टोल की तरह रिसेप्टर सिग्नलिंग के इनहिबिटरस के लिए फागोसिटिक इम्यून सेल में बायोएक्टिव नैनोकणों को स्क्रीनिंग करना

Medicine
 

Summary

टोल की तरह रिसेप्टर (टीएलआर) सिग्नलिंग कई मानव भड़काऊ बीमारियों के पैथोफिजियोलॉजी में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और बायोइएक्टिव नैनोकणों द्वारा टीएलआर प्रतिक्रियाओं को विनियमित करने के लिए कई सूजन स्थितियों में फायदेमंद होने का अनुमान है। टीएचआर -1 सेल आधारित रिपोर्टर कोशिकाएं टीएलआर सिग्नलिंग के उपन्यास इनहिबिटर्स की पहचान करने के लिए एक बहुमुखी और मजबूत स्क्रीनिंग प्लेटफॉर्म प्रदान करती हैं।

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Yang, H., Fung, S. Y., Bao, A., Li, Q., Turvey, S. E. Screening Bioactive Nanoparticles in Phagocytic Immune Cells for Inhibitors of Toll-like Receptor Signaling. J. Vis. Exp. (125), e56075, doi:10.3791/56075 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

टोल की तरह रिसेप्टर (टीएलआर) के जवाबों के औषधीय विनियमन कई सूजन रोगों के उपचार में महान वादा करता है। हालांकि, टीएलआर सिग्नल को कम करने के लिए अब तक उपलब्ध सीमित यौगिकों मौजूद हैं और नैदानिक ​​उपयोग में कोई नैदानिक ​​रूप से अनुमोदित टीएलआर अवरोधक (मलेरिया विरोधी दवा हाइड्रोइजिकलक्वाइन को छोड़कर) नहीं किया गया है। नैनो-प्रौद्योगिकी में तेजी से प्रगति की स्थिति में नैनो-उपकरणों का उपयोग करके प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का हेरफेर इन रोगों के इलाज के लिए एक नई रणनीति प्रदान कर सकता है। इसके साथ ही, हम फॉगोसिटिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं में टीएलआर सिग्नल को बाधित करने वाले उपन्यास जैव-सक्रिय नैनोकणों की पहचान करने के लिए एक उच्च थ्रूपूट स्क्रीनिंग विधि पेश करते हैं। यह स्क्रीनिंग प्लेटफार्म टीएचपी -1 सेल आधारित रिपोर्टर कोशिकाओं पर बनाया गया है जिसमें रंगीनमेट्रिक और ल्यूसफेरेज़ एलेस शामिल हैं। रिपोर्टर कोशिकाओं को मानव टीएचपी -1 मोनोसाइटैटिक सेल लाइन से दो inducible रिपोर्टर निर्माणों के स्थिर एकीकरण के द्वारा इंजीनियर किया गया है। एक एक गुप्त भ्रूणीय क्षारीय फॉस्फेट (एसईएपी) जीन को व्यक्त करता हैप्रतिलेखन कारक एनएफ-κबी और एपी -1 द्वारा अनुमोदित प्रमोटर के नियंत्रण के तहत, और दूसरे एक इंटरवारोन विनियामक कारकों (आईआरएफ) द्वारा अनुमोदित प्रमोटरों के नियंत्रण के तहत एक गुप्त लुइसफेर रिपोर्टर जीन को व्यक्त करते हैं। टीएलआर उत्तेजना के बाद, रिपोर्टर कोशिकाओं को सक्रिय प्रतिलेखन कारक और बाद में सीएपी और / या ल्यूइफेरेज़ का उत्पादन करते हैं, जिसे उनके संबंधित सब्सट्रेट अभिकर्मकों का उपयोग करके पता लगाया जा सकता है। उदाहरण के तौर पर हमारे पिछले अध्ययनों में स्थापित पेप्टाइड-गोल्ड नैनोपैर्टिकल (जीएनपी) संकर की लाइब्रेरी का उपयोग करते हुए हमने एक पेप्टाइड-जीएनपी संकर की पहचान की जो कि प्रभावी रूप से अपने प्रोटोटाइपिकल लिगैंड, लिपोपोलिसेकेराइड (एलपीएस) द्वारा शुरू होने वाले टीएलआर 4 सिग्नलिंग कैस्केड को बाधित कर सके। इन निष्कर्षों को इम्यूनोब्लॉटिंग सहित मानक जैव रासायनिक तकनीकों के द्वारा मान्य किया गया था। आगे के विश्लेषण ने स्थापित किया कि इस लीड संकर में एक व्यापक अवरोधक स्पेक्ट्रम था, जिसमें टीएलआर 2, 3, 4, और 5 सहित कई टीएलआर मार्गों पर अभिनय किया गया था। इस प्रयोगात्मक दृष्टिकोण में तेजी से मूल्यांकन किया जा सकता हैआरए नैनोपार्टिकल (या अन्य चिकित्सीय यौगिकों) फ़ैगोसिटिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं में विशिष्ट टीएलआर सिगनल को नियंत्रित कर सकते हैं।

Introduction

संक्रमण के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति में योगदान देने वाले सहज प्रतिरक्षा प्रणाली में टोल-जैसे रिसेप्टर्स (टीएलआर) महत्वपूर्ण तत्व हैं। टीएलआर पाथोजेन-संबंधित आणविक पैटर्न (या पीएएमपी) के एक प्रदर्शनों की सूची को पहचानकर आक्रमणकारी रोगज़नक़ों की पहचान करने और सिग्नल ट्रांसडकेशन 1 , 2 के झरने के माध्यम से रक्षा प्रतिक्रियाओं को बढ़ाना करने के लिए जिम्मेदार हैं। पहचान के 10 मानव टीएलआर हैं; टीएलआर 10 को छोड़कर, जिसके लिए लिगैंड अस्पष्ट रहते हैं, प्रत्येक टीएलआर को पीएएमपी के एक अलग, संरक्षित समूह को मान्यता मिल सकती है। उदाहरण के लिए, टीएलआर 2 और टीएलआर 4, मुख्यतः सेल की सतह पर स्थित है, क्रमशः ग्रामो-पॉजिटिव और ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया से लिपोप्रोटीन और ग्लाइकोलीपिड का पता लगा सकते हैं; जबकि टीएलआर 3, टीएलआर 7/8 और टीएलआर 9 मुख्य रूप से एन्डोसॉमल डिब्बों में मौजूद होते हैं, वे आरएनए और डीएनए उत्पादों को वायरस और बैक्टीरिया से समझ सकते हैं 3 जब पीएएमपी द्वारा प्रेरित किया जाता है, तो टीएलआर प्रो-आईएनएफ जारी करके आवश्यक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को गति प्रदान करता हैथके हुए मध्यस्थों, प्रभावकारी प्रतिरक्षा कोशिकाओं को भर्ती और सक्रिय करना, और बाद में अनुकूली प्रतिरक्षा घटनाओं का समन्वय करना 4

टीएलआर सिग्नलिंग ट्रांसडक्शन को केवल दो मुख्य रास्ते 5 , 6 में वर्गीकृत किया जा सकता है। एक एडेप्टर प्रोटीन मायलोइड भेदभाव कारक 88 (माइद 88) पर निर्भर है - माइद 88-निर्भर मार्ग टीएलआर 3 को छोड़कर सभी टीएलआर, सक्रिय बी कोशिकाओं (एनएफ-κबी) और एमटोजेन-जुड़े प्रोटीन केनसेस (एमएपीके) के परमाणु कारक कप्पा-लाइट-चेन-एनएन्टेनर को सक्रिय करने के लिए इस मार्ग का उपयोग करते हैं, जिससे टीएनएफ-एफएम जैसे प्रो-भड़काऊ मध्यस्थों की अभिव्यक्ति हो सकती है। Α, आईएल -6 और आईएल -8 इंटरफेन (आईएफएन) नियामक कारकों (आईआरएफ) और एनएफ-κबी को सक्रिय करने के लिए दूसरे मार्ग में एडीएपी-उत्प्रेरित इंटरफेरॉन-बीओ (टीआरआईएफ) - टीआरआईएफ-आश्रित या माइंड 88-स्वतंत्र मार्ग का उपयोग किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप उत्पादन होता है प्रकार I IFNs बरकरार टीएलआर सिग्नलिंगमाइक्रोबियल और वायरल संक्रमण से हमारे दैनिक संरक्षण के लिए महत्वपूर्ण है; टीएलआर सिग्नलिंग रास्ते में दोष से इम्यूनोडिफीसिअन हो सकता है और अक्सर मानव स्वास्थ्य के लिए हानिकारक होता है। 7

हालांकि, टीएलआर सिग्नलिंग एक 'दोधारी तलवार' है और अत्यधिक, अनियंत्रित टीएलआर सक्रियण हानिकारक है। निष्क्रिय टीएलआर प्रतिक्रियाएं कई तीव्र और पुरानी मानव भड़काऊ रोगों में रोगजनन के लिए योगदान देती हैं 8 , 9 । उदाहरण के लिए, सिसिस जो कि प्रणालीगत सूजन और बहु-अंग की चोट के कारण होती है, मुख्य रूप से संक्रमण के प्रति तीव्र, भारी प्रतिरक्षी प्रतिक्रियाओं के कारण होता है, टीओएलआर 2 और टीएलआर 4 के साथ सेप्सिस पैथोफिज़ियोलॉजी 10 , 11 , 12 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। इसके अलावा, टीओएलआर 5 को सिस्टिक फाइब्रोसिस 13 के रोगियों की पुरानी फेफड़ों की सूजन में योगदान करने के लिए पाया गया है, 14 इसके अलावा, डिज़ेग्रेटेड एंडोसोमल टीएलआर सिग्नलिंग (जैसे, टीएलआर 7 और टीएलआर 9) जोरदार रूप से प्रणालीगत ल्यूपस एरीथेमेटोसस (एसएलई) और रुमेटीयड गठिया (आरए) 15 , 16 सहित कई स्वयंइम्यून रोगों के विकास और प्रगति के साथ जुड़ा हुआ है। सबूत के इन converging लाइनों कई भड़काऊ रोगों 17 के लिए एक संभावित चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में TLR संकेत की पहचान।

हालांकि टीएलआर प्रतिक्रियाओं के औषधीय विनियमन को कई सूजन स्थितियों में फायदेमंद होने की उम्मीद है, दुर्भाग्य से, वर्तमान में टीएलआर सिग्नलिंग 9 , 17 , 18 को रोकने के लिए नैदानिक ​​रूप से बहुत कम यौगिकों उपलब्ध हैं। यह आंशिक रूप से प्रतिरक्षा होमोस्टेसिस और रोग विकृति में शामिल टीएलआर मार्गों की जटिलता और अतिरेक के कारण है। इसलिए, उपन्यास, पाटन के लिए खोजटी चिकित्सीय एजेंटों को कई टीएलआर सिग्नलिंग मार्गों को लक्षित करने के लिए मौलिक अंतराल को तोड़ सकता है, और क्लिनिक में टीएलआर अवरोधकों को आगे बढ़ाने की चुनौती को दूर कर सकता है।

नैनोसाइंस और नैनोटेक्नोलॉजी में तेजी से प्रगति के मामले में, नैनोविसेज उनकी अनूठी संपत्तियों 1 9 , 20 , 23 के कारण अगली पीढ़ी के टीएलआर मॉड्यूलर्स के रूप में उभर रहे हैं। नैनोस्केल आकार इन नैनो-चिकित्सीय विज्ञानों को बेहतर जैव-वितरण और निरंतर परिसंचरण 24 , 25 , 26 की अनुमति देता है । वांछित फार्माकोडायनेमिक और फार्माकोकाइनेटिक प्रोफाइल 27 , 28 , 2 9 को पूरा करने के लिए उन्हें और अधिक कार्यात्मक बनाया जा सकता है। और रोमांचक रूप से, इन उपन्यासों की जैव-क्रियाएं उनके आंतरिक गुणों से उत्पन्न होती हैं, जिसे इनके लिए तैयार किया जा सकता हैएक चिकित्सीय एजेंट के लिए डिलीवरी वाहन के रूप में कार्य करने की बजाय, विशिष्ट चिकित्सा अनुप्रयोग। उदाहरण के लिए, एक उच्च घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (एचडीएल) जैसे नैनोपेक्टिकल टीएलआर 4 लेगांड एलपीएस 23 को सफाई करके टीएलआर 4 सिग्नल को बाधित करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। इसके अलावा, हमने एक पेप्टाइड-सोना नैनोपार्टिकल संकर प्रणाली विकसित की है, जहां सजाया पेप्टाइड्स सोने की नैनोकणों की सतह के गुणों को बदल सकती हैं, और उन्हें विभिन्न जैव गतिविधियों 30 , 31 , 32 , 33 की अनुमति दे सकती है । इससे उन्हें अगली पीढ़ी के नैनो-चिकित्सा विज्ञान के रूप में दवा की एक विशेष श्रेणी (या "नैनो-ड्रग") बनाती है

इस प्रोटोकॉल में, हम पेप्टाइड-सोना नैनोपैर्टिकल (पेप्टाइड-जीएनपी) संकर के एक उपन्यास वर्ग की पहचान करने के लिए एक दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं जो फागोसिटिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं 32 में कई टीएलआर सिग्नलिंग पथ को असीमित रूप से रोक सकते हैं , 33 यह दृष्टिकोण व्यावसायिक रूप से उपलब्ध THP-1 रिपोर्टर सेल लाइनों पर आधारित है। रिपोर्टर कोशिकाओं में दो स्थिर, प्रारंभिक रिपोर्टर निर्माण होते हैं: ट्रांसक्रिप्शन कारक एनएफ-κबी और एक्टिवेटर प्रोटीन 1 (एपी-1) द्वारा एक प्रेरक के अनुयायी नियंत्रण में एक सिक्रेटेड भ्रुण क्षारीय फॉस्फेट (एसईएपी) जीन किया जाता है; दूसरे में इंटरफेरॉन नियामक कारकों (आईआरएफ) द्वारा अनुमोदित प्रमोटरों के नियंत्रण में एक गुप्त लुसिएफेज़ रिपोर्टर जीन शामिल है। टीएलआर उत्तेजना पर, संकेत पारगमन एनएफ-κबी / एपी-1 और / या आईआरएफ के सक्रियण की ओर जाता है, जो रिपोर्टर जीन को गुप्त सीएपी और / या ल्यूइफेरेज़ में बदल देता है; ऐसी घटनाओं को आसानी से स्पेक्ट्रोफोटोमीटर या ल्यूमिनमीटर के साथ उनके संबंधित सब्सट्रेट अभिकर्मकों का उपयोग करके पता लगाया जा सकता है। पेप्टाइड-जीएनपी संकर की हमारी पहले से स्थापित पुस्तकालय को स्क्रीन करने के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग करके, हमने सीसा उम्मीदवारों को पहचान लिया है जो टीएलआर 4 सिग्नलिंग पथ को पूरी तरह से बाधित कर सकते हैं। लीड पेप्टाइड के निरोधात्मक गतिविधि-जीएनपी संकर तब immunoblotting के एक और जैव रासायनिक दृष्टिकोण का उपयोग करके मान्य किया गया, और अन्य टीएलआर मार्गों पर मूल्यांकन किया गया। यह दृष्टिकोण टीएलआर सिग्नलिंग मार्गों को लक्षित करने वाले उपन्यास एजेंटों के तेज, प्रभावी स्क्रीनिंग की अनुमति देता है।

Protocol

1. सेल संस्कृति मीडिया और अभिकर्मकों की तैयारी

  1. आरपीएमआई -1640 माध्यम में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 2 मिमी एल-ग्लूटामाइन और 1 एमएम सोडियम प्यूरवेट की खुराक जोड़कर पूर्ण सेल संस्कृति माध्यम R10 तैयार करें।
    1. NF-κB / एपी-1 सक्रियण के नियंत्रण में एसईएपी की अभिव्यक्ति बनाए रखने के लिए एंटीबायोटिक्स Zeocin (200 माइक्रोग्राम / एमएल) को आर10 से जोड़कर चयन संस्कृति माध्यम R10-Z तैयार करें। एसईएपी और ल्यूइफेरेज़ रिपोर्टर जीनों दोनों को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं का चयन करने के लिए, जीओसीिन (100 माइक्रोग्राम / एमएल) और ब्लोस्टीडीन (10 माइक्रोग्राम / एमएल) दोनों को आर 10 (R10-ZB) के रूप में जोड़ें।
  2. सब्सट्रेट पाउडर (ई । जी। , क्वांटी-ब्लू) के एक थैली को 100 एमएल की अतिपरिवर्तन, एंडोक्सॉक्सिन मुक्त पानी 125 एमएल ग्लास फ्लास्क में भंग करके एसईपी सब्सट्रेट समाधान तैयार करें।
    1. समाधान धीरे से घुलो और इसे 1 डिग्री सेल्सियस के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ले जाना ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि सबस्ट्रेट्स का पूरा विघटन होता है।
    2. <Li> इसकी बाँझपन (वैकल्पिक) सुनिश्चित करने के लिए 0.2 माइक्रोन झिल्ली का उपयोग करके समाधान को फ़िल्टर करें, और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर उपयोग करने से पहले 2 सप्ताह तक संग्रहीत करें।
  3. सब्सट्रेट पाउडर ( जैसे क्वांटी-ल्यूक) के एक थैली को 25 मिलीलीटर की अल्टरपैर, एक बाँझ 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में एंडोटेक्सिन मुक्त पानी में भंग करके लुसिएफेस सब्सट्रेट समाधान तैयार करें।
    1. पूरी तरह से पाउडर भंग करने के बाद, तुरंत समाधान का उपयोग करें वैकल्पिक रूप से, समाधान का उपयोग 4 डिग्री सेल्सियस (एक सप्ताह तक) या -20 डिग्री सेल्सियस (एक महीने तक) में करने से पहले करें।
      सावधानी: दोनों सब्सट्रेट समाधान हल्के संवेदनशील होते हैं, और जब भी संभव हो तो प्रकाश के संपर्क से बचना चाहिए। समाधान के कई फ्रीज-पिघलना चक्र सब्सट्रेट की अस्थिरता का कारण बन सकता है और इसकी शेल्फ-लाइफ को छोटा कर सकता है।
  4. 500 μg / mL की एकाग्रता रखने के लिए आणविक ग्रेड डाइमिथाइल सल्फोक्सिड (डीएमएसओ) में फोर्बोल 12-मिरिस्टेट 13-एसीटेट (पीएमए) के स्टॉक समाधान को तैयार करें। स्टॉक समाधान के कुछ अंश बनाएं (एक 500 μL ट्यूब में 10 μL) और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. 5 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता पर बाँझ, एंडोटॉक्सिन मुक्त पानी में एलपीएस (ई-कोली के 12) स्टॉक समाधान तैयार करें, और -20 डिग्री सेल्सियस पर लंबी अवधि के भंडारण के लिए अलिक्ट्यूज़ बनाएं। 100 μg / mL की एकाग्रता में फॉस्फेट बफ़ेड खारा (पीबीएस) में स्टॉक एलपीएस को कम करके और उपयोग करने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करके काम कर रहे एलपीएस समाधान तैयार करें।
    सावधानी: संस्कृति उपयोग के लिए अभिकर्मक तैयारी एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में किया जाना चाहिए और सभी कंटेनरों को प्रयोग करने से पहले निष्फल होना चाहिए। पीएमए और एलपीएस समाधानों के फ्रीज-पिघलना चक्रों को दोहराया जाना चाहिए।

2. टीएचपी -1 रिपोर्टर सेल-व्युत्पन्न मैक्रोफेज की संस्कृति

  1. दो THP-1 रिपोर्टर सेल लाइनों का उपयोग करें: THP-1-XBlue और THP-1- दोहरी कोशिकाएं। पूर्व में एसईएपी रिपोर्टर जीन एनएफ-κबी / एपी-1 द्वारा नियंत्रित होता है, और बाद में दोहरी रिपोर्टर जीन सिस्टम होता है, वही एसईएपी रिपोर्टर जीन और आईआरएफ नियंत्रित लुईफेरेज़ जीन है।ईर संस्कृति प्रक्रियाएं चयन संस्कृति मीडिया को छोड़कर समान हैं।
    1. 10 एमएल के आर 10 मध्यम में काम कर रहे एक सेल स्टॉक (~ 5 x 10 6 कोशिकाओं) को पिघलना, 5 मिनट के लिए 300 xg में कोशिकाओं को स्पिन करें 10 एमएल के आर 10 मध्यम में कोशिकाओं को रिज़स्पेेंड करें और उन्हें टी 75 संस्कृति फ्लास्क में स्थानांतरित करें। प्रत्येक 2-3 दिनों में संस्कृति माध्यम को एक्सचेंज करते समय तक कोशिकाओं में 1 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल की घनत्व तक पहुंच होती है।
    2. सेल की वृद्धि अपनी क्षमता तक पहुंचते समय, कोशिकाएं 2-5 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल की श्रेणी में सेल घनत्व को कम करने के लिए होती हैं, इसलिए कोशिकाएं बढ़ना जारी रख सकती हैं।
    3. कम से कम 1 मार्ग के बाद, चयन संस्कृति माध्यम में संस्कृति को शुरू करें: THP-1-XBlue के लिए R10-Z और THP-1-Dual के लिए R10-ZB। कम से कम 1 मार्ग के लिए चयन संस्कृति माध्यम से कोशिकाओं को संवर्धन करने के बाद, कोशिका प्रयोग के लिए तैयार हैं।
      सावधानी: सेल पर अध्यारोपित होने से महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु हो सकती है; सेल व्यवहार्यता को बनाए रखना चाहिए> 98% सीएल के रूप में बीतने की संख्या का रिकॉर्ड रखेंएलएस कई मार्गों (> 20 अंश) के बाद अलग तरीके से व्यवहार कर सकता है।
      नोट: लागत को बचाने के लिए सेल संस्कृति फ्लास्क का पुन: उपयोग किया जा सकता है; हालांकि, यह अभ्यास अलग-अलग फ्लास्क (यदि एक ही समय में विभिन्न सेल लाइनों को संभालने) के बीच सामान्य संदूषण और क्रॉस-संदूषण के जोखिम को बढ़ा सकता है। मीडिया एक्सचेंज और सेल मार्ग के दौरान, सेंट्रीफ्यूजेशन 5 मिनट के लिए 300 xg पर सेट किया गया है।
  2. रिपोर्टर सेल परख, बीज की कोशिकाओं को 96-अच्छी तरह से फ्लैट-नीचे सेल संस्कृति प्लेट में प्रदर्शन करने और उन्हें मैक्रोफेज में अंतर करने के लिए। प्रक्रियाओं को निम्नलिखित में वर्णित किया गया है।
    1. फ्लास्क से कोशिकाओं को एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें, कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए 300 xg में घुमा दें, और 1 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता में उन्हें R10 माध्यम में पुनः खोलें। 50 एनजी / एमएल की अंतिम एकाग्रता के साथ सेल निलंबन में पीएमए समाधान के अलक्ष्य जोड़ें।
    2. 96-के प्रत्येक कुएं में सेल निलंबन के 100 μL स्थानांतरणएक बहु-चैनल विंदुक का उपयोग कर प्लेटें 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस (सेल सेलुलर इनक्यूबेटर में) पर प्लेट को सेते।
    3. ऊष्मायन के बाद, वैक्यूम एस्पिरेटर (या मल्टी-चैनल विंदुक के साथ) का उपयोग करके संस्कृति माध्यम को ध्यान से हटा दें, और दो बार पीबीएस (100 μL / अच्छी) के साथ कोशिकाओं को धीरे से धो लें; प्रत्येक कुएं में 100 μL ताजा R10 माध्यम जोड़ें रिपोर्टर परख आयोजित करने से पहले इनक्यूबेटर में 2 दिनों के लिए कोशिकाओं को आराम करें।
      सावधानी: पीएमए उत्तेजना के बाद अपने सामान्य शांत स्थिति में कोशिकाओं को शांत करने की अनुमति देने के लिए आराम करने का कदम बहुत महत्वपूर्ण है यह अस्थिर परिस्थितियों के तहत रिपोर्टर जीनों के पृष्ठभूमि संकेतों को काफी कम कर सकता है।
      नोट: पीएमए के साथ 24 उत्तेजना के बाद, कोशिकाओं को मैक्रोफेज जैसे फ़नोटाइप में विभेदित किया जाता है, साथ ही कुएं के तल पर सेल आसंजन की विशेषता होती है, और छद्पोपिया की एक आकृतित्मक विशेषता है।

3. रिपोर्टर सेल का इस्तेमाल करने वाले संभावित टीएलआर 4 नैनो इनहिबिटर के लिए स्क्रीनिंग नोट: चूंकि TLR4 सिग्नलिंग MyD88- निर्भर और TRIF- निर्भर रास्ते का उपयोग करती है, इसलिए इसे टीएलआर सिग्नलिंग पथ की एक विस्तृत श्रृंखला को शामिल करने के लिए प्राथमिक लक्ष्य के रूप में चुना गया है। THP-1-XBlue रिपोर्टर कोशिकाओं का उपयोग मुख्य रूप से एनएफ-κबी / एपी-1 सक्रियण के लिए किया जाता है, जबकि टीएचपी-1-ड्यूल कोशिकाएं टीआरआईएफ-आश्रित सिग्नल पारगमन से आईआरएफ सक्रियण के लिए हैं।

  1. स्क्रीनिंग से पहले एक खुराक-प्रतिक्रिया वक्र उत्पन्न करके इष्टतम एलपीएस खुराक की पहचान करें।
    1. 0.01 - 100 एनजी / एमएल के R10 मध्यम (लॉग 10 स्केल में कमजोर पड़ने के लिए) के अंतिम एकाग्रता में काम करने वाले एलपीएस समाधान को पतला करें। प्लेट डिजाइन को लेआउट और एक 96-अच्छी तरह से गोल-नीचे संस्कृति प्लेट में कमजोर पड़ाना कमजोर पड़ने के बाद सुनिश्चित करें कि प्रत्येक अच्छी तरह से कम से कम 110 μL समाधान हो।
    2. वैक्यूम एस्पीरेटर का उपयोग करके सेल-सीडेड प्लेट (2.2.3 से) से संस्कृति माध्यम को धीरे से हटा दें।
    3. डीएलयूशन प्लेट (3.1.1) में तैयार किए गए आर 10 मध्यम युक्त एलपीएस को स्थानांतरित करें Iनमूनों के लेआउट के अनुसार संस्कृति प्लेट में nto। 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस (सेल सेलुलर इनक्यूबेटर में) पर प्लेट को सेते।
    4. 24 घंटे में, सावधानीपूर्वक प्रतिस्थापनकर्ताओं (80 μL / अच्छी तरह) को एक नई 96-अच्छी तरह से गोल-नीचे प्लेट में स्थानांतरित करें इन समाधानों पर रंगिमेट्रिक और / या ल्यूसफेरेस ल्यूमिनेसिसेंस परख का संचालन करें या उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस (कई घंटे) या -20 डिग्री सेल्सियस (दिन) परख विकास से पहले रखें।
      नोट: प्लेट लेआउट का डिज़ाइन प्रयोग और डेटा विश्लेषण के लिए सरल और स्पष्ट होना चाहिए। प्रत्येक शर्त के लिए, 2-4 प्रतिकृति को माना जाना चाहिए। हमेशा एक नकारात्मक नियंत्रण समूह (एलपीएस नल) शामिल करें एनएफ-κबी / एपी-1 सक्रियण के लिए THP-1-XBlue कोशिकाओं का उपयोग करने की सिफारिश की गई है क्योंकि मैक्रोफेज में विभेदित होने के बाद दोहरी कोशिकाओं में एनएफ-κबी / एपी -1 सक्रियण की अपेक्षाकृत उच्च पृष्ठभूमि है। हालांकि, एनएफ-κबी / एपी-1 और आईआरएफ दोनों सक्रियण के लिए दोहरी कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए यह संभव है।
  2. रंग का विकास करेंएनएफ-κबी / एपी-1 सक्रियण और आईआरएफ सक्रियण के लिए ल्यूइफेरेस ल्यूमिनेसेंस परख के लिए इमट्रिक परख।
    1. NF-κB / एपी -1 सक्रियण का आकलन करने के लिए, प्रत्येक नमूने के 20 μL सतह पर तैरनेवाला एक नया 96-अच्छी तरह से फ्लैट-नीचे संस्कृति प्लेट में स्थानांतरित करें; और प्रत्येक अच्छी तरह से 180 μL पूर्व गर्म सीएपी सब्सट्रेट समाधान जोड़ें। रंग के विकास (गहरे नीले रंग से गुलाबी) की अनुमति देने के लिए 1 से 2 डिग्री सेल्सियस के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को सेते। एक प्लेट रीडर पर 655 एनएम पर अवशोषण ले लीजिए।
      चेतावनी: ऊष्मायन समय रंग विकास (30 मिनट तक रात भर ऊष्मायन के लिए) के आधार पर भिन्न हो सकता है। जब तक रंग विकास (OD> 3) की संतृप्ति से बचा नहीं, तब तक इंतजार करने के लिए अनुशंसा की जाती है कि जब तक अंधेरे रंग की ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) 1 से ऊपर हो जाए
    2. आईआरएफ सक्रियण के विश्लेषण के लिए, प्रत्येक नमूने के 10 μL सतह पर तैरनेवाला 96-अच्छी तरह से फ्लैट-नीचे सफेद प्लेट में स्थानांतरण करें। ल्यूसफेरेज़ समाधान (50 μL) जोड़ें और तुरंत luminescence w इकट्ठाअच्छी तरह से अच्छी तरह से
      नोट: अच्छी तरह से अच्छी तरह से और प्लेट से प्लेट तक पढ़ने luminescence में स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए एक ऑटो इंजेक्शन समारोह के साथ एक luminescence प्लेट रीडर का उपयोग करने के लिए अत्यधिक सिफारिश की है। यदि सब्सट्रेट समाधान मैन्युअल रूप से इंजेक्ट कर रहे हैं, तो कृपया प्रत्येक सुकून के लिए लगातार ऊष्मायन समय और रीडिंग सेट करें।
  3. 10 एनजी / एमएल एलपीएस उत्तेजना (3.1 के आधार पर) के साथ विभिन्न पेप्टाइड-जीएनपी संकर पर स्क्रीनिंग परख आयोजित करें। रिपोर्टर परख विकास के लिए 3.2 में उसी प्रक्रिया का पालन करें।
    1. Centrifugation विधि का उपयोग करके R10 माध्यम में पेप्टाइड-जीएनपी संकर 200 एमएम तक ध्यान केंद्रित करें। 30 मिनट के लिए 18,000 xg पर हाइब्रिड समाधान (10 एनएम) के 20 वॉल्यूम अपकेंद्रित्र, और सावधानीपूर्वक सतह पर तैरने वालों को त्यागें। एक ट्यूब में संकर (ट्यूब के नीचे) को इकट्ठा करें, उन्हें दो बार पीबीएस के साथ धो लें और R10 माध्यम के एक मात्रा में संकर को फिर से निलंबित करें।
    2. केंद्रित हाइब्रिड के बराबर मात्रा में मिलाएं औरएलपीएस (20 एनजी / एमएल) जिसमें आर 10 मध्यम युक्त संकर और एलपीएस 100 एमएम और 10 एनजी / एमएल होने का अंतिम संयोग है, क्रमशः है।
    3. सुसंस्कृत प्लेट (2.2.3) से संस्कृति माध्यम निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से मिश्रित समाधान के 100 μL को जोड़ने (प्रत्येक शर्त के लिए 3 प्रतिकृतियां); एक नकारात्मक नियंत्रण (मध्यम केवल) और एक एलपीएस नियंत्रण (संकर बिना 10 एनजी / एमएल एलपीएस) शामिल करें
    4. 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के ऊष्मायन के बाद, प्रत्येक कुएं के माध्यम को एक ट्यूब में स्थानांतरित करें और ट्यूबों को 18,000 xg, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 30 मिनट तक ट्रांसफ़्यूज करें। सतह पर तैरने वाले (50-80 μL / ट्यूब) को 96-अच्छी तरह से गोल-नीचे की थाली में ले लीजिए और 3.2 में वर्णित अनुसार रिपोर्टर परख प्रदर्शन करें।
      सावधानी: केन्द्रापसारक के बाद supernatants discarding जब, ट्यूब के नीचे संकर आंदोलन नहीं करते।
      नोट: चरण 3.3.4 में केन्द्रोत्तर संस्कृति के माध्यम से गैर-अन्तरभाजित नैनोकणिक संकर को निकालने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है, और संकर के साथ संकर के हस्तक्षेप से बच सकते हैं।लॉरिमेट्रिक / लुमिनेसिसेंस रीडिंग्स ऐसा इसलिए है क्योंकि सोने के नैनोकणों के आकार और ढेर के आधार पर प्रकाश की व्यापक तरंग दैर्ध्य को अवशोषित कर सकते हैं।

4. संभावित उम्मीदवारों के निरोधात्मक प्रभाव को प्रमाणित करना

नोट: स्क्रीनिंग से संभावित उम्मीदवारों के निरोधात्मक प्रभाव की पुष्टि करने के लिए, दो दृष्टिकोण कार्यरत हैं। एक निश्चित हाइब्रिड एकाग्रता (या दूसरी तरफ) पर उत्तेजक (एलपीएस) की खुराक प्रतिक्रियाओं की जांच करना है; दूसरा, सीधे एनएफ-κबी / एपी-1 और आईआरएफ 3 संकेतों पर निरोधक को इम्यूनोबलॉटिंग के माध्यम से देखना है।

  1. दृष्टिकोण के अनुसार, 3.3 में वर्णित एक ही प्रक्रिया के बाद 1 एनजी / एमएल और 10 एनजी / एमएल पर लीड संकर के 100 एनएम और दो एलपीएस सांद्रता के साथ संवाददाता परख करें। एक संकर हाइब्रिड (स्क्रीनिंग परिणामों के आधार पर) तुलना के लिए हाइब्रिड नियंत्रण के रूप में शामिल करें
  2. Immunoblotting दृष्टिकोण के लिए, मानक ई का पालन करेंएक्सपरिमेंटल प्रक्रियाएं
    1. R10 माध्यम में संस्कृति THP-1 कोशिकाओं, कोशिकाओं को 12-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट (2 x 10 6 कोशिकाओं / अच्छी तरह) में बीजों में बांटते हैं, और 24 घंटे के लिए 50 एनजी / एमएल पीएमए के साथ कोशिकाओं के इलाज के द्वारा मैक्रोफेज में अंतर रखते हैं 2 दिनों के लिए।
    2. सेल भेदभाव के बाद, 10 एनजी / एमएल एलपीएस वाले कोशिकाओं को समय के साथ (बिना 4 एच) संकर (100 एनएम) के साथ उत्तेजित करें। विभिन्न समय बिंदुओं (0, 5, 15, 30, 60, 120 और 240 मिनट) में, immunoblotting के लिए सेल lysates तैयार करें। एक नियंत्रण के रूप में एक निष्क्रिय संकर शामिल करें
    3. एनएफ-κ बी और आईआरएफ 3 के सक्रियण पर लीड संकर के निरोधात्मक प्रभाव की जांच के लिए IκBα, फॉस्फोरीलेटेड पी 65, और फास्फोरिलेटेड आईआरएफ 3 के संकेतों की जांच करें। आंतरिक नियंत्रण के रूप में β-actin और कुल IRF3 संकेतों की जांच करें।
      नोट: संकेत पारगमन अक्सर बहुत तेजी से (कुछ घंटों में) तब होता है जब रिपोर्टर एन्जाइम्स एसएपी और ल्यूइफेरेज़ (24 घंटे) की अभिव्यक्ति होती है। यह भी अत्यधिक के लिए सिफारिश की हैएक और सत्यापन पद्धति के रूप में 24 घंटे पर परीक्षण किए गए हाइब्रिड के मा व्यवहार्यता परख।

5. टीएलआर विशिष्टता का मूल्यांकन

नोट: लीड पेप्टाइड-जीएनपी हाइब्रिड की टीएलआर विशिष्टता की जांच के लिए, टीएलआर 2, टीएलआर 3 और टीएलआर 5 सहित अन्य टीएलआर सिगनल पथ का परीक्षण किया गया है। टीएलआर 7, 8 और 9 को बाहर रखा गया है क्योंकि टीएचआर -1 वाले व्युत्पन्न मैक्रोफेज मैक्रोफेज 34 में टीएलआर 7, 8 और 9 अभिव्यक्ति की कमी के कारण इन टीएलआर के उत्तेजना के लिए अच्छी प्रतिक्रिया नहीं देते हैं।

  1. टीओएलआर 2 (पैम 3 सीके 4), टीएलआर 3 (पॉली आई: सी) और टीएलआर 5 (फ्लैगेलिन) के लिए लिगेंड्स के विभिन्न सांद्रता (1 एनजी / एमएल से 25 माइग्राम / एमएल) का परीक्षण करें। 3.1 और 3.2 में प्रक्रिया
  2. लीड हाइब्रिड (100 एनएम) और प्रत्येक टीएलआर लिगेंड के मिश्रण के साथ कोशिकाओं का इलाज, सी से प्राप्त की एकाग्रता का मूल्यांकन करने के लिए 5.1 से प्राप्त एकाग्रता पर करें।3.2 में वर्णित प्रायोगिक प्रक्रिया के अनुसार ybrid। तुलना के लिए एक नियंत्रण के रूप में निष्क्रिय संकर शामिल करें

Representative Results

समग्र प्रयोगात्मक दृष्टिकोण चित्रा 1 में सचित्र है। दो टीएचपी -1 रिपोर्टर सेल लाइन, THP-1-XBlue और THP-1-Dual, क्रमशः NF-κB / एपी-1 और आईआरएफ के सक्रियण की जांच करके टीएलआर प्रतिक्रियाओं को तेज स्क्रीन करने के लिए उपयोग किया जाता है। एसएपी रंगिमेट्रिक परख द्वारा एनएफ-κबी / एपी -1 की सक्रियता का पता लगाया जा सकता है, जबकि आईआरएफ सक्रियण की निगरानी लाइसीफेरेस ल्यूमिनेसिस द्वारा की जाती है। मोनोसाइटैटिक THP-1 कोशिकाओं को आसानी से मैक्रोफेज में प्राप्त किया जा सकता है ताकि वे सहज phagocytic प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर अपने immunomodulatory गतिविधि के लिए nanodevices को स्क्रीन कर सकें। रिपोर्टर सिस्टम के साथ, स्क्रीनिंग एक उच्च-थ्रुपुट फ़ेशन में आयोजित की जा सकती है; इस प्रकार एक दृष्टिकोण नए immunotherapeutics की खोज के लिए बहुमुखी है, विशेष रूप से टीएलआर सिग्नलिंग जैसे सहज प्रतिरक्षा संकेतन पर लक्षित।

स्क्रीनिंग प्रक्रिया और प्रतिनिधि परिणामों में दिखाया गया है चित्रा 2 ए और 2 बी ) टीएलआर लिग्ड्स (उदाहरण के तौर पर टीएलआर 4) के विभिन्न सांद्रता को पेप्टाइड जीएनपी संकर की वास्तविक जांच के लिए इष्टतम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए पहले परीक्षण किया गया है। एलपीएस द्वारा टीएलआर 4 उत्तेजना ने एनएफ-κबी / एपी-1 और सीएपी के उत्पादन के सक्रियण के रूप में परिणत किया। जारी एसईएपी ने सब्सट्रेट को परिवर्तित कर दिया और अपनी फोटोफिसिकल प्रॉपर्टी को बदल दिया, जिसे प्रकाश अवशोषण में बदलकर मॉनिटर किया जा सकता है, जिससे समाधान रंग परिवर्तन ( चित्रा 2 सी ) बढ़ जाता है। ऐसा परिवर्तन उत्तेजना पर जारी एसईएपी की मात्रा के अनुपात में है, और स्पेक्ट्रोफोटोमीटर ( चित्रा 2 डी ) पर 655 एनएम पर अवशोषण को मापने के द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। इसी तरह, आईआरएफ (एलपीएस द्वारा शुरू किया गया) की सक्रियता से लैसीफेरा की अभिव्यक्ति हुईई, जो लुमेनिसेंस ( चित्रा 2 ई ) का उत्पादन करने के लिए सब्सट्रेट को उत्प्रेरित करता है। इन खुराक की प्रतिक्रियाओं के आधार पर, एलपीएस (10 एनजी / एमएल) का इष्टतम एकाग्रता पेप्टाइड-जीएनपी संकर ( तालिका 1 ) के एक छोटे से पहले स्थापित पुस्तकालय को स्क्रीन करने के लिए उपयोग किया गया था। संकर और उनके भौतिक-संबंधी विशेषताओं का निर्माण हमारे पिछले प्रकाशनों 30 , 31 , 32 में वर्णित किया गया था। स्क्रीनिंग से, संकर (पी 12 और उसके डेरिवेटिव) के एक समूह को एनएफ-κबी / एपी-1 और आईआरएफ सक्रियण दोनों के लिए एलपीएस ( चित्रा 2 एफ ) द्वारा ट्रिगर करने के लिए उनके शक्तिशाली निरोधात्मक गतिविधि के लिए पहचाना गया; दिलचस्प, संकर पी 13, पेप्टाइड कोटिंग्स में पी 12 से थोड़ा अलग है, इसमें कोई अवरोध गतिविधि नहीं थी, जो तुलना के लिए एक संकर नियंत्रण के रूप में सेवा की जा सकती थी। पी 13 डेरिवेटिव ने ओमे के आधार पर विभिन्न स्तर की हल्के निरोधात्मक गतिविधि दिखायी थीआर सतह पर सजाया पेप्टाइड

लीड हाइब्रिड की पहचान करने के बाद, निरोधात्मक गतिविधि को मान्य करना महत्वपूर्ण है। तांत्रिक कलाकृतियों के कारण संभावित झूठे सकारात्मक परिणामों को बाहर करने के लिए एलपीएस के संकर के विभिन्न अनुपातों की जांच करके निषेध सबसे पहले पुष्टि की गई थी। चूंकि एलपीएस की एकाग्रता में वृद्धि हुई है, संकर (एक निश्चित एकाग्रता में) के निरोधात्मक प्रभाव को कम किया गया ( चित्रा 3 ए और 3 बी )। आगे यह सुनिश्चित करने के लिए कि रिपोर्टर एसेल्स से मनाया गया निषेधार्थ वास्तव में एनएफ-κबी और आईआरएफ को सीड हाइब्रिड द्वारा सिग्नल करने का एक परिणाम था, समय के साथ सीधे प्रोटीन सिग्नल पारगमन का मूल्यांकन करने के लिए इम्यूनोबलॉटिंग का आयोजन किया गया था। एनएफ-κ बी और आईआरएफ 3 की सक्रियता एनएफ-κबी सबिनिट पी 65 के फास्फोराइटेशन की जांच करके और एनएफ-एओबी अवरोधक आईओबीबीए और फॉस्फोर की गिरावट की जांच कर रही है।आईआरएफ 3 के क्रमशः क्रम जैसा कि चित्रा 3 सी में दिखाया गया है, लीड हाइब्रिड पी 12 में पी 65 फास्फोरायलेशन कम हो सकता है, आईएबीबीए डिग्रेडेशन को रोक सकता है, और आईआरएफ 3 फोस्फोरायलेशन में विलंब हो सकता है, जबकि निष्क्रिय संकर पी 13 (डेटा नहीं दिखाया गया) हो सकता है। इन सभी परिणामों ने पुष्टि की कि पहचान लीड हाइब्रिड एनएफ-κबी और आईआरएफ 3 सक्रियण दोनों के नीचे-विनियमन द्वारा एलपीएस-मध्यस्थता वाले टीएलआर 4 सिग्नल को बाधित करने में सक्षम था।

टीएलआर 4 सिग्नलिंग के अलावा, टीएलआर 2, टीएलआर 3 और टीएलआर 5 सहित अन्य टीएलआर मार्गों पर लीड हाइब्रिड की निरोधात्मक गतिविधि का मूल्यांकन किया गया ताकि टीएलआर विशिष्टता को संबोधित किया जा सके। जैसा कि चित्रा 4 में दिखाया गया है, लीड हाइब्रिड पी 12 टीएलआर 2 और टीएलआर 5-मध्यस्थता एनएफ-κबी / एपी-1 सिग्नलिंग के साथ-साथ टीएलआर 3-मध्यस्थता आईआरएफ सक्रियण को कम करने में सक्षम था; फिर, निष्क्रिय संकर पी 13 ने कोई निरोधात्मक गतिविधि नहीं दिखायी। इन परिणामों ने सुझाव दिया कि पहचानित लीड हाइब्रिड में एक शक्तिशाली अवरोध है कई टीएलआर मार्गों पर आरई गतिविधि

आकृति 1
चित्रा 1: रिपोर्टर सेल परख का उपयोग करते हुए टीएलआर अवरोधक की उच्च-थ्रुथपुट स्क्रीनिंग के समग्र प्रयोगात्मक दृष्टिकोण। दो संवाददाता सेल लाइनों का उपयोग किया जाता है: THP-1-XBlue और THP-1-Dual। पूर्व में एसईएपी रिपोर्टर जीन एनएफ-κबी / एपी-1 सक्रियण के नियंत्रण में है, जबकि दोहरी प्रणाली में आईआरएफ सक्रियण के नियंत्रण के तहत एक अतिरिक्त लुइसफेरेस रिपोर्टर जीन है। इन कोशिकाओं को आसानी से प्रतिरक्षा प्रतिरक्षा संकेतन पर प्रतिरक्षा modulatory नैनोकणों की उच्च-थ्रुपुट स्क्रीनिंग के लिए मैक्रोफेज में विभेदित किया जा सकता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

Ftp_upload / 56075 / 56075fig2.jpg "/>
चित्रा 2: टीएलआर 4 सिग्नलिंग पर नैनो इनहिबिटर के उच्च-थ्रुपुट स्क्रीनिंग।
( ) प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं की एक योजना ( बी ) विभेदित मैक्रोफेज (200x बढ़ाई) की एक ऑप्टिकल सूक्ष्म छवि। ( सी ) एसईपी रिपोर्टर परख से समाधान रंग परिवर्तन की एक प्रतिनिधि छवि; संस्कृति के माध्यम में एसईएपी अभिव्यक्ति के आधार पर सब्सट्रेट समाधान का रंग बैंगनी या गहरा नीला (मूल गुलाबी से) में बदल गया। ( डी ) एलपीएस उत्तेजना के जवाब में 655 एनएम पर एसईपी सब्सट्रेट अवशोषण का मात्रात्मक विश्लेषण ( ) एलपीएस उत्तेजना के अनुपात में आईआरएफ रिपोर्टर सिस्टम से ल्यूइफेरेज़ ल्यूमिनेसिसेंस ( एफ ) लीड पेप्टाइड-जीएनपी हाइब्रिड पी 12 की पहचान करने वाली उच्च-थ्रूट्रॉप स्क्रीनिंग तथा टीएलआर 4 सिग्नलिंग के एनएफ-κबी / एपी-1 और आईआरएफ मार्गों को बाधित करने में इसकी डेरिवेटिव; संकर एकाग्रता = 100 एनएम; एलपीएसएकाग्रता = 10 एनजी / एमएल; बार मतलब ± मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करता है; N = 2. इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: लीड हाइब्रिड की निरोधात्मक गतिविधि का सत्यापन। दोनों ( ) एसईपी और ( बी ) ल्यूइफेरेज़ रिपोर्टर सिस्टम पर एलपीएस के विभिन्न सांद्रता के साथ लीड हाइब्रिड के निरोधात्मक प्रभाव की पुष्टि। ( सी ) एनआईएफ-κबी और आईआरएफ 3 पर लीड हाइब्रिड के अवरुद्ध की पुष्टि इम्यूनोबलॉटिंग के माध्यम से होती है। निष्क्रिय संकर पी 13 को तुलना के लिए एक हाइब्रिड नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। संकर एकाग्रता = 100 एनएम; एलपीएस एकाग्रता = 10 एनजी / एमएल; बार मतलब ± मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करता है; N = 3; * और *** निरूपित <0.05 एएनडीपी <0.001, क्रमशः एक तरह से एनोवा विश्लेषण का उपयोग कर। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4: अन्य टीएलआर सिग्नलिंग रास्ते पर लीड हाइब्रिड का निरोधात्मक प्रभाव।
टीएलआर 2 उत्तेजना (पीएएम 3 सीसी 4 = 1 एनजी / एमएल) ( ) और टीएल 5 उत्तेजना (फ्लैजेलिन = 100 एनजी / एमएल) ( बी ) के बाद लीड हाइब्रिड द्वारा एनएफ-κबी / एपी -1 का निषेध। ( सी ) टीएलआर 3 उत्तेजना (पॉली आई: सी = 25 माइक्रोग्राम / एमएल) के बाद सीड हाइब्रिड द्वारा एनएफ-κबी / एपी-1 और आईआरएफ दोनों संकेतों में कमी। संकर एकाग्रता = 100 एनएम; बार मतलब ± मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करता है; N = 3; *, **, और *** denote p <0.05, p <0.01, और p <0.001, क्रमशः, का उपयोग करएक तरह से एनोवा विश्लेषण; एनएस: गैर-महत्वपूर्ण इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

तालिका एक
तालिका 1: हमारे प्रारंभिक अध्ययन में स्थापित पेप्टाइड-जीएनपी संकर की एक छोटी लाइब्रेरी।
संकर सतह पर सोने के नैनोपार्टिकल कोर (~ 13 एनएम व्यास) और विभिन्न हेक्सापेप्टाइड कोटिंग्स से बने होते हैं। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

Discussion

चूंकि टीएलआर कई भड़काऊ बीमारियों के रोगजनन में शामिल हैं, इसलिए वे प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं और सूजन परिस्थितियों के मॉड्यूलेशन के लिए चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में उभरा है। हालांकि, टीएलआर सिग्नलिंग रास्तेों को रोकने के लिए चिकित्सा विज्ञान के नैदानिक ​​विकास को तिथि तक सीमित सफलता मिली है। एंटीमारियल ड्रग हाइड्रोसिजिकोक्वाइन जो टीएलआर 7 और टीएलआर 9 को रोकता है, नैदानिक ​​उपयोग 35 , 36 में है । इसी तरह, यौगिकों की सीमित मात्रा में चिकित्सीय परीक्षणों में भी प्रगति हुई है, जिसमें एरीटोरान, टीएलआर 4 विरोधी, जिसमें पूर्व-नैदानिक ​​अध्ययन 37 , 38 में एलपीएस-मध्यस्थता से भड़काऊ प्रतिक्रियाओं पर प्रभावकारी निरोधात्मक प्रभाव का प्रदर्शन किया गया था, चरण I / II क्लिनिकल में सकारात्मक परिणाम दिखाया। परीक्षण 39 , 40 , 41 , लेकिन अंततः चरण III परीक्षण मृत्यु दर को कम करने में विफल रहागंभीर सेप्सिस वाले रोगियों की संख्या 42 इस विफलता के कई संभावित कारण हैं, एक यह है कि सेप्सिस से जुड़ी सूजन की प्रतिक्रिया अक्सर कई टीएलआर मार्गों के माध्यम से शुरू होती है, और इस प्रकार केवल टीएलआर 4 को अवरुद्ध करने से भारी सूजन को कम करने के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता है। इसलिए, उपन्यास विकसित करना, शक्तिशाली पॉली-टीएलआर अवरोधक इस तरह की नैदानिक ​​चुनौतियों को दूर कर सकते हैं और अगली पीढ़ी के विरोधी भड़काऊ चिकित्सा विज्ञान बन सकते हैं। यहां वर्णित स्क्रीनिंग रणनीति और प्रोटोकॉल को टीएलआर सिग्नलिंग के अध्ययन में एक कुशल प्रयोगात्मक उपकरण के रूप में काम करने की उम्मीद है, और इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि अगली पीढ़ी के टीएलआर इनहिबिटर्स की तलाश में तेजी लाने के लिए एक दवा की खोज मंच के रूप में।

यह स्क्रीनिंग दृष्टिकोण नए टीएलआर इनहिबिटर के लिए खोज में कई लाभ प्रदान करता है। सबसे पहले, स्क्रीनिंग एक उच्च-थ्रुपुट फ़ेशन में प्राप्त की जा सकती है जो रिपोर्टर सेल सिस्टम का उपयोग करते हैं जो तेज, संवेदनशील और मात्रात्मक हैं। दूसरा, रिपोर्टर सेल लाइनों के साथ,स्क्रीनिंग को एनएफ़-κबी / एपी -1 मार्ग और आईआईएफआर के माध्यम से इंटरफेरॉन सिग्नलिंग सहित कई तरह की टीएलआर सिग्नलिंग कैसकेड्स को कवर करने के लिए किया जा सकता है; इस प्रकार, वे कई टीएलआर मार्गों की स्क्रीनिंग के लिए आदर्श हैं। तीसरा, इन रिपोर्टर कोशिकाओं को मानव monocytic THP-1 सेल लाइन से आनुवंशिक रूप से इंजीनियर किया गया है, जो सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को लक्षित करने के लिए हस्तक्षेप का अध्ययन करने के लिए एक अच्छी मॉडल प्रणाली है। चौथा, सेल लाइन आसानी से बनाए रखा है, और विशेष रूप से, मैक्रोफेज में विभेदित किया जा सकता है; और जब से मैक्रोफेज कई बीमारियों से जुड़ी सूजन स्थितियों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, वे टीएलआर सिग्नलिंग को लक्षित करने वाले इम्युनोथेराप्यूटिक्स की स्क्रीनिंग के लिए एक आदर्श लक्ष्य के रूप में काम करते हैं। पांचवें, मोनोसाइट्स और मैक्रोफेज में प्रभावशाली फागोसिटिक क्षमता है, जो नैनोकणों के उच्च सेलुलर तेज की अनुमति देती है, जिससे उन्हें नैनोस्केल चिकित्सीय एजेंटों के अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयुक्त बनाते हैं। इसके अलावा, इस स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल नैनो आधारित न केवल खोजने के लिए लागू किया जा सकता हैएप्यूटिक एजेंट्स, लेकिन अन्य प्रकार के जैव-सक्रिय यौगिक भी हैं।

यद्यपि यह स्क्रीनिंग प्लेटफ़ॉर्म बहुत बहुमुखी और मजबूत है, फिर भी झूठी खोज से बचने के लिए कुछ सावधानी बरतनी चाहिए। स्क्रीनिंग मुख्यतः रिपोर्टर परख पर आधारित होती है, जो विशिष्ट सिग्नलिंग इवेंट के नियंत्रण में रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति पर निर्भर करती है। आदर्श रूप से, रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति (एसईएपी और ल्यूइफेरेज़) ब्याज के संकेत पारगमन मार्ग की तीव्रता के अनुपात में है, और नशीली दवाओं के उम्मीदवारों के प्रभाव परख पढ़ना में परिलक्षित होता है। हालांकि, वास्तव में, रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति के ऊपर की ओर होने वाली किसी भी जैविक घटना परिणाम को प्रभावित कर सकती है, कभी-कभी एक झूठी सकारात्मक खोज की ओर अग्रसर हो सकती है। उदाहरण के लिए, एसईएपी की कम अभिव्यक्ति टीएलआर संकेतन 43 के निचले विनियमन के बजाय प्रोटीन संश्लेषण प्रक्रिया के निषेध से हो सकती है। ऐसी झूठी खोज से बचने के लिए, पहचान पत्र की निरोधात्मक गतिविधिडी उम्मीदवार हमेशा पुष्टि किए जाने चाहिए, और स्वर्ण मानक पद्धति, इम्यूनोबलॉटिंग के माध्यम से सीधे सिग्नलिंग मार्गों को देखने के लिए है। नैनोपेण्टिकल-आधारित चिकित्सीय एजेंटों की स्क्रीनिंग में एक और महत्वपूर्ण पहलू यह है कि इन नैन्यूबोसाइट्स की सतह का गुण है। सतह संशोधकों के आधार पर, नैनोविसेज में विभिन्न जैविक गतिविधि हो सकती है। हालांकि, कुछ जैव-आणविकियों के लिए उनके पास गैर-विशिष्ट बंधन क्षमता भी हो सकती है। एसएपी या ल्यूइफेरेज़ के लिए गैर-विशिष्ट बाध्यकारी होने के मामले में, इन नैन्यूबियों द्वारा उत्प्रेरक गतिविधि को substrates के साथ समझौता किया जा सकता है, जिससे संभावित गलत खोज हो सकती है। अतिरिक्त नियंत्रण समूहों को शामिल करना ( उदाहरण के लिए , केवल nanodevice) स्क्रीनिंग में झूठी खोज के जोखिम को कम करता है। आखिरी लेकिन कम से कम नहीं, पहचान की प्रमुख उम्मीदवारों की साइटोटोक्सिसाइटी की जांच की जानी चाहिए कि गलत खोज के लिए योगदानकर्ता कारक के रूप में साइटोटॉक्सिसीटी को शामिल नहीं किया जाना चाहिए। यह एक मानक व्यवहार्यता परख का उपयोग करते हुए स्क्रीनिंग प्रक्रिया के दौरान एक साथ किया जा सकता है ( जैसे ,एमटीएस या एमटीटी), या एक अलग प्रयोग में।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखक शंघाई संस्थानों के उच्च शिक्षण (एचवाई), शंघाई प्रथम पीपुल्स हॉस्पिटल (एचवाई) से शुरू होने वाले फंड, विशेष रूप से शंघाई जियाओटोंग से गॉफ़ेंग क्लिनिकल मेडिसिन ग्रांट सहायता में विशेष नियुक्ति (पूर्वी विद्वान) के प्रोफेसर के लिए कार्यक्रम से समर्थन को स्वीकार करना चाहते हैं। यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन (एचवाई), और क्रोहन और कोलाइटिस फाउंडेशन ऑफ़ कनाडा (सीसीएफसी) (एसईटी एंड एचवाई) से फंडिंग।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
THP-1-XBlue reporter cell InvivoGen thpx-sp keep cell culture passage under 20
THP-1-Dual repoter cell InvivoGen thpd-nfis keep cell culture passage under 20
RPMI-1640 (no L-glutamine) GE Health Care SH30096.02 Warm up to 37 °C before use; add supplements to make a complete medium R10
Fetal bovine serum (qualified) Thermo Fisher Scientific 12484028 Heat inactivated; 10% in RPMI-1640
L-glutamine Thermo Fisher Scientific SH30034.02 2 mM in the complete medium R10
Sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific 11360-070 1 mM in the complete medium R10
Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium, magnesium GE Health Care SH30028.02 Use for cell washing and reagent preparation
QUANTI-Blue InvivoGen rep-qb1 SEAP substrate
QUANTI-Luc InvivoGen rep-qlc2 Luciferase substrate
Zeocin InvivoGen ant-zn-1 Selection antibiotics for reporter cells
Blasticidin InvivoGen anti-bl-1 Selection antibiotics for reporter cells
Dimethyl sulfoxide (DMSO) for molecular biology Sigmal-Aldrich D8418-100ML Use for reagent preparation
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) for molecular biology Sigmal-Aldrich P1585-1MG Use for cell differentiation
Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli K12 InvivoGen tlrl-eklps TLR4 ligand
Pam3CSK4 InvivoGen tlrl-pms TLR2/1 ligand
Poly (I:C) HMW InvivoGen tlrl-pic TLR3 ligand
Flagellin from S. Typhimurium (FLA-ST), ultrapure InvivoGen tlrl-epstfla TLR5 ligand
SpectraMax Plus 384 microplate reader Molecular Devices N/A Read colorimetric assay
Infinite M200 Pro multimode microplate reader with injectors Tecan N/A Read luminiscience
Microfuge 22R centrifuge Beckman Coulter N/A Temperature controlled micro-centrifugator (up to 18,000 g)
Allegra X-15R centrifuge Beckman Coulter N/A Temperature controlled general purpose centrifugator (for cell culture use)
Costar assay plate, 96-well white with clear flat bottom, tissue culure treated Corning Costar 3903 Used for luminiscence assay

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Akira, S., Takeda, K. Toll-like receptor signalling. Nat Rev Immunol. 4, (7), 499-511 (2004).
  2. Beutler, B. A. TLRs and innate immunity. Blood. 113, (7), 1399-1407 (2009).
  3. Gay, N. J., Symmons, M. F., Gangloff, M., Bryant, C. E. Assembly and localization of Toll-like receptor signalling complexes. Nat Rev Immunol. 14, (8), 546-558 (2014).
  4. Palm, N. W., Medzhitov, R. Pattern recognition receptors and control of adaptive immunity. Immunol Rev. 227, (1), 221-233 (2009).
  5. Kawasaki, T., Kawai, T. Toll-like receptor signaling pathways. Front Immunol. 5, 461 (2014).
  6. Uematsu, S., Akira, S. Toll-like receptors and Type I interferons. J Biol Chem. 282, (21), 15319-15323 (2007).
  7. Maglione, P. J., Simchoni, N., Cunningham-Rundles, C. Toll-like receptor signaling in primary immune deficiencies. Ann N Y Acad Sci. 1356, 1-21 (2015).
  8. Drexler, S. K., Foxwell, B. M. The role of toll-like receptors in chronic inflammation. Int J Biochem Cell Biol. 42, (4), 506-518 (2010).
  9. O'Neill, L. A., Bryant, C. E., Doyle, S. L. Therapeutic targeting of Toll-like receptors for infectious and inflammatory diseases and cancer. Pharmacol Rev. 61, (2), 177-197 (2009).
  10. Harter, L., Mica, L., Stocker, R., Trentz, O., Keel, M. Increased expression of toll-like receptor-2 and -4 on leukocytes from patients with sepsis. Shock. 22, (5), 403-409 (2004).
  11. Roger, T., et al. Protection from lethal gram-negative bacterial sepsis by targeting Toll-like receptor 4. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (7), 2348-2352 (2009).
  12. Tsujimoto, H., et al. Role of Toll-like receptors in the development of sepsis. Shock. 29, (3), 315-321 (2008).
  13. Blohmke, C. J., et al. TLR5 as an anti-inflammatory target and modifier gene in cystic fibrosis. J Immunol. 185, (12), 7731-7738 (2010).
  14. Hartl, D., et al. Innate immunity in cystic fibrosis lung disease. J Cyst Fibros. 11, (5), 363-382 (2012).
  15. Celhar, T., Fairhurst, A. M. Toll-like receptors in systemic lupus erythematosus: potential for personalized treatment. Front Pharmacol. 5, 265 (2014).
  16. Chen, J. Q., Szodoray, P., Zeher, M. Toll-Like Receptor Pathways in Autoimmune Diseases. Clin Rev Allergy Immunol. 50, (1), 1-17 (2016).
  17. Hennessy, E. J., Parker, A. E., O'Neill, L. A. Targeting Toll-like receptors: emerging therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9, (4), 293-307 (2010).
  18. Hedayat, M., Netea, M. G., Rezaei, N. Targeting of Toll-like receptors: a decade of progress in combating infectious diseases. Lancet Infect Dis. 11, (9), 702-712 (2011).
  19. Huang, L., et al. Engineering DNA nanoparticles as immunomodulatory reagents that activate regulatory T cells. J Immunol. 188, (10), 4913-4920 (2012).
  20. Lemos, H., et al. Activation of the STING adaptor attenuates experimental autoimmune encephalitis. J Immunol. 192, (12), 5571-5578 (2014).
  21. Hess, K. L., Andorko, J. I., Tostanoski, L. H., Jewell, C. M. Polyplexes assembled from self-peptides and regulatory nucleic acids blunt toll-like receptor signaling to combat autoimmunity. Biomaterials. 118, 51-62 (2017).
  22. Tostanoski, L. H., et al. Design of Polyelectrolyte Multilayers to Promote Immunological Tolerance. ACS Nano. (2016).
  23. Foit, L., Thaxton, C. S. Synthetic high-density lipoprotein-like nanoparticles potently inhibit cell signaling and production of inflammatory mediators induced by lipopolysaccharide binding Toll-like receptor 4. Biomaterials. 100, 67-75 (2016).
  24. He, C., Hu, Y., Yin, L., Tang, C., Yin, C. Effects of particle size and surface charge on cellular uptake and biodistribution of polymeric nanoparticles. Biomaterials. 31, (13), 3657-3666 (2010).
  25. Hirn, S., et al. Particle size-dependent and surface charge-dependent biodistribution of gold nanoparticles after intravenous administration. Eur J Pharm Biopharm. 77, (3), 407-416 (2011).
  26. Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery. Nat Biotechnol. 33, (9), 941-951 (2015).
  27. Arvizo, R. R., et al. Modulating pharmacokinetics, tumor uptake and biodistribution by engineered nanoparticles. PLoS One. 6, (9), e24374 (2011).
  28. Ernsting, M. J., Murakami, M., Roy, A., Li, S. D. Factors controlling the pharmacokinetics, biodistribution and intratumoral penetration of nanoparticles. J Control Release. 172, (3), 782-794 (2013).
  29. Lin, P. J., Tam, Y. K. Enhancing the pharmacokinetic/pharmacodynamic properties of therapeutic nucleotides using lipid nanoparticle systems. Future Med Chem. 7, (13), 1751-1769 (2015).
  30. Yang, H., Fung, S. Y., Liu, M. Programming the cellular uptake of physiologically stable peptide-gold nanoparticle hybrids with single amino acids. Angew Chem Int Ed Engl. 50, (41), 9643-9646 (2011).
  31. Yang, H., et al. Amino Acid Structure Determines the Immune Responses Generated by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. Particle & Particle Systems Characterization. 30, (12), 1039-1043 (2013).
  32. Yang, H., et al. Amino Acid-Dependent Attenuation of Toll-like Receptor Signaling by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. ACS Nano. 9, (7), 6774-6784 (2015).
  33. Yang, H., et al. Endosomal pH modulation by peptide-gold nanoparticle hybrids enables potent anti-inflammatory activity in phagocytic immune cells. Biomaterials. 111, 90-102 (2016).
  34. Ospelt, C., Gay, S. TLRs and chronic inflammation. Int J Biochem Cell Biol. 42, (4), 495-505 (2010).
  35. Kuznik, A., et al. Mechanism of endosomal TLR inhibition by antimalarial drugs and imidazoquinolines. J Immunol. 186, (8), 4794-4804 (2011).
  36. Lee, S. J., Silverman, E., Bargman, J. M. The role of antimalarial agents in the treatment of SLE and lupus nephritis. Nat Rev Nephrol. 7, (12), 718-729 (2011).
  37. Mullarkey, M., et al. Inhibition of endotoxin response by e5564, a novel Toll-like receptor 4-directed endotoxin antagonist. J Pharmacol Exp Ther. 304, (3), 1093-1102 (2003).
  38. Barochia, A., Solomon, S., Cui, X., Natanson, C., Eichacker, P. Q. Eritoran tetrasodium (E5564) treatment for sepsis: review of preclinical and clinical studies. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 7, (4), 479-494 (2011).
  39. Rossignol, D. P., et al. Safety, pharmacokinetics, pharmacodynamics, and plasma lipoprotein distribution of eritoran (E5564) during continuous intravenous infusion into healthy volunteers. Antimicrob Agents Chemother. 48, (9), 3233-3240 (2004).
  40. Rossignol, D. P., Wong, N., Noveck, R., Lynn, M. Continuous pharmacodynamic activity of eritoran tetrasodium, a TLR4 antagonist, during intermittent intravenous infusion into normal volunteers. Innate Immun. 14, (6), 383-394 (2008).
  41. Tidswell, M., et al. Phase 2 trial of eritoran tetrasodium (E5564), a toll-like receptor 4 antagonist, in patients with severe sepsis. Crit Care Med. 38, (1), 72-83 (2010).
  42. Opal, S. M., et al. Effect of eritoran, an antagonist of MD2-TLR4, on mortality in patients with severe sepsis: the ACCESS randomized trial. JAMA. 309, (11), 1154-1162 (2013).
  43. Fung, S. Y., et al. Unbiased screening of marine sponge extracts for anti-inflammatory agents combined with chemical genomics identifies girolline as an inhibitor of protein synthesis. ACS Chem Biol. 9, (1), 247-257 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics