Stereological والتدفق الخلوي توصيف خلايا الدم البيضاء القطعان في نماذج من عابر أو الشلل الدائم نقص التروية

* These authors contributed equally
Medicine
 

Summary

الدماغ خلايا الدم النخاعي توصيف التالية السكتة الدماغية يمكن أن يؤديها التجسيم باستخدام طريقة المجزئ البصرية، أو عن طريق تحليل تدفق cytometric من الدماغ الكريات البيض تعليق. كلاهما تقنيات مفيدة لإجراء تمييز phenotypical دقيق لأهم مجموعات فرعية خلية الدم النخاعي وجدت في الدماغ الدماغية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ballesteros, I., Cuartero, M. I., Moraga, A., de la Parra, J., Lizasoain, I., Moro, M. Á. Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia. J. Vis. Exp. (94), e52031, doi:10.3791/52031 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة، فضلا عن تسرب الضامة haematogenous والعدلات، ويعتقد أن تلعب دورا محوريا في إصابات الدماغ بعد السكتة الدماغية. ويمكن لهذه القطعان خلية الدم النخاعي عرض الظواهر وظائف مختلفة وتحتاج إلى أن تكون متميزة وتتميز لدراسة تنظيم ومساهمتها في تلف الأنسجة. يوفر هذا البروتوكول اثنين منهجيات مختلفة للدماغ توصيف الخلايا المناعية: نهج stereological دقيقة وتحليل تدفق cytometric. ويستند هذا النهج stereological على طريقة المجزئ البصري، الذي يحسب العدد الكلي للخلايا في منطقة من الفائدة (الدماغ محتشية) حسب تقديرات عينة عشوائية منتظمة. يوفر نهج توصيف الثاني طريقة بسيطة لعزل تعليق الكريات البيض الدماغ وتميز لهم من قبل التدفق الخلوي، مما يسمح لتوصيف الخلايا الدبقية الصغيرة، تسللت وحيدات والعدلات من الأنسجة الدماغية. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه أيضا دetails على نموذج نقص التروية الدماغية لدى الفئران التي تؤثر بشكل حصري قشرة الدماغ، وتوليد عوائق استنساخه للغاية مع انخفاض معدل الوفيات، وإجراءات لمعالجة الدماغ النسيجي لتوصيف حجم احتشاء بواسطة طريقة كافاليري.

Introduction

ويعتقد المورفولوجية والمظهرية والتعبير الجيني التعديلات من الخلايا الدبقية الصغيرة، فضلا عن تسرب وتفعيل الضامة haematogenous والعدلات أن تلعب دورا محوريا في سلسلة الفيزيولوجية المرضية التالية إصابات الدماغ 1-4. يوفر هذا البروتوكول نهجين لتقدير عدد من مجموعات فرعية مختلفة خلية الدم النخاعي من الدماغ الدماغية وأداء توصيف لها phenotypical. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يوفر أيضا وصفا للنموذج تجريبي من نقص التروية الدماغية لدى الفئران، والذي يتألف من ربط عابرة أو دائمة من كلا البعيدة الدماغي الأوسط الشريان (MCA) والشريان السباتي المشترك (CCA)، بما في ذلك كيفية تقييم احتشاء من خلال طريقة كافاليري دقيقة باستخدام البرمجيات stereological.

النهج الأول للتميز مجموعات فرعية خلية الدم النخاعي من الدماغ الدماغية هي طريقة stereological تستند إلى نهج المجزئ بصري 5. وهذا هو الأكثريشيع استخدامها التحقيق stereological في علوم الحياة ويوفر درجة عالية من الدقة مع معاملات منخفضة من الخطأ 5-7. هذا هو أفضل خيار لالكمي الخلية عندما يتم قطع الأنسجة إلى أقسام، كما أنه يتجنب التحيز على تقدير خلية بسبب تفتت الأنسجة إلى أقسام. هذا الأسلوب هو وسيلة قوية جدا لوصف الأرقام، وديناميات والتغيرات المظهرية المجموعات السكانية الفرعية العدلات تسلل من الأنسجة الدماغية 8.

ويستند هذا النهج توصيف الثاني على بروتوكول تعديل من كامبانيلا والمتعاونين 9 التي توفر طريقة بسيطة لعزل الدماغ تعليق الكريات البيض وتميز لهم من قبل التدفق الخلوي. وعلى النقيض من تقنيات المناعى التقليدية، التدفق الخلوي توصيف يسمح التفريق بين الخلايا الدبقية الصغيرة (CD45 لو CD11b +) وتسلل خلايا الدم النخاعي (CD45 مرحبا CD11b +) على أساس فرق بهممستويات erent التعبير عن CD45 9-13. وبالإضافة إلى ذلك، وحيدات الموالية للالتهابات (CD45 مرحبا CD11b + لي-6G - لي-6C مرحبا)، العدلات (CD45 مرحبا CD11b + لي-6G +) والكريات البيض الأخرى مجموعات فرعية من الأنسجة الدماغية يمكن تمييزها. ويوفر هذا النهج مقايسة موثوق وسريع لتقييم neuroinflammation في نماذج تجريبية من نقص تروية الدماغ. ومع ذلك، يمكن معالجة الأنسجة تؤثر على الدولة تفعيل وأعداد السكان خلية مختلفة وجدت في الأنسجة الدماغية توفير توصيف شبه الكمي.

Protocol

ملاحظة: جميع البروتوكولات التجريبية انضمت إلى المبادئ التوجيهية للجنة رعاية الحيوان من جامعة كومبلوتنسي (يتبع توجيهات الاتحاد الأوروبي 86/609 / CEE و 2003/65 / CE).

1. الشلل نقص التروية نموذج

ملاحظة: نموذج نقص التروية الدماغية في هذه الورقة ينطوي انسداد دائم أو مؤقت من كلا CCA (الشريان السباتي المشترك) وMCA (الشريان الدماغي الأوسط) من خلال ربط مع خياطة النايلون.

  1. استعدادات ما قبل الجراحة
    1. تعقيم جميع الأدوات الجراحية من قبل التعقيم أو للتعقيم الزجاج حبة. تطهير المنطقة الجراحية مع الايثانول 70٪ أيضا.
    2. تخدير الفأر مع التخدير المناسبة. تحقيق تحريض من قبل الأيزوفلورين 2.5٪ والحفاظ معها من قبل الأيزوفلورين 1.5٪ في خليط من 80٪ الهواء / 20٪ أكسجين باستخدام المرذاذ. تطبيق الدموع الاصطناعية للعيون الفئران لمنع جفاف بينما تحت التخدير.
    3. ضع الماوس على وسادة التدفئة مرتبط لرسومجهاز dback مع التحقيق في درجة الحرارة وضعها في المستقيم وضبط درجة الحرارة عند مستويات الفسيولوجية (36.5 ± 0.5 درجة مئوية) أثناء إجراء العمليات الجراحية.
  2. المشترك انسداد الشريان السباتي عن طريق ربط
    1. ضع الماوس في ظهري الاستلقاء وشل مع الشريط. تطهير الجلد مع الايثانول 70٪ أو بوفيدون يوديد وقص الشعر من الجزء البطني العلوي.
    2. تحت المجهر الجراحي، وجعل 1 سم خط الوسط شق حول السطح البطني من الرقبة.
    3. سحب الأنسجة بصرف النظر عن لينة (الأنسجة الغدية بما في ذلك الفرعي الفك العلوي، تحت اللسان والغدد النكفية) والتعرف على ترك السباتي المشترك الشريان (CCA)، والتي يتم ترجمتها إلى جانبي القصبة الهوائية. التراجع العضلات وفضح CCA الأيسر. تشريح بعناية من العصب المبهم.
    4. مرة واحدة تشريح، تسد CCA غادر من قبل ضمد باستخدام خياطة 6/0 النايلون. Ligate مع عقدة دائمة أو العقدة (للسماح ضخه إذا هو المطلوب عابرة نموذج نقص التروية الدماغية).
    5. وضع الأنسجة الغدية إلى موقعها الأصلي وإغلاق شق على جلد الرقبة مع خياطة 6/0 النايلون.
      وتتعرض الحيوانات الشام لنفس الإجراء الجراحي كحيوانات MCAO ولكن لم يتم المغطي التقييم القطري المشترك: ملاحظة.
  3. القاصي المتوسطة انسداد الشريان الدماغي عن طريق ربط
    1. ضع الماوس على الجانب الأيمن وشل مع الشريط. تطهير الجلد الرأس مع 70٪ من الإيثانول أو بوفيدون يوديد وقص الشعر من الرأس الماوس (إزالة الشعر بعد قطع).
    2. تحت المجهر الجراحي، وجعل شق الجلد بين العين والأذن. نقل الجلد بعيدا والاحتفاظ بها مع الشريط.
    3. إجراء شق أفقي على العضلات الزمنية من اليمين إلى اليسار. ثم، وجعل شق عمودي الثاني على الجانب الأيمن من عضلة الزمنية (كن حذرا لتجنب الوريد الصدغي قص). مزق في عضلة الزمنية من الجمجمة والاحتفاظ بها مع خياطة للحفاظ على سطح الجمجمة نظيفة.
    4. تنظيف سطح الجمجمةبمحلول ملحي معقم الباردة للكشف عن الموضع الدقيق لليسار الشريان الدماغي الأوسط (MCA) عن طريق الشفافية الجمجمة. إجراء حج القحف الجولة (1 ملم في القطر) مع لدغ الفولاذ المقاوم للصدأ في الفص الجبهي بين القوس الوجني وعظم صدفي. إزالة بعناية الجمجمة وفضح MCA.
    5. ضع كمية صغيرة من البرد محلول ملحي معقم على سطح الدماغ وإزالة السحايا (الجافية وأم عنكبوتية) باستخدام ملقط.
    6. أداء ربط من MCA اليسار في الجذع القاصي قبل التشعب بين الأمامية والخلفية فروع MCA. تسد MCA غادر من قبل ضمد باستخدام خياطة 9/0 النايلون. Ligate مع عقدة دائمة أو العقدة (للسماح ضخه إذا هو المطلوب عابرة نموذج نقص التروية الدماغية). الفترة الزمنية بين التقييم القطري المشترك وMCA انسداد حوالي 10-20 دقيقة اعتمادا على خبرة المشغل.
    7. وضع العضلات الزمنية في موقعها الأصلي وإغلاق incisioن على جلد الرقبة مع خياطة 6/0 النايلون.
    8. عودة الماوس إلى القفص للتعافي من التخدير (عموما 5-10 دقيقة) وحقن الفأر مع البوبرينورفين داخل الصفاق (IP) (0.3 ملغ / كلغ).
      1. مراقبة الماوس لعدة ساعة للكشف عن أي إزعاج (لا تترك الماوس غير المراقب حتى استعاد وعيه أنه كاف للحفاظ على الاستلقاء القصية). منذ الوزن بعد الجراحة فقد لوحظ بشكل عام، ضع الطعام المهروسة في طبق بيتري لتسهيل تناول الطعام.
    9. عندما يتم استرداد الحيوان بالكامل، والعودة إلى الشركة من الحيوانات الأخرى.
    10. إذا كان المطلوب نموذج MCAO عابرة، تخدير الماوس مرة أخرى وإزالة العقدة من CCA وMCA للسماح ضخه (عادة ما بين 0.5-2 ساعة (الشكل 1)).
      وتتعرض الحيوانات الشام لنفس الإجراء الجراحي كحيوانات MCAO ولكن لم يتم المغطي للMCA: ملاحظة.

2. الإرواء وSectioning من أنسجة المخ

  1. 24 أو 48 ساعة بعد MCAO، تضحية الماوس مع جرعة قاتلة من مخدر (على سبيل المثال، بنتوباربيتال الصوديوم، IP 86 ملغ / كغ أو جرعة زائدة مع isoflurane).
  2. يروي الماوس مع العازلة الفوسفات 0.1 M تليها بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) في المخزن الفوسفات (7.4 درجة الحموضة).
  3. إزالة الدماغ على النحو التالي:
    1. قطع رأس الحيوان فقط فوق الحبل الشوكي.
    2. وجعل شق الخلفي الأمامي على جلد الرأس لفضح الجمجمة. جعل اثنين من التخفيضات الجانبية عند تقاطع الجدران الجانبية وقاعدة الجمجمة وإزالة قطعة صغيرة من العظام.
    3. اجراء خفض خلال الجمجمة على طول الدرز السهمي.
    4. إزالة الجمجمة التي تغمر كل نصف الكرة الأرضية باستخدام ملقط لفضح الدماغ. استخدام ملعقة لفصل المخ من الجمجمة وتحويلها الى 4٪ PFA حل.
  4. ما بعد الإصلاح لمدة 3 ساعة في 4٪ PFA الحل عند 4 درجة مئوية.
  5. إزالة PFA حل وincubatالبريد الدماغ لمدة 48 ساعة في 30٪ من محلول السكروز إلى cryoprotect الدماغ.
  6. إزالة حل السكروز وتجميد الدماغ بسرعة في isopentane البارد (-40 درجة مئوية). متجر الدماغ تجميد في -80 درجة مئوية.
  7. الحصول على أقسام الدماغ الاكليلية (30 ميكرون) مع مشراح التجمد. جمع عشرة مجموعات متسلسلة في حل cryopreservative. وتتكون كل مجموعة من المسلسل حول 14-16 شرائح الاكليلية مع المسافة interslice من 300 ميكرون والتي عينة كاف مخ الفأر بين 1.94 و -2.46 الخلفي إلى bregma.

3. نيسل تلطيخ وعائق حجم تقدير

  1. تلطيخ نيسل التي كتبها بنفسجية الكريزيل
    1. أقسام الدماغ جبل في شريحة المجهر superfrost. لتحديد حجم احتشاء بواسطة طريقة كافاليري في الفروع نيسل الملطخة، واستخدام جزء 1/20 شريحة أخذ العينات (1/2 أقسام احدة من عشر مجموعات التسلسلية التي تم جمعها في الخطوة 2.7، تقريبا، وهو العدد الكلي للأقسام 7-8 مع المسافة interslice من 600 μ، وتستخدم م). كن حذرا للحفاظ على التوجه الأمامي الخلفي السليم (يتم وضع منطقة محتشية في الجانب الأيمن).
    2. أداء التقليدي نيسل تلطيخ على النحو التالي:
      1. السماح أقسام محمولة على الشريحة لتجف لمدة عدة ساعة.
      2. ترطيب أقسام محمولة على الشريحة وصمة عار مع 0.1٪ محلول بنفسجية الكريزيل لمدة 5 دقائق.
      3. يذوى مع سلسلة متدرجة من ETOH (70٪، 90٪، و 100٪، 5 دقائق في التغيير). تنظيف أقسام محمولة على الشرائح مع زيلين، إضافة distrene-80 الملدنات زيلين (DPX) وسائل الاعلام المتزايدة، وتغطي مع ساترة الزجاج.
  2. باستخدام برنامج stereological لتقدير حجم احتشاء بواسطة طريقة كافاليري في نيسل الملطخة أقسام التسلسلية
    1. استخدام المعلمات هو مبين في الجدول رقم 1 لقياس حجم احتشاء بواسطة طريقة كافاليري 14 ونظام التجسيم، والذي يتألف من المجهر مزودة بكاميرا، مرحلة الكمبيوتر XYZ الآلية، والبرمجيات stereological (إن الرئيسيةترتبط الإرشادات الواردة أدناه لأجهزة الكمبيوتر ولكن الاتجاهات قد تختلف عن أنظمة التشغيل الأخرى).
    2. بدوره على جهاز الكمبيوتر، المجهر، تحكم المسرح والكاميرا في الترتيب المناسب. بدء تشغيل البرنامج stereological.
    3. تحريك الهدف 10X في مكان وحدد 10X من انخفاض موضوعي القائمة أسفل.
    4. التحرك في جميع أنحاء الأول قسم الملطخة نيسل وإيجاد نقطة مرجعية مناسبة. انقر بزر الفأرة الأيمن لإنشاء نقطة مرجعية (على التحرك من الضروري نشط على زر الفرح مجاني).
    5. تقدير "سمك الباب شنت" (القسم سمك الفعلي مع الأخذ بعين الاعتبار انكماش). اضغط على زر "التركيز الوظيفة متر" وحساب سمك من أسفل إلى أعلى القسم.
    6. إنشاء أداة كفاف لcontralesional والمناطق ipsilesional ومنطقة محتشية.
      1. انقر على قائمة "العرض" وحدد "إعدادات العرض". وهذا يفتح رانه عرض إعدادات الحوار.
      2. حدد "ملامح" علامة التبويب وانقر على زر "إضافة نوع كونتور".
      3. إنشاء كفاف لكل منطقة لتحديد وجعلها مرئية في كفاف القائمة أسفل. انقر فوق موافق.
    7. إنشاء أداة ماركر لcontralesional ونصفي الكرة الأرضية ipsilesional ومنطقة محتشية.
      1. انقر على قائمة "العرض" وحدد "إعدادات العرض" لفتح الحوار إعدادات العرض.
      2. حدد "علامات" التبويب وتغيير علامات الاسم عن طريق النقر المزدوج على علامات المتاحة. جعلها مرئية في شريط ماركر. انقر فوق موافق.
    8. تفعيل مدير القسم.
      1. انقر على قائمة "أدوات / المسلسل إدارة القسم". إضافة قسم جديد مع زر "قسم جديد". هذا الزر يفتح "الحوار إعداد القسم المسلسل".
      2. تعيين "كتلة المسبق" إلى 30 ميكرون. تعيين"سمك الباب شنت" مع القيمة المقدرة في الخطوة 3.2.5.
      3. تعيين "تقييم الفاصل الزمني" كما 20. استخدام عينة جزء 1/20 شريحة.
      4. مجموعة "لبدء عدد قسم" ك 1. تعيين "Z قيمة محور لأعلى القسم الأول"، كما 0. انقر فوق موافق.
    9. رسم كفاف تحديد الخطوط العريضة لنصف الكرة الأرضية المقابل.
      1. حدد أداة نصف الكرة Contralesional (تم إنشاؤها مسبقا في الخطوة 3.2.6) من كفاف القائمة أسفل.
      2. رسم كفاف تحديد الخطوط العريضة لنصف الكرة الأرضية المقابل.
      3. لإنهاء تتبع نصف الكرة contralesional، انقر على الحق في الماوس واختر "كفاف وثيق".
    10. تقدير كفاف نصف الكرة contralesional من قبل كافاليري.
      1. انقر على قائمة "تحقيقات" وحدد كافاليري مقدر. ضبط "الشبكة تباعد" إلى 100 ميكرون. ضبط "الشبكة دوران" كما 0. تعيين "Bقفل المسبق "إلى 30 ميكرون. انقر فوق موافق.
      2. حدد "إن نصف الكرة contralesional" زر من علامات بار. انقر بزر الماوس الأيمن داخل نصف الكرة كفاف Contralesional.
      3. حدد "الطلاء كافاليري علامات الوضع". انقر بزر الماوس الأيمن داخل نصف الكرة كفاف contralesional مرة أخرى وحدد "الطلاء علامات في كونتور".
      4. تعطيل كافاليري مقدر من خلال النقر على تحقيقات وكافاليري مقدر وتنشيط زر علامة contralesional من شريط علامة.
    11. كرر نفس الإجراء لنصف الكرة ipsilesional ومنطقة محتشية (خطوات 3.2.7 و 3.2.8). حفظ البيانات بعد تقدير من مساحة كل قسم.
    12. حساب المناطق المقابل، ipsilesional ومحتشية في بقية القسم نيسل الملطخة.
      1. إنشاء قسم جديد كما في الخطوة 3.2.6. لا تقم بتعديل القيم المدخلة في "مسلسل باب الإعداد" الحوار. انقر فوق موافق.
      2. كرر الخطوات من 3.2.7-3.2.8 في الجزء الجديد.
    13. تصدير نتائج القياس الكمي لملف جدول بيانات.
      1. انقر على "تحقيقات" في قائمة باحث ستيريو. حدد "العرض التحقيق تشغيل قائمة". هذا يفتح "السابق Stereological يدير الحوار".
      2. حدد كافة الأقسام من خلال النقر عليها. اضغط على "عرض نتائج" زر. وهذا يفتح "لكافاليري مقدر النتائج" حيث يتم عرض مساحة تقدر حجم ولكل منطقة.
      3. لتصدير النتائج إلى ملف جدول، انقر فوق "نسخ كافة نتائج لالحافظة" ولصق إلى ملف Excel مع النتائج الرئيسية التي تم الحصول عليها من كل منطقة (الجدول 2).
    14. حجم احتشاء السريع ومم 3 أو كنسبة مئوية من نصف الكرة الأرضية الذي هو محتشى؛ مصاب بالاحتشاء (٪ IH) باستخدام الصيغة 15٪ IH = InfVol / ContrVol * 100، حيث
ove_content "> InfVol (محتشية حجم الأنسجة) = ΣInfArea ط،
ContrVol (Contralesional نصف الكرة الحجم) = ط ΣContrArea

4. Stereological الكمي للتسلل العدلات بعد الشلل نقص التروية قبل المجزئ البصري

  1. تلطيخ من أقسام الدماغ:
    1. لتقدير العدد الإجمالي للالعدلات تسللت بعد MCAO من قبل المجزئ بصري 16، استخدم عينة جزء 1/10 شريحة. العدلات Immunostain باستخدام تقنيات المناعي التقليدية مع الفئران لمكافحة Ly6G الأجسام المضادة (1A8) والضد الثانوية على الحق في أقسام التعويم الحر. بالإضافة إلى ذلك، counterstaining مع صانع النووي مثل دابي أو TOPRO، على الرغم من أنه ليس من الضروري لتحديد العدلات، يمكن أن تجعل من الأسهل للكشف عن منطقة محتشية.
    2. أقسام الدماغ جبل في شريحة المجهر superfrost مع المنطقة محتشية وضعها في الجانب الأيمن.
  2. Quantificأوجه من الكريات البيض تسلل في الدماغ الدماغية التي المجزئ البصري
    1. استخدام المعلمات هو مبين في الجدول رقم 3 لقياس الكريات البيض تسلل في الدماغ الدماغية التي كتبها النهج المجزئ البصرية مع نظام التجسيم. كرر الخطوات 3.2.1-3.2.5 من القسم 3.
    2. إنشاء أداة كفاف لمنطقة محتشية كما وصفت ذلك في خطوة 3.2.6 من القسم 3.
    3. إنشاء أداة علامة للحصول على العدلات كما وصفت ذلك في خطوة 3.2.7 من القسم 3.
    4. تفعيل مدير القسم وإنشاء قسم جديد كما في الخطوة 3.2.8. في هذه الحالة، تعيين "تقييم الفاصل الزمني" إلى 10 (يتم استخدام جزء المعاينة 1/10 شريحة لتقدير عدد العدلات).
    5. حدد "محتشية المنطقة" أداة كفاف (تم إنشاؤها مسبقا في الخطوة 4.2.1) من كفاف القائمة أسفل. رسم كفاف لمخطط منطقة محتشية في 10X الهدف. تغيير الهدف إلى 100X لأداء neutrophايل الكمي (لا تنسى لتحديد 100X من انخفاض موضوعي القائمة أسفل).
    6. انقر على "تحقيقات" القائمة وحدد "المجزئ البصري". تعيين "XY الموضع عد إطارات" 230 لكل من X و Y حجم الشبكة. ضبط "الشبكة دوران" كما 0. تعيين "كتلة المسبق" إلى 30 ميكرون. انقر فوق موافق.
    7. حدد زر "العدلة" من علامة بار. ملطخة علامة العدلات في المنطقة محتشية. مرة واحدة النهاية، وتعطيل التحقيق المجزئ البصري من خلال النقر على "تحقيقات" و "المجزئ البصري". تعطيل الزر العدلات من شريط علامة.
    8. كرر نفس الإجراء لكل قسم (4.2.4-4.2.9).
    9. تصدير نتائج القياس الكمي لملف جدول بيانات.
      1. انقر على "تحقيقات" في قائمة باحث ستيريو. حدد "عرض مسبار قائمة تشغيل" لفتح "يعمل Stereological السابقة"الحوار.
      2. حدد كافة الأقسام من خلال النقر عليها. اضغط على "عرض نتائج" زر لفتح "نتائج المجزئ البصرية" حيث يتم عرض يقدر عدد العدلات.
      3. تصدير النتائج إلى ملف جدول بيانات عن طريق النقر على "نسخ كافة نتائج لالحافظة" ولصق لملف جدول بيانات.

5. تحليل الدماغ التفكك والتدفق الخلوي

ملاحظة: توصيف حيوانية النخاعي عن طريق التدفق الخلوي على أنسجة المخ جديدة يمكن أن تستخدم كبديل للتوصيف العدلات السابق أجريت على أقسام الدماغ الثابتة وimmunostained.

  1. التفكك الدماغ واحد إعداد تعليق خلية
    1. جعل 10 مل / حيوان من (متوسطة معهد روزويل بارك التذكاري) RPMI حل -Percoll تحتوي على 8 مل من RPMI، 1 مل من 30٪ Percoll و 1 مل من 10X PBS (الفوسفات مخزنة المالحة).
    2. Remove مخ الفأر بعد MCAO كما هو موضح في الخطوة 2.3.
    3. تحت المجهر، تشريح خارج المناطق الأساسية وشبه احتشاء من القشرة المماثل من مخ الفأر الدماغية (أو منطقة مشابهة لخدعة والحيوانات ساذجة) من الدماغ. الوزن أنسجة المخ ووضعه في 5 مل من الجليد الباردة RPMI-Percoll (الخطوة الوزن لا يمكن أن يؤديها لتطبيع العلاقات بين المجموعات التجريبية).
    4. فصل الأنسجة في تعليق خلية واحدة باستخدام بوتر-Elvehjem من نوع طاحونة الأنسجة مع المدقات تفلون.
    5. نقل تعليق خلية إلى 50 مل أنبوب نابذة فائقة السرعة وإضافة 5 مل أكثر من حل RPMI-Percoll للعينات.
    6. الطرد المركزي تعليق خلية في 7،800 x ج لمدة 30 دقيقة في 25 درجة مئوية. بعد الطرد المركزي، وضمان ظهور طبقة بيضاء بلون الموافق المايلين في الجزء العلوي من الحل.
    7. إزالة طبقة المايلين بعناية وتصفية تعليق خلية كاملة، بما في ذلك الخلايا مكعبات، من خلال 40 ميكرون شبكة من النايلون straineص.
    8. إضافة 10 مل من RPMI على مصفاة للتأكد من أن كل الخلايا التي تمت تصفيتها ووضع الحل في أنبوب 50 مل. إضافة 30 مل من RPMI وأجهزة الطرد المركزي في 50 مل من تعليق خلية في 600 x ج لمدة 10 دقيقة في RT.
    9. تجاهل طاف و resuspend بيليه الكريات البيض مع 1 مل من برنامج تلفزيوني. إضافة 4 مل من تحلل العازلة (150 ملي NH 4 CL، 10 ملي NaHCO 3 و 0.1 ملي EDTA) واحتضان الخلايا لمدة 2-3 دقيقة في RT لليز كريات الدم الحمراء من تعليق الخلية. أجهزة الطرد المركزي الحل في 600 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  2. تلطيخ الخلايا والتدفق الخلوي
    1. إعداد كوكتيل وضع العلامات للالتدفق الخلوي، تحتوي على 200 ميكرولتر من PBS-BSA (1٪) 1: 100 FC-بلوك، 01:40 مكافحة CD45-PercP الفئران، 01:40 مكافحة Ly6G-APC الفئران، 01:40 المضادة CD11b-FITC الفئران و01:40 مكافحة لي-6C-PE الفئران لكل عينة.
    2. resuspend الخلايا في كوكتيل وضع العلامات واحتضان العينات لمدة 45 دقيقة في الجليد.
    3. غسل كوكتيل وضع العلاماتمع 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة وأجهزة الطرد المركزي الخلايا في 600 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. resuspend الكرية مع 100 ميكرولتر من FACS تدفق والحصول على تعليق الخلية بالكامل عن طريق التدفق الخلوي.
    4. استخدام التدفق الخلوي برامج التحليل لتوصيف وتحديد السكان الخلية.
      1. يمكن وصف مجموعات فرعية الكريات البيض الرئيسية المقابلة لكوكتيل وضع العلامات أعدت في هذا البروتوكول على النحو التالي: CD45 لو CD11b +: خلايا دبيقي المقيمين. CD45 مرحبا CD11b + لي-6G +: العدلات. CD45 مرحبا CD11b + لي-6G - لي-6C مرحبا: حيدات الموالية للالتهابات.

Representative Results

نموذج نقص التروية الدماغية هو موضح هنا يولد عوائق ينظر حصرا في القشرة دون التأثير على الأنسجة الجسم المخطط منذ فروع lenticulostriatal من MCA التي تروي المخطط لا المغطي (الشكل 1). بواسطة نيسل تلطيخ، والمنطقة المتضررة يمكن حصرها في منطقة القشرية الناقص الصباغ (الشكل 2). ويتميز هذا النموذج من قبل حجم احتشاء استنساخه للغاية في 24 ساعة بعد MCAO (٪ 15.89 ± 0.28 IH) التي يقدرها طريقة كافاليري في الفروع نيسل الملطخة (الشكل 2). تقدير حجم محتشية بواسطة طريقة كافاليري هو نهج دقيق مع خطأ المنخفض الذي ينعكس في معامل الخطأ (CE) من جاندرسن في نصفي الكرة الأرضية contralesional وipsilesional وكذلك في منطقة محتشية (الجدول 2). ويمكن التعبير عن حجم الأنسجة التالفة في ملم 3 ولكن أيضا بوصفها٪ IH باستخدام الصيغة في القسم 3.2.13. وبالإضافة إلى ذلك، فإن تقديرمن إجمالي حجم المناطق ipsilesional وcontralesional يسمح لحساب مؤشر ذمة لتصحيح حجم محتشية وتجنب المبالغة في تقدير الأنسجة التالفة (الجدول 2).

ونظرا لمعالجة باجتزاء التسلسلي للأنسجة المخ، وهذا يمكن أن يستفاد منها لإجراء تقدير دقيق لعدد القطعان الخلايا، مثل العدلات تسللوا عبر الحدود في المنطقة الدماغية، وذلك باستخدام نهج المجزئ البصري (الشكل 3 والجدول 4) مع المعلمات هو مبين في الجدول 3. ويقدر هذا البروتوكول إجمالي عدد العدلات (خلايا Ly6G إيجابية) في منطقة محتشية من 23328 ± 3،623 في 24 ساعة و82856 ± 8143 في 48 ساعة في الفئران بعد pMCAO (الشكل 3D). في اتفاق مع الدراسات السابقة، ويرتبط العدلات تسلل مباشرة مع حجم احتشاء (الشكل 3E). تقدير ركان عدد العدلات من خلال طريقة المجزئ البصري هو نهج دقيق مع خطأ منخفض الذي ينعكس من قبل CE من جاندرسن (الجدول 4).

عزل الكريات البيض والتدفق الخلوي بروتوكول توصيف تسمح للعزلة 47922 ± 23،174 خلايا الدم النخاعي من القشرة من نصف الكرة ipsilesional من الفئران الدماغية. ويشمل هذا 10-30٪ من مجموع الأحداث وجدت في تعليق خلية. الغالبية العظمى من الأحداث القبض على استخدام هذا البروتوكول معلمة FSC منخفضة، ويرتبط إلى الحطام الخلوي (الشكل 4). CD11b تلطيخ يظهر أن الخلايا CD11b + لها قيمة FSC أعلى (الشكل 4)، مما يوحي بأن الحطام الخلية لا يتم المسمى مع هذه العلامة، وكما ذكر سابقا، وأنه يمكن استبعادها من مزيد من التحليل عن طريق تحديد عتبة FSC في 200 9. مقدار متغير من الحطام الخلية التي تم الحصول عليها مع هذا الأسلوب يشير إلى أن الخلافات حول عملية عينةجي (توقيت، والحفاظ على الأنسجة، ودرجة حرارة العينة، وإزالة المايلين كفاءة، وغيرها) يمكن حساب لذلك. وبالإضافة إلى ذلك، هناك حاجة إلى استخدام مصافى الخلية أيضا لتجنب وجود المشابك الخلوية في العينات. تحتاج هذه الخطوة إلى أن يتم ذلك قبل تلطيخ الخلية. باستخدام استراتيجية النابضة هو مبين في الشكل (5) الذي يقوم على أساس CD11b والتعبير CD45، يمكننا التمييز بين المقيمين وخلايا الدم النخاعي تسلل في الأنسجة الدماغية. هذه الزيادات السكانية CD11b + في نصف الكرة الدماغية بالمقارنة مع ساذجة ومع مجموعة صورية، في هذه الخلايا التي ترتبط في معظمها إلى تعبير انخفاض CD45 مشيرا إلى أن الخلايا الدبقية الصغيرة في تكاثر بعد نقص التروية (الشكل 4، 5 الشكل والجدول 5) . هذا الفرق هو الأرجح بسبب تسلل خلية من المحيط، كما يتضح من ظهور جزء من السكان خلية مرحبا CD11b + CD45 في الدماغ الدماغية (الشكل 4 ، الشكل 5 والجدول 5) وهو رقم منخفض في السذاجة والعقول صورية. مساهمة تتسرب إلى السكان خلية + CD11b في نقص تروية الدماغ هي عملية ديناميكية للغاية 4. في النموذج MCAO بواسطة رباط، يمكن أن تختلف من 30٪ إلى 60٪ من مجموع خلايا + CD11b اعتمادا على حجم الآفة والوقت الذي تم القيام به في التوصيف. العدلات، وصفها بأنها خلايا لي-6G هي الأكثر عددا في السكان الخلية تسللت التي عثر عليها في 24 ساعة بعد MCAO في مخ الفأر الدماغية باستخدام هذا النموذج من نقص التروية الدماغية، لأنها تتكون من 70-80٪ من CD11b + CD45 مرحبا. بقية الخلايا هي في معظمها جزء من السكان من CD11b + CD45 مرحبا لي-6G - لي-6C حيدات الموالية للالتهابات مرحبا. في هذا النموذج، وهذا عدد السكان زيادة في العدد في مناطق الدماغ الدماغية 24-48 ساعة بعد MCAO.

ithin صفحة = "دائما"> الشكل (1)
الشكل 1: إجراء العمليات الجراحية لربط MCA (A) بعد تراجع عضلة الزمنية، يتم إجراء حج القحف صغيرة في الجمجمة الماوس. هو ligated MCA من قبل عقدة أو العقدة باستخدام 9/0 خياطة. (B) صور الممثل الآفة القشرية الناتجة عن نموذج MCAO. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: الكمي لحجم احتشاء التي كتبها كافاليري. (A) صور الممثل من أقسام الدماغ نيسل الملطخة 24 ساعة بعد ربط دائم MCA. التكبير عالية يبين منطقة hipocromatic بعد نيسل تلطيخ التييحدد المنطقة المتضررة (الأساسية) بعد MCAO. ويظهر أيضا (PI) منطقة شبه عائق. (B) الكمي لحجم احتشاء ممثلة على النحو٪ محتشية نصف الكرة الأرضية (٪ IH) باستخدام طريقة كافاليري في مسلسل أقسام نيسل الملطخة، 24 ساعة بعد MCAO (ن = 50 الفئران ).

الشكل (3)
الشكل 3: القياس الكمي Stereological العدلات في المنطقة محتشية 24 و 48 ساعة بعد ربط، وذلك باستخدام طريقة المجزئ البصري. (A) صورة الممثل من العدلات تسللت (خلايا Ly6G الإيجابية) في المنطقة الدماغية في 24 ساعة بعد MCAO. معارض ترسيم المنطقة محتشية. (B، C) أمثلة لمشرح البصرية لالعدلات الكمي من قبل المجزئ البصري. (D) الكمي من إجمالي العدلات في المنطقة محتشية في 24 و 48 ساعة (ن = 4 الفئران). (E)ارتباط عدد العدلات مع حجم احتشاء في 24 و 48 ساعة بعد MCA ربط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الرقم 4: الممثل تحليل الدوت مؤامرة مبعثر من الكريات البيض في الدماغ تم الحصول عليها من السذاجة، صورية والدماغية (24 ساعة بعد MCAO) نصفي الكرة الأرضية على أساس المعلمات المادية (SSC وFSC) تم تحديد عدد سكانها الأحداث التي تعبر عن CD11b (الحمراء) في جميع الفئات. تم بوابات هذه الفئة من السكان وتتميز وفقا لتعبير عن CD45. كانت الخلايا معربا عن مستويات منخفضة من CD45 (الخضراء) الموجودة في قشرة الدماغ الدماغية وغير الدماغية ويتفق مع خلايا دبقية صغيرة. في المقابل، الخلايا معربا عن مستويات عالية من CD45 (الصفراء) كانت فقطوجدت في نصف الكرة الدماغية وبدرجة أقل في مجموعة صورية. ويشير إلى مزيد من التحليل للسكان مرحبا CD11b + CD45 أن العدلات (لي-6G + الخلايا، الزرقاء) والموالية للالتهابات حيدات (خلايا لي-6C مرحبا والبرتقالي) هي مجموعات سكانية فرعية الخلية الرئيسية الموجودة في الدماغ تتسرب 24 ساعة بعد السكتة الدماغية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الشكل 5:. المحاصرة استراتيجيات للتمييز المقيمين من خلايا الدم النخاعي تسلل في الأنسجة الدماغية وبوابات CD11b + الخلية الأولى وفقا لكثافة نمط إسوي مضان (A). ويرد مؤامرة نقطة تمثيلية من تعليق خلية من الدماغ الدماغية في الزاوية اليمنى من أعلى اللوحة. فيبالإضافة إلى ذلك، يتم عرض القيم النموذجية لعدد من الأحداث وبالنسبة لعدد CD11b + الأحداث المكتسبة باستخدام هذه التقنية (أي الخلايا / الدماغية نصف الكرة المخ؛ (A) هو مبين CD45 الإسفار تحليل كثافة CD11b + الخلايا في لوحة ويظهر B. تحليل تمثيلية مؤامرة نقطة من CD45 و CD11b تعبير عن بوابات CD11b + حيوانية في الزاوية اليمنى من أعلى اللوحة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن عدد نموذجي من CD45 CD45 لو خلايا مرحبا المكتسبة في نصف الكرة الدماغية الدماغ باستخدام هذه التقنية يظهر (B).

المعايير المستخدمة لطريقة كافاليري
القسم سمك (ر) 30 ميكرون
هدف 10X
شريحة جزء أخذ العينات (SSF) 1/ 20
المسافة بين أقسام 600 ميكرون
شبكة تباعد 100 ميكرون

الجدول 1: معلمات المستخدمة لتقدير stereological من النسيج محتشية.

النتائج Contralesional Ipsilesional احتشاء
المنطقة (μm²) 151460000 155060000 22600000
حجم (μm³) 90876000000 93036000000 13560000000
حجم تصحيح ل
أكثر من الإسقاط (μm³)
89957100000 92046300000 <قوية> 13416600000
معامل الخطأ (جاندرسن)،
م = 0
0.068 0.077 0.067
معامل الخطأ (جاندرسن)،
م = 1
0.015 0.017 0.015
معامل الخطأ (جاندرسن)،
ألفا (ف)
0.068 0.077 0.067
٪ محتشية نصف الكرة الأرضية 14.90
الدماغ وذمة (آي بي إس المجلد / كونتي المجلد) 1.02

الجدول 2: أمثلة التمثيلية للكميات contralesional، ipsilesional واحتشاء بواسطة طريقة كافاليري باستخدام الباحث البرامج ستيريو.

فترة = "2"> معلمات المستخدمة في المجزئ البصري
القسم سمك (TSF) 30 ميكرون
هدف 100X
شريحة جزء أخذ العينات (SSF) 1/10
عد الإطار الطول 40 ميكرون
عد عرض الإطار 40 ميكرون
حجم X الشبكة 230 ميكرون
حجم X الشبكة 230 ميكرون
الحرس آمن 2 ميكرون
بصري Disector الطول 14 ميكرون

الجدول 3: معلمات المستخدمة لتقدير stereological العدلات تسللت بعد نقص تروية الدماغ مع التحقيق المجزئ البصرية باستخدام الباحث البرامج ستيريو.

الوراثة = "0">
تقدير العدلات من قبل المجزئ البصري
عدد من مواقع أخذ العينات 430
شكل عامل 6.24
مجموع علامات عد 166
العدلات المقدرة من قبل المجزئ البصري 117،608.03
معامل الخطأ (جاندرسن)، ط = 0 0.22
معامل الخطأ (جاندرسن)، ط = 1 0.09

الجدول 4: مثال ممثل العدلات تسلل يقدر بعد نقص تروية الدماغ مع التحقيق المجزئ البصري باستخدام الباحث البرامج ستيريو.

Cd11b + العدلات وحيدات الخلايا الدبقية الصغيرة
ساذج 25863 ± 4،575.8 473 ± 75.8 525 ± 191.4 19012 ± 1،523
الشام 24 ساعة 24563 ± 5،263 873 ± 192.5 1،124 ± 391.5 23734 ± 2،910
pMCAO 24 ساعة 47922 ± 23،174 4،874 ± 748.7 4،826 ± 1،345 35395 ± 10833

الجدول 5: نتائج التمثيلية للخلايا الدم النخاعي يقدر بعد نقص تروية الدماغ مع التدفق الخلوي النهج.

Discussion

نموذج نقص التروية الدماغية قدم هنا يعطي تحدد حجم احتشاء استنساخه للغاية 24-48 ساعة و 7 أيام بعد MCA ربط بمناهج مختلفة 8،15،17. هذا النموذج MCAO لديه انخفاض معدل وفيات (أقل من 1٪) بالمقارنة مع الآخرين، والتقليل من عدد الحيوانات المستخدمة في الدراسات. خطوة حاسمة للحصول على هذا المعدل المنخفض للوفيات هو الحفاظ على ظروف معقمة المناسبة لتجنب الإصابة بالأمراض التي يمكن أن تؤثر البقاء على قيد الحياة بعد السكتة الدماغية الاستقراء. لا يمكن هذا النموذج MCAO أن تستخدم فقط كنموذج MCAO دائم، والتي تعتبر نموذجا السريرية ذات الصلة للبحوث متعدية 18، ولكن أيضا باعتبارها نموذجا انتقاليا التي كتبها عابرة ربط التقييم القطري المشترك وMCA مع العقدة والخلفي ضخه في الوقت المطلوب 19. تم عرض هذه الطريقة استخدمت بنجاح في الفئران والجرذان 17،20. كل هذه الأدلة تشير إلى أن MCAO بواسطة الربط هو نموذج تنوعا عال من نقص التروية الدماغية مع تطبيقات متعددة. وcritiكال خطوة من هذا الأسلوب هو أنه يتطلب جراحة تحت stereomicroscope. يجب أن يتم تنفيذ حج القحف بعناية فائقة حتى لا تتلف العظم الوجني وكذلك MCA. ومع ذلك، فإن استخدام الحيوانات صورية (التي تخضع لعملية جراحية ولكن التقييم القطري المشترك وربط MCA لم يتم تنفيذ) يوفر أداة مفيدة لتمييز الآثار التي تعتمد على إجراء العمليات الجراحية. مدى إصابات الدماغ التالية هذه التقنية يمكن قياسها كميا بواسطة عدة طرق. لدينا بروتوكول باجتزاء الدماغ، نيسل تلطيخ وتقدير لاحق من مستوى الصوت عن طريق كافاليري يسمح لتقدير دقيق للمنطقة المتضررة ويقلل من عدد من الفئران المستخدمة في هذا النوع من الدراسات منذ أقسام الدماغ المسلسل يمكن أن تستخدم أيضا لمختلف تحليل المناعى. لأداء أفضل لهذه المنهجية، فمن الأهمية بمكان لاختيار المعلمات المناسبة المستخدمة في البرنامج التجسيم (الجدول 1) والتي سوف تكون ضرورية لتقدير عشرحجم (ه) من مختلف المناطق من قبل صيغة: V = 1 / SSF * لو ر * * ΣP ط (SSF هو جزء أخذ العينات شريحة، ر هو سمك متوسط ​​من الأقسام، وو هي المنطقة من التباعد الشبكة و ΣP عدد النقاط ضرب بنية).

وMCAO القاصي قبل ربط يمكن أن تكون مفيدة لتوصيف الكريات البيض وتسلل مجموعات سكانية فرعية الخلايا المناعية 8،13 التي تشارك في العملية الالتهابية التالية إصابات الدماغ 1-4. هنا، نقترح اثنين منهجيات مختلفة لتوصيف الخلايا المناعية في المخ، واتباع نهج stereological دقيقة وتحليل تدفق cytometric لوصف أفضل الكريات البيض متعددة القطعان.

الاستفادة مسلسل باجتزاء الدماغ، الكمي لعدد من العدلات يمكن تحقيقه من خلال طريقة المجزئ بصري 16، الذي يقدر العدد الكلي للخلايا من عدد الخلايا خفة دم عيناتهكتار المنهجي عينة عشوائية (SRS) مجموعة من المساحات منحازة افتراضية العد تغطي المنطقة بأكملها من الفائدة، في حالتنا المنطقة احتشاء، وعلى مسافة موحدة بين المساحات العد افتراضية متحيزة في اتجاهات X، Y وZ. يوفر هذا الأسلوب أداة دقيقة ل تقدير مجموع أرقام العدلات في الدماغ الدماغية في أوقات مختلفة بعد ربط. على الرغم من عدم تبين في هذه الدراسة، وهذا البروتوكول يمكن أن تستخدم أيضا لتقدير القطعان العدلات مختلفة بعد نقص التروية 21 و لالكمي الدقيق لأية مجموعة من السكان خلية أخرى وجدت في الدماغ الدماغية مثل الكريات البيض تسلل الأخرى (وحيدات / الضامة) وأيضا لتقدير الخلايا العصبية على قيد الحياة أو حتى لتكوين الخلايا العصبية الكمي بعد السكتة الدماغية. أهم خطوة لتقدير دقيق في المنطقة المرغوبة هي اختيار المعلمات المناسبة، كما هو مبين في تلك الموجودة في الجدول رقم 3 لتقدير العدلات في المنطقة الدماغية.وسوف تستخدم هذه المعايير لبرنامج التجسيم لحساب إجمالي عدد الخلايا إيجابية (N) باستخدام المعادلة N = ΣQ- × 1 / SSF × 1 / محامون بلا حدود × 1 / TSF (ΣQ- هو العدد الكلي للخلايا عدها مع والمجزئ، SSF هو المقطع أخذ العينات جزء، محامون بلا حدود هي المنطقة جزء أخذ العينات، وTSF هو سمك جزء أخذ العينات) 5. على الرغم من أن هذه المنهجية هي أبطأ من تقنيات القياس الكمي أخرى (على سبيل المثال، وتحليل علامات العدلة من قبل ملغ من الأنسجة، وكثافة الصور التمثيلية أو عدد العدلات في الميدان)، فإنه لديه ميزة أن تكون غير منحازة وتقنية الصلبة التي توفر دقة الكمي لأعداد الخلايا.

نهج العزلة الكريات البيض الدماغ يسمح لتحديد وقت واحد والكمي لعدة أنواع فرعية الخلايا المناعية دون الحاجة للانحياز النظام عن طريق تلطيخ في الجسم الحي أو التلاعب الجيني. خلية اللاحقة الفرز من ص النخاعي تتسمopulations أو انفصالهما immunomagnetic يمكن استخدامها لتطبيقات المصب متعددة، مثل إجراء المزيد من الدراسات على الجين أو البروتين التعبير. توصيف دقيق للالعدلات، وحيدات الخلايا الدبقية الصغيرة والتي تم الحصول عليها مع هذا الأسلوب يوفر خصوصية عالية فيما يتعلق بأساليب القائمة مثل دراسات المناعى، وهي ميزة تسمح للتخصيص وظائف محددة لخلايا الدم النخاعي المختلفة التي تتوسط الدماغ الاستجابة المناعية الفطرية. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يمكن تمديدها لتوصيف السكان الدماغ الأخرى مع التسمية المناسبة، مثل الدم ولدت الضامة (CD11b + CD45 CD68 + مرحبا)، وأنه يمكن تطبيقها لدراسة أمراض الجهاز العصبي المركزي أخرى أو إصابات. وبالتالي توفر هذه التقنية أداة أساسية لاستكشاف تجانس الاستجابة الالتهابية في الدماغ. والقيد الرئيسي لهذا الأسلوب موجود على إعداد تعليق الكريات البيض من أنسجة المخ الطازجة، والتي يمكن أن تغيرالدولة تفعيل الخلايا أو تغيير المستضد بهم. على الرغم من أن هذه التقنية تتيح للتوصيف نوعي أكثر تفصيلا بالمقارنة مع دراسات المناعى، فإنه يوفر الكمي أقل دقة تعتمد على العزلة الخلية. على الرغم من هذا، فإن كفاءة دينا بروتوكول العزلة خلية مشابهة لمنهجيات أخرى نشرت 9 وأنه يمكن استخدامها بكفاءة لكشف الفروق في عدد من الدماغ الخلايا المناعية بين السيطرة والجماعات MCAO أو حتى بين الجماعات MCAO تعرض للعلاجات المختلفة 8.

خطوات حاسمة من هذا البروتوكول هي تشريح الأنسجة، والإجراء تعطيل الأنسجة، وإزالة المايلين. فيما يتعلق بجمع الأنسجة، ويمكن أن تدرج خطوة التطبيع (عن طريق وزن الأنسجة التي تم جمعها) لتجنب التقلبات بسبب العروض تشريح مختلفة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا أن تحدث التطبيع بين الجماعات MCAO مختلفة من خلال حجم احتشاء (التي سبق تحديدها من قبل R المغناطيسيesonance). وهناك طريقة أخرى لحل هذه المشكلة هو استخدام نصف الكرة المماثل كاملة من كلا المجموعتين الدماغية والسيطرة، أو حتى استخدام نصف الكرة الأرضية المقابل من الفأرة الدماغية كعنصر تحكم لتقليل عدد الحيوانات المستخدمة. في حين أن هذا النهج يتجنب الاختلافات بين كل تشريح، أن لديها العيب الرئيسي. يتم إضافة عامل التخفيف عن طريق زيادة العدد الكلي للخلايا ولكن ليس عدد خلايا الدم النخاعي التي تقع حصرا في المجالات الأساسية وشبه احتشاء من القشرة المماثل. وفيما يتعلق تعطيل الأنسجة، ويوضح هذا البروتوكول الخطوات لتعطيل الميكانيكي للخلايا الدماغ، وتجنب العلاجات الأنزيمية ومنع سطح المستضد تغيير 9،22، وهي مسألة أساسية لمزيد من التحليل النوعي والكمي للمجموعات سكانية فرعية الخلايا الالتهابية. بالإضافة إلى إعداد تعليق خلية من الفائدة، وإزالة النخاعين من عينات الدماغ هي خطوة للغاية وأوصت لتجنب التداخل مع downstتطبيقات ماعون من الورق، مثل فصل الخلية immunomagnetic أو التدفق الخلوي 23،24. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام أساليب مختلفة، مثل السكروز أو التدرجات Percoll، أو حبات مكافحة المايلين. هنا، واستنادا إلى الدراسات السابقة التي تقارن بين الطرق المختلفة لخلايا الدماغ تعليق العزلة، واختلال الميكانيكية في تركيبة مع استخدام Percoll لإزالة المايلين يستخدم لتحسين المحاصيل الخلايا وقدرتها على البقاء 25.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Photonic Led F1 WPI 571329-8 Equipment
Temp Controller  Panlab  HB 101/2 Equipment
Volvere GX NSK Ne22L Equipment
Microscope WPI PZMIII-BS Equipment
Stainless Steel Burrs FST 19007-14 Surgical material
Forceps Dumont #5/45  FST 11251-35 Surgical material
Forceps Dumont #5SF FST 11252-30 Surgical material
Suture 6/0 LorcaMarin 55108 Surgical material
Suture 9/0 LorcaMarin 61966 Surgical material
Nikon Eclipse  Nikon TE300 Equipment
Isoflurane Esteve 571329-8 Chemical
Sodium Pentobarbital Vetoquinol 570681 Chemical
Freezing microtome Leica Microsystems GmbH SM2000R Equipment
Superfrost slides Thermo Scientific  2014-07 Lab material
Cresyl violet acetate Sigma C5042 Chemical
Microscope  Nikon Nikon Eclipse TE300 Equipment
XYZ motorized computer stage and controller Ludl electronics Products Equipment
Stereo Investigator System Microbrightfield Version 7.003 software Software
5 ml Tissue Grinder, Potter-Elv with teflon pestle Thomas Scientific 0913X70 Lab Material
Polypropylene 50 ml Oak Ridge Centrifuge Tube Nalgene 3119-0050  Lab material
Percoll Sigma p1644-100 Chemical
RPMI 1640 Lonza BE12-702F Chemical
Beckman Ultracentrifugue Beckman Coulter Equipment
Beckman Coulter ultracentrifuge rotor 45 Ti Beckman Coulter Equipment
BD Sterile Cell Strainer, 40 Micron BD BD 352340 Lab Material
Bovine Serum Albumin Sigma A3733-500G Reagment
FcR Blocking Reagent, mouse Miltenyi 130-092-575 Antibody
CD11b-FITC, human and mouse Miltenyi 130-098-085 Antibody
CD45-PE, mouse Miltenyi 130-102-596 Antibody
Anti-Ly-6G-APC, mouse Miltenyi 130-102-936 Antibody
PerCP/Cy5.5 anti-mouse Ly-6C Biolegend 128012 Antibody
BD FACS Flow BD 342003 Reagment
BD FACSCalibur; 4-color BD 342975 Equipment
BD Cell Quest Pro Software BD Software
FlowJo software Treestar inc. Software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chamorro, A., et al. The immunology of acute stroke. Nature Reviews. Neurology. 8, 401-410 (2012).
  2. Iadecola, C., Anrather, J. The immunology of stroke: from mechanisms to translation. Nat Med. 17, 796-808 (2011).
  3. Ramlackhansingh, A. F., et al. Inflammation after trauma: microglial activation and traumatic brain injury. Annals of Neurology. 70, 374-383 (2011).
  4. Jin, R., Yang, G., Li, G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells. J Leukoc Biol. 87, 779-789 (2010).
  5. West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231, 482-497 (1991).
  6. Charleston, J. S. Estimating cell number in the central nervous system by stereological methods: the optical disector and fractionator. Current Protocols in Toxicology. 12, (Unit 12.6), (2001).
  7. Begega, A., et al. Unbiased estimation of the total number of nervous cells and volume of medial mammillary nucleus in humans. Experimental Gerontology. 34, 771-782 (1999).
  8. Cuartero, M. I., et al. N2 Neutrophils, Novel Players in Brain Inflammation After Stroke: Modulation by the PPARgamma Agonist Rosiglitazone. Stroke; a. Journal of Cerebral Circulation. 44, (12), 3498-3508 (2013).
  9. Campanella, M., Sciorati, C., Tarozzo, G., Beltramo, M. Flow cytometric analysis of inflammatory cells in ischemic rat brain. Stroke. 33, 586-592 (2002).
  10. Carson, M. J., Reilly, C. R., Sutcliffe, J. G., Lo, D. Mature microglia resemble immature antigen-presenting cells. Glia. 22, 72-85 (1998).
  11. Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice. J Neuroinflammation. 8, 174 (2011).
  12. Denker, S. P., et al. Macrophages are comprised of resident brain microglia not infiltrating peripheral monocytes acutely after neonatal stroke. Journal of Neurochemistry. 100, 893-904 (2007).
  13. Ballesteros, I., et al. Rosiglitazone-induced CD36 up-regulation resolves inflammation by PPARgamma and 5-LO-dependent pathways. Journal of Leukocyte Biology. 95, (4), 587-598 (2013).
  14. Michel, R. P., Cruz-Orive, L. M. Application of the Cavalieri principle and vertical sections method to lung: estimation of volume and pleural surface area. J Microsc. 150, 117-136 (1988).
  15. Hernández-Jiménez, M., et al. Silent Information Regulator 1 Protects the Brain Against Cerebral Ischemic Damage. Stroke. 44, (8), 2333-2337 (2013).
  16. Gundersen, H. J., et al. The new stereological tools: disector, fractionator, nucleator and point sampled intercepts and their use in pathological research and diagnosis. APMIS. 96, 857-881 (1988).
  17. Godino, M. E. C., et al. Amelioration of ischemic brain damage by peritoneal dialysis. J Clin Invest. 123, 4359-4363 (2013).
  18. Hossmann, K. A. The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research. J Cereb Blood Flow Metab. 32, 1310-1316 (2012).
  19. García-Yébenes, I., et al. Iron overload, measured as serum ferritin, increases brain damage induced by focal ischemia and early reperfusion. Neurochem Int. 61, 1364-1369 (2012).
  20. Sobrado, M., et al. Synthesis of lipoxin A4 by 5-lipoxygenase mediates PPARgamma-dependent, neuroprotective effects of rosiglitazone in experimental stroke. J Neurosci. 29, 3875-3884 (2009).
  21. Cuartero, M. I., et al. N2 Neutrophils, Novel Players in Brain Inflammation After Stroke: Modulation by the PPARγ Agonist Rosiglitazone. Stroke. 44, 3498-3508 (2013).
  22. Ford, A. L., Foulcher, E., Goodsall, A. L., Sedgwick, J. D. Tissue digestion with dispase substantially reduces lymphocyte and macrophage cell-surface antigen expression. Journal of Immunological Methods. 194, 71-75 (1996).
  23. Pfenninger, C. V., et al. CD133 is not present on neurogenic astrocytes in the adult subventricular zone, but on embryonic neural stem cells, ependymal cells, and glioblastoma cells. Cancer Research. 67, 5727-5736 (2007).
  24. Tham, C. S., Lin, F. F., Rao, T. S., Yu, N., Webb, M. Microglial activation state and lysophospholipid acid receptor expression. International Journal of Developmental Neuroscience : the Official Journal of the International Society for Developmental Neuroscience. 21, 431-443 (2003).
  25. Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics