolo o povidone ioduro e tagliare i capelli della parte ventrale superiore.
    2. Sotto un microscopio operatorio, fare da 1 cm linea mediana incisione intorno alla superficie ventrale del collo.
    3. Estrarre tessuti molli (oltre tutto tessuto ghiandolare compreso sub-mascellari, sublinguale e parotide) e identificare la partita carotide comune (CCA), che è localizzato lateralmente alla trachea. Ritrarre i muscoli ed esporre CCA sinistra. Sezionare con cura dal nervo vago.
    4. Una volta sezionato, occludere il CCA lasciato da una legatura usando una sutura di nylon 6/0. Legare con un nodo permanente o un nodo scorsoio (per permettere la riperfusione se un modello di ischemia cerebrale transitoria si desidera).
    5. Posizionare il tessuto ghiandolare nella sua posizione originale e chiudere l'incisione sulla pelle collo con una sutura di nylon 6/0.
      NOTA: animali Sham sono sottoposti alla stessa procedura chirurgica come animali MCAO ma il CCA non è occluso.
  3. Distal occlusione dell'arteria cerebrale media da legatura
    1. Posizionare il mouse sul lato destro e immobilizzarlo con nastro adesivo. Disinfettare la pelle testa con il 70% di etanolo o povidone ioduro e tagliare i capelli della testa del mouse (rimuovere i capelli dopo il taglio).
    2. Sotto un microscopio operatorio, fare una incisione cutanea tra l'occhio e l'orecchio. Spostare la pelle di distanza e tenerlo con del nastro adesivo.
    3. Effettuare una incisione orizzontale sul muscolo temporale da destra verso sinistra. Poi, una seconda incisione verticale sul lato destro del muscolo temporale (fare attenzione ad evitare segata temporale). Separare muscolo temporale dal cranio e tenerlo con una sutura di mantenere una superficie del cranio pulita.
    4. Pulire la superficie del craniofreddo salina sterile per rilevare la posizione esatta del dell'arteria cerebrale media sinistra (MCA) via trasparenza cranio. Eseguire una craniotomia rotonda (1 mm di diametro) con una fresa in acciaio inox nel lobo frontale tra zigomatica e l'osso squammoso. Rimuovere accuratamente il cranio ed esporre la MCA.
    5. Applicare una piccola quantità di soluzione salina sterile fredda alla superficie del cervello e rimuovere le meningi (Dura e aracnoide) utilizzando pinze.
    6. Eseguire legatura MCA sinistra nel bagagliaio distale appena prima della biforcazione tra il frontale e posteriore rami MCA. Occludere il MCA lasciato da una legatura usando una sutura di nylon 9/0. Legare con un nodo permanente o un nodo scorsoio (per permettere la riperfusione se un modello di ischemia cerebrale transitoria si desidera). Il periodo di tempo tra il CCA e MCA occlusione è di circa 10-20 minuti, a seconda dell'esperienza dell'operatore.
    7. Posizionare il muscolo temporale nella sua posizione originale e chiudere il incision sulla pelle collo con una sutura di nylon 6/0.
    8. Ritorna il mouse alla gabbia per recuperare da anestesia (di solito 5-10 minuti) e iniettare il mouse con buprenorfina intraperitoneale (IP) (0,3 mg / kg).
      1. Monitorare il mouse per diversi hr per rilevare qualsiasi disagio (non lasciare incustodito il mouse fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale). Dal peso post-chirurgica perso è generalmente osservata, posizionare purè di cibo in una capsula di Petri per facilitare mangiare.
    9. Quando l'animale è completamente recuperato, tornare alla compagnia di altri animali.
    10. Se un modello MCAO transitoria è desiderato, anestetizzare nuovamente il mouse e rimuovere il cappio del CCA e l'MCA per consentire riperfusione (di solito tra 0,5-2 hr (figura 1)).
      NOTA: animali Sham sono sottoposti alla stessa procedura chirurgica come animali MCAO ma il MCA non è occluso.

2. Perfusione e Seziodicazioni di tessuto cerebrale

  1. 24 o 48 ore dopo MCAO, sacrificano il mouse con una dose letale di anestetico (ad esempio, sodio pentobarbital, IP 86 mg / kg o un sovradosaggio con isoflurano).
  2. Profumato il mouse con tampone fosfato 0,1 M seguito da 4% paraformaldeide (PFA) in tampone fosfato (pH 7,4).
  3. Rimuovere il cervello come segue:
    1. Decapitare l'animale appena sopra il midollo spinale.
    2. Eseguire un'incisione postero-anteriore sulla pelle della testa per esporre il cranio. Fare due tagli laterali alla giunzione delle pareti laterali e la base del cranio e rimuovere il piccolo pezzo di osso.
    3. Fare un taglio attraverso il cranio, lungo la sutura sagittale.
    4. Rimuovere il cranio sovrastante ogni emisfero utilizzando una pinza per esporre il cervello. Utilizzare una spatola per separare il cervello dal cranio e trasferirlo in soluzione al 4% PFA.
  4. Post-fix per 3 ore a 4% soluzione PFA al 4 ° C.
  5. Rimuovere la soluzione PFA e incubatdi e il cervello per 48 ore in una soluzione di saccarosio del 30% per cryoprotect cervello.
  6. Rimuovere la soluzione di saccarosio e congelare il cervello rapidamente in isopentano freddo (-40 ° C). Conservare cervello congelato a -80 ° C.
  7. Ottenere sezioni coronali del cervello (30 micron) con un microtomo di congelamento. Raccogliere dieci serie in serie in una soluzione crioconservante. Ogni set di serie è composto da circa 14-16 fette coronali con una distanza di 300 micron interslice che adeguatamente campione del cervello di topo tra 1,94 e -2,46 posteriormente al bregma.

3. Nissl colorazione e Infarto Volume Stima

  1. Colorazione Nissl dal violetto cresolo
    1. Mount sezioni di cervello in un vetrino da microscopio SuperFrost. Per la determinazione del volume dell'infarto del metodo Cavalieri in sezioni Nissl-colorate, utilizzare una frazione 1/20 slice-campionamento (1/2 sezioni di una delle dieci serie seriali raccolti nel passo 2.7, approssimativamente, un numero totale di 7-8 sezioni con una distanza di 600 μ interslice; M sono utilizzati). Fare attenzione a mantenere il corretto orientamento antero-posteriore (zona infartuata è posta sul lato destro).
    2. Eseguire tradizionale colorazione Nissl come segue:
      1. Consenti sezioni montato diapositive asciugare per diverse ore.
      2. Reidratare sezioni montato diapositive e macchiare con una soluzione di violetto cresolo 0,1% per 5 min.
      3. Disidratare con una serie graduata di EtOH (70%, 90% e 100%; 5 min a cambio). Pulire le sezioni montate scorrevoli con xilene, aggiungere distrene-80 plastificante xilene (DPX) mezzo di montaggio e coprire con un coprioggetto di vetro.
  2. Utilizzando il software stereologica di stimare il volume di infarto con il metodo Cavalieri in Nissl-macchiato sezioni seriali
    1. Utilizzare parametri mostrati nella tabella 1 per quantificare volume dell'infarto dal metodo Cavalieri 14 e un sistema stereology, che consiste di un microscopio dotato di telecamera, un secondo calcolatore XYZ motorizzato, e software stereologica (The mainindicazioni fornite di seguito si riferiscono ai PC, ma le indicazioni potrebbero differire per altri sistemi operativi).
    2. Accendere il PC, microscopio, controllore palco e fotocamera nell'ordine appropriato. Avviare il software stereologica.
    3. Spostare l'obiettivo 10X in posizione e selezionare il 10X dal menu a scopo menu a discesa.
    4. Muoversi la prima sezione Nissl-macchiato e trovare un punto di riferimento adeguato. Click del mouse per stabilire il punto di riferimento (per muoversi occorre attiva il pulsante gioia libera).
    5. Stima il "spessore di taglio montato" (lo spessore di taglio effettiva tenendo conto del ritiro). Premere il tasto "Focus Position Meter" e calcolare lo spessore dal basso verso l'alto della sezione.
    6. Creare un utensile del profilo per il controlesionale e aree ipsilesionale e la zona infartuata.
      1. Fare clic sul menu "Visualizza" e selezionare "Impostazioni schermo". Questo apre tegli Visualizzare Impostazioni Dialog.
      2. Selezionare la scheda "Contorni" e fare clic sul pulsante "aggiungi tipo di contorno".
      3. Creare un profilo per ogni regione per quantificare e renderli visibili nel profilo menù verso il basso. Fare clic su OK.
    7. Creare uno strumento Marker per la controlesionale e emisferi ipsilesionale e la zona infartuata.
      1. Fare clic sul menu "Visualizza" e selezionare "Impostazioni schermo" per aprire la finestra Impostazioni schermo.
      2. Selezionare la scheda "Markers" e modificare i marcatori nome con un doppio click sui marcatori disponibili. Renderli visibili nella Marker Bar. Fare clic su OK.
    8. Attivare il direttore di sezione.
      1. Fare clic sul menu "Strumenti / Serial Sezione Manager". Aggiungere una nuova sezione con il pulsante "nuova sezione". Questo pulsante apre la finestra di dialogo "Setup Sezione Seriale".
      2. Impostare il "Block Advance", come 30 micron. Impostare il"Spessore di taglio montato" con il valore stimato nella fase 3.2.5.
      3. Impostare la "Valutazione Intervallo" come 20. Usare una frazione di campionamento 1/20 fetta.
      4. Impostare "il numero di sezione di partenza", come 1. Impostate il "valore dell'asse Z per la parte superiore della prima sezione" come 0. Fare clic su OK.
    9. Disegnare un contorno per delineare l'emisfero controlaterale.
      1. Selezionate lo strumento emisfero controlesionale (precedentemente creata nel passaggio 3.2.6) dal profilo menù verso il basso.
      2. Disegnare un contorno per delineare l'emisfero controlaterale.
      3. Per finire tracciare l'emisfero controlesionale, fare clic destro del mouse e selezionare "Chiudere profilo".
    10. Stimare il contorno emisfero controlesionale da Cavalieri.
      1. Fare clic sul menu "Probes" e selezionare Cavalieri Estimator. Impostare "Grid Spacing" come 100 micron. Impostare "Grid Rotation" come 0. Impostare il "Bserratura Advance ", come 30 micron. Fare clic su OK.
      2. Selezionare "La controlesionale emisfero" pulsante dalla Marcatori Bar. Fare clic destro all'interno del contorno dell'emisfero controlesionale.
      3. Selezionare "Paint Cavalieri Modalità Markers". Fare clic destro all'interno del contorno emisfero controlesionale nuovo e selezionare "Markers vernice nella Contour".
      4. Disattivare Cavalieri Estimator cliccando su sonde e Cavalieri Estimator e disattivare il tasto marcatore controlesionale dal bar marcatore.
    11. Ripetere la stessa procedura per l'emisfero ipsilesionale e la zona infartuata (passi 3.2.7 e 3.2.8). Salvare i dati dopo la stima della superficie di ciascuna sezione.
    12. Calcolare le aree controlaterale, ipsilesionale e infartuati nel resto della sezione Nissl macchiato.
      1. Creare una nuova sezione come al punto 3.2.6. Non modificare i valori inseriti nella sezione "Setup seriale" finestra di dialogo. Fare clic su Ok.
      2. Ripetere passaggi 3.2.7-3.2.8 nella nuova sezione.
    13. Esportare i risultati della quantificazione di un foglio elettronico.
      1. Fare clic su "Sonde" nel menu Investigator Stereo. Selezionare "Display Probe List Run". Si apre il "precedente stereologica Esegue Dialog".
      2. Selezionare tutte le sezioni cliccando su di loro. Premere il tasto "Visualizza risultati" Button. Si apre "il Cavalieri Estimator Risultati" dove sono esposti l'area e il volume stimato per ogni regione.
      3. Per esportare i risultati in un foglio di calcolo, fare clic su "Copia tutti i risultati per Appunti" e incollare un file excel con i principali risultati ottenuti da ciascuna regione (tabella 2).
    14. Volume dell'infarto Express 3 mm o come% dell'emisfero che è infartuato (% IH) mediante la formula 15% IH = InfVol / ContrVol * 100, dove
ove_content "> InfVol (Volume tessuto infartuato) = ΣInfArea i,
ContrVol (controlesionale Emisfero Volume) = ΣContrArea i

4. stereologica Quantificazione delle infiltrata neutrofili Dopo cerebrale ischemia dal Frazionatore Optical

  1. La colorazione di sezioni di cervello:
    1. Per stimare il numero totale di neutrofili infiltrati dopo MCAO dal frazionatore ottica 16, utilizzare una frazione di campionamento 1/10 slice. Neutrofili Immunostain utilizzando tecniche di immunofluorescenza convenzionali con il topo anti-Ly6G anticorpi (1A8) e il diritto anticorpo secondario su sezioni free-floating. Inoltre, un controcolorazione con macchinetta nucleare come DAPI o TOPRO, anche se non è necessario per l'identificazione dei neutrofili, può rendere più facile rilevare la zona infartuata.
    2. Mount sezioni di cervello in un vetrino da microscopio SuperFrost con l'area infartuata posto nella parte destra.
  2. Quantificzione dei leucociti infiltrati nel cervello ischemico dal frazionatore ottica
    1. Utilizzare parametri mostrati nella Tabella 3 per quantificare leucociti infiltrati nel cervello ischemico dall'approccio frazionatore ottica con un sistema stereology. Ripetere i passaggi 3.2.1-3.2.5 dalla sezione 3.
    2. Creare un utensile del profilo per la zona infartuata come è stato descritto nel passaggio 3.2.6 della sezione 3.
    3. Creare un attrezzo marker per neutrofili come è stato descritto nel passaggio 3.2.7 della sezione 3.
    4. Attivare il manager sezione e creare una nuova sezione come nella fase 3.2.8. In questo caso, impostare la "Valutazione Intervallo" come il 10 (una frazione di campionamento 1/10 fetta è utilizzato per stimare il numero dei neutrofili).
    5. Selezionare "infartuato Area" utensile del profilo (precedentemente creata nel passaggio 4.2.1) dal profilo menù verso il basso. Disegnare un contorno per delineare l'area infartuata a 10X obiettivo. Modificare l'obiettivo di 100X per eseguire neutrophil quantificazione (non dimenticate di selezionare il 100X dal menu a scopo menu a discesa).
    6. Fai clic sul menu "Sonde" e selezionare "Frazionatore ottica". Impostare il "XY Collocamento di contare Frames" come 230 sia per X e Y dimensione della griglia. Impostare "Grid Rotation" come 0. Impostare il "Block Advance", come 30 micron. Fare clic su OK.
    7. Selezionare il pulsante "neutrofili" dalla barra Marker. Mark macchiato neutrofili nella zona infartuata. Una volta finitura, disattivare la sonda Frazionatore Optical cliccando su "Sonde" e "Frazionatore ottica". Disattivare il pulsante di neutrofili dal bar marcatore.
    8. Ripetete la stessa procedura per ogni sezione (4.2.4-4.2.9).
    9. Esportare i risultati della quantificazione di un foglio elettronico.
      1. Fare clic su "Sonde" nel menu Investigator Stereo. Selezionare "Visualizza Probe List Run" per aprire la "Runs stereologica precedenti"finestra.
      2. Selezionare tutte le sezioni cliccando su di loro. Premere il tasto "Visualizza risultati" per aprire "le ottiche di frazionamento di risultati" in cui viene visualizzato il numero stimato di neutrofili.
      3. Esportare i risultati in un foglio di calcolo, fare clic sul "Copia tutti i risultati per Appunti" e incollare in un foglio di calcolo.

Analisi 5. Cervello Dissociazione e Citometria a Flusso

NOTA: Caratterizzazione sottopopolazione mieloide mediante citometria a flusso su tessuto cerebrale fresca può essere utilizzata come alternativa alla caratterizzazione dei neutrofili precedente eseguita su sezioni cerebrali fissi e immunostained.

  1. Cervello e dissociazione singola preparazione sospensione cellulare
    1. Fare 10 ml / animali di un (mezzo Roswell Park Memorial Institute) RPMI soluzione -Percoll contenente 8 ml di RPMI, 1 ml del 30% Percoll e 1 ml di una (soluzione salina tamponata fosfato) 10x PBS.
    2. Rimuovi cervello di topo dopo MCAO come descritto nel passaggio 2.3.
    3. Al microscopio, sezionare le aree centrali e peri-infartuale della corteccia ipsilaterale dal cervello di topo ischemica (o di una regione simile per sham e animali naïve) dal cervello. Peso tessuto cerebrale e metterlo in 5 ml di ghiacciata RPMI-Percoll (il livello di peso può essere eseguita per la normalizzazione tra i gruppi sperimentali).
    4. Dissociare il tessuto in una sospensione singola cella utilizzando una smerigliatrice tessuto Potter-Elvehjem-tipo con pestelli in teflon.
    5. Trasferimento sospensioni cellulari in una provetta ultracentrifuga 50 ml e aggiungere altri 5 ml di soluzione RPMI-Percoll ai campioni.
    6. Centrifugare le sospensioni cellulari a 7.800 xg per 30 minuti a 25 ° C. Dopo centrifugazione, assicurano uno strato di colore bianco corrispondente alla mielina appare nella parte superiore della soluzione.
    7. Rimuovere lo strato di mielina attenzione e filtrare tutto sospensioni cellulari, comprese le cellule pellet, con 40 micron rete di nylon strainer.
    8. Aggiungere 10 ml di RPMI sul filtro per garantire che tutte le cellule sono filtrati e posizionare la soluzione in un tubo da 50 ml. Aggiungere 30 ml di RPMI e centrifugare i 50 ml di sospensione cellulare a 600 xg per 10 min a RT.
    9. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet di leucociti con 1 ml di PBS. Aggiungere 4 ml di tampone di lisi (150 mM NH 4 Cl, 10 mM NaHCO 3 e 0,1 mM EDTA) e incubare le cellule per 2-3 minuti a temperatura ambiente per lisare gli eritrociti dalla sospensione cellulare. Centrifugare la soluzione a 600 xg per 10 minuti a 4 ° C.
  2. Colorazione cellulare e citometria a flusso
    1. Preparare un cocktail di etichettatura per citometria a flusso, contenente 200 ml di PBS-BSA (1%) 1: 100 Fc-Block, 01:40 anti-CD45-PerCP ratto, 01:40 anti-Ly6G-APC ratto, 01:40 contro CD11b-FITC ratto e 01:40 anti-Ly-6C-PE ratto per campione.
    2. Risospendere le cellule del cocktail etichettatura e incubare i campioni per 45 min in ghiaccio.
    3. Lavare il cocktail di etichettaturacon 1 ml di PBS freddo e centrifugare le cellule a 600 xg per 10 min a 4 ° C. Risospendere il pellet con 100 ml di FACS Flow e acquisire l'intera sospensione cellulare mediante citometria a flusso.
    4. Utilizzare un software di analisi di citometria a flusso per caratterizzare e quantificare popolazioni cellulari.
      1. Principali sottoinsiemi leucociti corrispondenti al cocktail etichettatura preparati in questo protocollo può essere caratterizzato come segue: + CD45 lo CD11b: cellule microgliali residenti; CD45 hi CD11b + Ly-6G +: neutrofili; CD45 hi CD11b + Ly-6G - Ly-6C hi: monociti pro-infiammatori.

Representative Results

Il modello di ischemia cerebrale qui illustrato genera infarti visto esclusivamente nella corteccia senza influenzare il tessuto striatale poiché i rami lenticulostriatal del MCA che irrorano striato non sono occluse (Figura 1). Con Nissl colorazione, la zona danneggiata può essere identificato come zona corticale ipocromica (Figura 2). Questo modello è caratterizzato da volumi infarto altamente riproducibili a 24 ore dopo MCAO (% IH 15.89 ± 0.28) stimato dal metodo di Cavalieri in sezioni Nissl-colorate (Figura 2). Stima del volume infartuata dal metodo Cavalieri è un approccio accurata con un errore basso che si riflette nel coefficiente di errore (CE) di Gundersen negli emisferi controlesionale e ipsilesionale nonché nella zona infartuata (Tabella 2). Volume del tessuto danneggiato può essere espressa in mm 3, ma anche come% IH utilizzando la formula nella sezione 3.2.13. Inoltre, la stimadel volume totale delle regioni ipsilesionale e controlesionale consente il calcolo dell'indice di edema per correggere il volume infartuata ed evitare una sovrastima del tessuto danneggiato (Tabella 2).

Data la trasformazione seriale sezionamento del tessuto cerebrale, questo può essere sfruttato per eseguire una stima accurata del numero totale delle sottopopolazioni di cellule, come neutrofili infiltrate, nella zona ischemica, utilizzando l'approccio Frazionatore ottico (Figura 3 e nella tabella 4) con i parametri indicati nella tabella 3. Questo protocollo stima un totale di neutrofili (cellule Ly6G-positivi) nella zona infartuata di 23.328 ± 3.623 in 24 ore e 82.856 ± 8.143 in 48 ore nei topi dopo pMCAO (Figura 3D). In accordo con gli studi precedenti, infiltrazione di neutrofili è direttamente correlata con la dimensione infartuale (Figura 3E). Stima di tegli numero di neutrofili dal metodo Frazionatore ottico è un approccio preciso con un basso errore che viene riflessa dalla CE di Gundersen (Tabella 4).

L'isolamento dei leucociti e citometria a flusso protocollo caratterizzazione permette l'isolamento di 47.922 ± 23.174 cellule mieloidi dalla corteccia dell'emisfero ipsilesionale di topi ischemici. Questo comprende 10-30% degli eventi totali presenti nella sospensione cellulare. La stragrande maggioranza degli eventi catturati utilizzando questo protocollo presente un parametro basso FSC, associati a detriti cellulari (Figura 4). CD11b colorazione dimostra che le cellule CD11b + hanno un valore elevato FSC (figura 4), ​​suggerendo che detriti cellulari non è etichettato con questo marcatore e, come precedentemente indicato, che può essere escluso da ulteriori analisi impostando la soglia a 200 FSC 9. L'importo variabile di detriti cellulari ottenute con questo metodo suggerisce che le differenze sul processo campioneING (sincronizzazione, la conservazione dei tessuti, la temperatura del campione, la rimozione mielina efficiente, etc.) può rappresentare per esso. Inoltre, è necessario anche l'uso di filtri cellulari per evitare la presenza di morsetti cellulari nei campioni; questo passo deve essere fatto prima della colorazione delle cellule. Utilizzando la strategia gating mostrato nella Figura 5, che si basa su CD11b ed espressione CD45, possiamo discriminare tra residenti e cellule mieloidi infiltrate nel tessuto ischemico. Questo CD11b + popolazione aumenta nell'emisfero ischemica quando confrontati con il naif e con il gruppo sham, in cui queste cellule sono per lo più associate ad una bassa espressione di CD45 che indica che la microglia sta proliferando dopo ischemia (Figura 4, Figura 5 e la Tabella 5) . Questa differenza è probabilmente dovuta alla infiltrazione di cellule dalla periferia, come evidenziato dalla comparsa di una sottopopolazione di cellule CD45 + hi CD11b nel cervello ischemico (Figura 4Figura 5 e la Tabella 5), che è il numero basso di ingenuo e nel cervello sham. Il contributo di infiltrati alla popolazione di cellule CD11b + in ischemia cerebrale è un processo molto dinamico 4. Nel modello MCAO legatura, può variare dal 30% al 60% del totale + cellule CD11b seconda delle dimensioni della lesione e del tempo in cui la caratterizzazione è stato fatto. I neutrofili, caratterizzati come cellule Ly-6G +, sono la popolazione più numerose cellule infiltrate trovato a 24 ore dopo MCAO nel cervello ischemico mouse utilizzando questo modello di ischemia cerebrale, in quanto costituiscono il 70-80% del CD11b + CD45 hi. Il resto delle celle sono per lo più una sottopopolazione di CD11b + CD45 hi Ly-6G - hi monociti pro-infiammatori Ly-6C. In questo modello, questa popolazione aumenterà in numero in aree ischemiche cerebrali 24-48 ore dopo MCAO.


Figura 1:. Procedura chirurgica per la legatura MCA (A) Dopo retrazione del muscolo temporale, una piccola craniotomia viene eseguita nel cranio mouse. MCA è legatura da un nodo o un nodo scorsoio con un 9/0 sutura. (B) Immagini rappresentative della lesione corticale generata dal modello MCAO. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2: Quantificazione del volume dell'infarto da Cavalieri. (A) Immagini rappresentative della sezioni di cervello Nissl-macchiati 24 ore dopo permanente MCA legatura. L'alto ingrandimento mostra l'area hipocromatic dopo Nissl colorazione cheidentifica l'area danneggiata (core) dopo MCAO. Viene anche mostrato il (PI) regione peri-infartuale. (B) Quantificazione del volume dell'infarto rappresentato come% infartuato Emisfero (% IH) utilizzando il metodo di Cavalieri in sezioni Nissl-colorate seriali, 24 ore dopo MCAO (n = 50 topi ).

Figura 3
Figura 3: quantificazione stereologica di neutrofili nella zona infartuata 24 e 48 ore dopo la legatura, con il metodo Frazionatore ottico. (A) immagine Rappresentante di neutrofili infiltrati (cellule Ly6G-positivi) della zona ischemica in 24 ore dopo MCAO. Mostra delimitazione dell'area infartuata. (B, C) ​​Esempi di un dissettore ottico per neutrofili quantificazione dal frazionatore ottica. (D) Quantificazione di neutrofili totale della regione infartuato a 24 e 48 ore (n = 4 topi). (E)Correlazione del numero di neutrofili con la dimensione dell'infarto a 24 e 48 ore dopo MCA legatura. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4:. Rappresentante analisi dot-plot dispersione dei leucociti cerebrali ottenute da emisferi ingenuo, sham e ischemico (24 ore dopo MCAO) sulla base di parametri fisici (SSC e FSC) è stata identificata una popolazione di eventi che esprimono CD11b (red) in tutti i gruppi. Questa popolazione è stato recintato e caratterizzato secondo l'espressione di CD45. Le cellule che esprimono livelli bassi di CD45 (verde) erano presenti nella corteccia ischemica e non ischemica cerebrale e corrispondevano alle cellule microgliali. In contrasto, cellule che esprimono alti livelli di CD45 (giallo) sono stati solotrova nell'emisfero ischemica e in misura minore in gruppo sham. Ulteriori analisi della popolazione hi CD11b + CD45 indica che neutrofili (Ly-6G + cellule, blu) e pro-infiammatori monociti (cellule Ly-6C hi, arancione) sono i principali sottopopolazioni di cellule presenti nel cervello si infiltra 24 ore dopo l'ictus. Si prega clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5:. Soppressione strategie per differenziare residente da cellule mieloidi infiltrate nel tessuto ischemico CD11b + cellule sono state in primo luogo recintato in base all'intensità isotipo di fluorescenza (A). Un punto plot rappresentante di sospensioni di cellule del cervello ischemico viene mostrata nell'angolo in alto a destra del pannello. InInoltre, i valori tipici per il numero totale di eventi e per il numero di CD11b + eventi acquisiti utilizzando questa tecnica è mostrato (numero di cellule / ischemico emisfero;. (A) CD45 fluorescenza analisi intensità delle cellule CD11b + è mostrato in pannello B. Un'analisi rappresentante dot plot di CD45 e CD11b espressione della gated CD11b + sottopopolazione è mostrata nell'angolo in alto a destra del pannello. Inoltre, il numero tipico di cellule CD45 hi lo CD45 acquisiti per ischemico emisfero cerebrale con questa tecnica è mostrato (B).

Parametri utilizzati per il metodo di Cavalieri
Sezione spessore (t) 30 micron
Obiettivo 10X
Frazione di campionamento Slice (SSF) 1/ 20
Distanza tra le sezioni 600 micron
Griglia spaziatura 100 micron

Tabella 1: Parametri utilizzati per la quantificazione stereologica del tessuto infartuato.

Risultati Controlesionale Ipsilesionale Infarto
Area (μm²) 151.460.000 155.060.000 22.600.000
Volume (μm³) 90876000000 93036000000 13560000000
Volume corretto per
Nel corso di proiezione (μm³)
89957100000 92046300000 <strong> 13416600000
Coefficiente di errore (Gundersen),
m = 0
0,068 0,077 0,067
Coefficiente di errore (Gundersen),
m = 1
0,015 0.017 0,015
Coefficiente di errore (Gundersen),
alpha (q)
0,068 0,077 0,067
% Infartuato Hemisphere 14.90
Cervello Edema (Ips Vol / Cont Vol) 1.02

Tabella 2: esempi rappresentativi di volumi controlesionale, ipsilesionale e infarto con il metodo Cavalieri utilizzando il Software Investigator Stereo.

parametri utilizzati per la colonna di frazionamento di Optical
Sezione spessore (TSF) 30 micron
Obiettivo 100X
Frazione di campionamento Slice (SSF) 1/10
Conteggio Altezza fotogramma 40 micron
Conteggio Larghezza cornice 40 micron
Dimensione della griglia X 230 micron
Dimensione della griglia X 230 micron
Guardia di sicurezza 2 micron
Optical disector Altezza 14 micron

Tabella 3: Parametri utilizzati per la quantificazione stereologica di neutrofili infiltrati dopo ischemia cerebrale con la sonda frazionatore ottica utilizzando il Software Investigator Stereo.

Stima di neutrofili dal Frazionatore Optical
Numero di siti di campionamento 430
Forma Factor 6.24
Totale marcatori contato 166
I neutrofili stimati di Frazionatore Optical 117,608.03
Coefficiente di errore (Gundersen), m = 0 0.22
Coefficiente di errore (Gundersen), m = 1 0.09

Tabella 4: esempio Rappresentante dei neutrofili infiltrati stimati dopo ischemia cerebrale con la sonda Frazionatore ottico utilizzando il Software Investigator Stereo.

CD11b + I neutrofili I monociti Microglia
Ingenuo 25.863 ± 4,575.8 473 ± 75.8 525 ± 191,4 19.012 ± 1.523
Sham 24 ore 24.563 ± 5.263 873 ± 192.5 1.124 ± 391,5 23.734 ± 2.910
pMCAO 24 ore 47.922 ± 23.174 4.874 ± 748,7 4.826 ± 1.345 35.395 ± 10.833

Tabella 5: Risultati rappresentativi delle cellule mieloidi stimati dopo ischemia cerebrale con la citometria a flusso approccio.

Discussion

Il modello di ischemia cerebrale introdotto qui dà volumi infarto altamente riproducibili determinati 24-48 ore e 7 giorni dopo MCA legatura da approcci diversi 8,15,17. Questo modello MCAO ha un basso tasso di mortalità (meno dell'1%) rispetto agli altri, riducendo al minimo il numero di animali usati in studi. Un passo fondamentale per ottenere questo basso tasso di mortalità è di mantenere condizioni asettiche adeguate per evitare le infezioni che potrebbero compromettere la sopravvivenza dopo l'induzione ictus. Questo modello MCAO non può essere utilizzato solo come modello MCAO permanente, che è considerato un modello clinico rilevante per la ricerca traslazionale 18, ma anche come un modello transitorio mediante legatura transitoria del CCA e MCA con un cappio e posteriore riperfusione al momento desiderato 19. Questo metodo è stato utilizzato con successo in topi e ratti 17,20. Tutte queste prove indicano che MCAO mediante legatura è un'alta versatile modello di ischemia cerebrale con più applicazioni. A Critical passo di questa tecnica è che richiede un intervento chirurgico invasivo allo stereomicroscopio; craniotomia deve essere eseguita con molta attenzione per non danneggiare la zigomo nonché la MCA. Tuttavia, l'uso di animali sham (che sono sottoposte alla procedura chirurgica ma CCA e MCA legatura non viene eseguita) fornisce uno strumento utile per discriminare effetti dipendenti dalla procedura chirurgica. L'entità del danno cerebrale dopo questa tecnica può essere quantificata mediante diversi metodi. Il nostro protocollo di sezionamento cerebrale, Nissl e successiva stima del volume Cavalieri permette una quantificazione accurata della regione danneggiata e minimizza il numero di topi utilizzati in questo tipo di studi dal sezioni di cervello seriale possono essere utilizzati anche per l'analisi immunoistochimica differente. Per una migliore prestazione di questa metodologia, è fondamentale scegliere i parametri appropriati utilizzati nel software stereologia (Tabella 1), che saranno necessari per la stima the volume delle diverse regioni dalla formula: V = 1 / * SSF un f * t * ΣP i (SSF è la frazione di campionamento fetta, t è lo spessore medio delle sezioni, una f è l'area della spaziatura della griglia e ΣP il numero di punti di colpire la struttura).

Il distale MCAO da legatura può essere utile per caratterizzare la leucociti infiltrati e sottopopolazioni di cellule immunitarie 8,13 che partecipano al processo infiammatorio dopo un trauma cerebrale 1-4. Qui, proponiamo due diverse metodologie per la caratterizzazione delle cellule immunitarie del cervello, un approccio stereologica precisa e una citometria a flusso per una migliore caratterizzazione più leucociti sottopopolazioni.

Sfruttando sezionamento cerebrale seriale, la quantificazione del numero totale di neutrofili può essere ottenuto mediante il metodo frazionatore ottica 16, che stima il numero totale di cellule dal numero di celle di spirito campionataha sistematica Casualmente campionati (SRS) insieme di spazi imparziali conteggio virtuali che coprono l'intera regione di interesse, nel nostro caso la regione infartuale, con distanza uniforme tra imparziali spazi conteggio virtuali in direzioni X, Y e Z. Questo metodo fornisce uno strumento preciso per stimare il numero totale dei neutrofili nel cervello ischemico in tempi diversi dopo la legatura. Anche se non è stato dimostrato in questo studio, questo protocollo può essere utilizzato anche per la stima delle differenti sottopopolazioni neutrofili dopo ischemia 21 e per una quantificazione accurata di qualsiasi altra popolazione cellulare trovato nel cervello ischemico come altri leucociti infiltrati (monociti / macrofagi) ed anche per la stima neuroni sopravvissuti o anche per neurogenesi quantificazione dopo l'ictus. Il passo più importante per una stima accurata nella zona desiderata è la selezione dei parametri appropriati, come quelli indicati nella Tabella 3 per neutrofili quantificazione nella zona ischemica.Questi parametri saranno utilizzati per il software stereology per calcolare il numero totale di cellule positive (N) utilizzando l'equazione N = ΣQ- x 1 / ssf x 1 / ASF x 1 / TSF (ΣQ- è il numero totale di cellule contate con frazionatore, SSF è la frazione di campionamento sezione ASF è l'area frazione di campionamento, e TSF è lo spessore frazione di campionamento) 5. Anche se questo metodo è più lento rispetto ad altre tecniche di quantificazione (per esempio, l'analisi di marcatori neutrofili per mg di tessuto, densitometria di immagini rappresentative o numero di neutrofili per campo), ha il vantaggio di essere un imparziale ed una tecnica solida che fornisce una precisa quantificazione del numero di cellule.

L'approccio di isolamento leucociti cervello permette una contemporanea identificazione e la quantificazione dei diversi sottotipi di cellule immunitarie senza la necessità di polarizzare il sistema di colorazione in vivo o manipolazioni genetiche. Cell successivo smistamento della p mieloide caratterizzatoopulations o la loro separazione immunomagnetica possono essere utilizzati per molteplici applicazioni a valle, quali ulteriori studi sul gene o espressione della proteina. La caratterizzazione accurata dei neutrofili, monociti e microglia ottenute con questo metodo offre elevata specificità rispetto a metodi esistenti, come gli studi di immunoistochimica, un vantaggio che permette di assegnare funzioni specifiche per le diverse cellule mieloidi che mediano cervello risposta immunitaria innata. Inoltre, può essere ulteriormente esteso per caratterizzare altre popolazioni del cervello con l'etichetta, come via sanguigna macrofagi (CD11b + CD45 + CD68 hi), e può essere applicata per lo studio di altre patologie del sistema nervoso centrale o lesioni. Pertanto questa tecnica fornisce uno strumento essenziale per esplorare l'eterogeneità della risposta infiammatoria nel cervello. Un limite principale di questa tecnica risiede sulla preparazione delle sospensioni leucociti da tessuto cerebrale fresco, che possono alterare lastato di attivazione delle cellule o loro alterazione antigene. Sebbene questa tecnica consente una caratterizzazione qualitativa più dettagliata rispetto agli studi immunoistochimici, fornisce una quantificazione meno accurato basato su isolamento delle cellule. Nonostante ciò, l'efficienza del nostro protocollo di isolamento cellulare è simile ad altre metodologie pubblicato 9 e può essere utilizzato in modo efficiente per rilevare differenze nel numero di cellule immunitarie cerebrali tra controllo e gruppi MCAO o anche tra gruppi MCAO sottoposti a diversi trattamenti 8.

Passaggi critici di questo protocollo sono la dissezione dei tessuti, la procedura di interruzione dei tessuti, e la rimozione mielina. Per quanto riguarda la raccolta dei tessuti, un passo normalizzazione può essere incluso (pesando il tessuto raccolto) per evitare la variabilità a causa di diversi spettacoli di dissezione. Inoltre, la normalizzazione tra diversi gruppi MCAO può anche avvenire attraverso volume dell'infarto (precedentemente determinato Magnetic Resonance). Un altro modo per risolvere questo problema è quello di utilizzare tutto l'emisfero ipsilaterale di entrambi i gruppi ischemici e di controllo, o anche utilizzare l'emisfero controlaterale del mouse ischemico come controllo per minimizzare il numero di animali utilizzati. Mentre questo approccio evita differenze tra ogni dissezione, ha uno svantaggio principale; un fattore di diluizione viene aggiunto aumentando il numero totale di cellule, ma non il numero di cellule mieloidi che si trovano esclusivamente nelle aree centrali e peri-infarto della corteccia ipsilaterale. Per quanto riguarda la rottura del tessuto, questo protocollo illustra i passi per la distruzione meccanica delle cellule cerebrali, evitando trattamenti enzimatici e prevenire la superficie antigene di alterazione 9,22, una questione fondamentale per l'ulteriore analisi qualitativa e quantitativa delle sottopopolazioni di cellule infiammatorie. Oltre alla preparazione della sospensione cellulare di interesse, la rimozione mielina da campioni cerebrali è un passo altamente raccomandato per evitare interferenze con oa valleapplicazioni risma, come ad esempio la separazione immunomagnetica o citometria a flusso 23,24. Questo può essere realizzato con metodi diversi, come saccarosio o gradienti di Percoll, o perline anti-mielina. Qui, e in base a precedenti studi che mettono a confronto diversi metodi per l'isolamento delle cellule cerebrali sospensione, interruzione meccanica in combinazione con l'utilizzo Percoll per rimuovere mielina viene utilizzato per migliorare le rese e la vitalità cellulare 25.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Photonic Led F1 WPI 571329-8 Equipment
Temp Controller  Panlab  HB 101/2 Equipment
Volvere GX NSK Ne22L Equipment
Microscope WPI PZMIII-BS Equipment
Stainless Steel Burrs FST 19007-14 Surgical material
Forceps Dumont #5/45  FST 11251-35 Surgical material
Forceps Dumont #5SF FST 11252-30 Surgical material
Suture 6/0 LorcaMarin 55108 Surgical material
Suture 9/0 LorcaMarin 61966 Surgical material
Nikon Eclipse  Nikon TE300 Equipment
Isoflurane Esteve 571329-8 Chemical
Sodium Pentobarbital Vetoquinol 570681 Chemical
Freezing microtome Leica Microsystems GmbH SM2000R Equipment
Superfrost slides Thermo Scientific  2014-07 Lab material
Cresyl violet acetate Sigma C5042 Chemical
Microscope  Nikon Nikon Eclipse TE300 Equipment
XYZ motorized computer stage and controller Ludl electronics Products Equipment
Stereo Investigator System Microbrightfield Version 7.003 software Software
5 ml Tissue Grinder, Potter-Elv with teflon pestle Thomas Scientific 0913X70 Lab Material
Polypropylene 50 ml Oak Ridge Centrifuge Tube Nalgene 3119-0050  Lab material
Percoll Sigma p1644-100 Chemical
RPMI 1640 Lonza BE12-702F Chemical
Beckman Ultracentrifugue Beckman Coulter Equipment
Beckman Coulter ultracentrifuge rotor 45 Ti Beckman Coulter Equipment
BD Sterile Cell Strainer, 40 Micron BD BD 352340 Lab Material
Bovine Serum Albumin Sigma A3733-500G Reagment
FcR Blocking Reagent, mouse Miltenyi 130-092-575 Antibody
CD11b-FITC, human and mouse Miltenyi 130-098-085 Antibody
CD45-PE, mouse Miltenyi 130-102-596 Antibody
Anti-Ly-6G-APC, mouse Miltenyi 130-102-936 Antibody
PerCP/Cy5.5 anti-mouse Ly-6C Biolegend 128012 Antibody
BD FACS Flow BD 342003 Reagment
BD FACSCalibur; 4-color BD 342975 Equipment
BD Cell Quest Pro Software BD Software
FlowJo software Treestar inc. Software

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References

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