トール様受容体シグナル伝達の阻害剤に対する食作用性免疫細胞における生物活性ナノ粒子のスクリーニング

Medicine
 

Summary

Toll様受容体(TLR)シグナル伝達は、多くのヒト炎症性疾患の病態生理学において重要な役割を果たし、生物活性ナノ粒子によるTLR応答の調節は、多くの炎症状態において有益であると予想される。 THP-1細胞ベースのレポーター細胞は、TLRシグナル伝達の新規インヒビターを同定するための多目的で堅牢なスクリーニングプラットフォームを提供する。

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Yang, H., Fung, S. Y., Bao, A., Li, Q., Turvey, S. E. Screening Bioactive Nanoparticles in Phagocytic Immune Cells for Inhibitors of Toll-like Receptor Signaling. J. Vis. Exp. (125), e56075, doi:10.3791/56075 (2017).

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Abstract

Toll様受容体(TLR)応答の薬理学的調節は、多くの炎症性疾患の治療において非常に有望である。しかし、これまでTLRシグナル伝達を弱めるために利用可能な化合物は限られており、臨床的に承認されたTLR阻害剤(抗マラリア薬ヒドロキシクロロキンを除く)は臨床的に使用されていない。ナノテクノロジーの急速な進歩に照らして、ナノデバイスを用いた免疫応答性の操作は、これらの疾患を治療するための新しい戦略を提供する可能性がある。本明細書では、貪食免疫細胞におけるTLRシグナル伝達を阻害する新規な生物活性ナノ粒子を迅速に同定するためのハイスループットスクリーニング法を提示する。このスクリーニングプラットフォームは、比色アッセイおよびルシフェラーゼアッセイを用いてTHP-1細胞ベースのレポーター細胞上に構築される。レポーター細胞は、2つの誘導性レポーター構築物の安定した組込みによって、ヒトTHP-1単球細胞株から操作される。 1つは、分泌された胚性アルカリホスファターゼ(SEAP)遺伝子を発現する転写因子NF-κBおよびAP-1によって誘導可能なプロモーターの制御下にあり、他方はインターフェロン調節因子(IRF)によって誘導可能なプロモーターの制御下で分泌型ルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する。TLR刺激に応答して、対応する基質試薬を用いて検出することができるSEAPおよび/またはルシフェラーゼを産生する。我々の以前の研究で確立されたペプチド - 金ナノ粒子(GNP)ハイブリッドのライブラリーを例として、プロトタイプのリガンドであるリポ多糖(LPS)によって引き起こされるTLR4シグナル伝達カスケードの2つのアームを効果的に阻害することができる1つのペプチド-NDPハイブリッドを同定した。この発見は、イムノブロッティングを含む標準的な生化学技術によって検証された。更なる分析により、この鉛ハイブリッドは、TLR2,3,4,5を含む複数のTLR経路に作用する広い阻害スペクトルを有することが確立された。この実験的アプローチにより、raナノ粒子(または他の治療化合物)は、貪食免疫細胞における特異的TLRシグナル伝達を調節することができる。

Introduction

Toll様受容体(TLR)は、感染に対する第一の防御線に寄与する先天性免疫系の重要な要素の1つである。 TLRは、病原体関連分子パターン(又はのPAMP)のレパートリーを認識し、シグナル伝達1,2のカスケードを介して防御反応を装着することによって侵入する病原体を検出するための責任があります。 10のヒトTLRが同定されている。リガンドが不明瞭なままであるTLR10を除いて、各TLRはPAMPの明確で保存されたグループを認識することができる。例えば、主に細胞表面上に位置するTLR2およびTLR4は、それぞれ、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌からのリポタンパク質および糖脂質を検出することができる。エンドソームコンパートメントに主に存在するTLR3、TLR7 / 8およびTLR9は、ウイルスおよび細菌由来のRNAおよびDNA産物を検出することができる3 。 PAMPによって刺激されると、TLRはpro-infを放出することによって必須の免疫応答を引き起こす炎症メディエーター、エフェクター免疫細胞の動員および活性化、およびその後の適応免疫イベントの調整4

TLRシグナル伝達は、単純に二つの主要な経路5,6に分類することができます。 1つは、アダプタータンパク質骨髄分化因子88(MyD88) - MyD88依存性経路に依存する。 TLR3を除くすべてのTLRは、この経路を利用して、活性化B細胞(NF-κB)およびマイトジェン関連プロテインキナーゼ(MAPK)の核因子κ軽鎖エンハンサーを活性化し、TNF- α、IL-6およびIL-8が含まれる。第2の経路は、インターフェロン(IFN)調節因子(IRF)およびNF-κBを活性化するTIRドメイン含有アダプター誘導性インターフェロン-β(TRIF)(TRIF依存性経路またはMyD88非依存性経路)を利用し、 I型IFNである。損なわれていないTLRシグナル伝達微生物およびウイルス感染からの私たちの毎日の防御にとって重要です。 TLRシグナル伝達経路の欠損は免疫不全を引き起こし、しばしばヒトの健康に有害である。 7

しかし、TLRシグナル伝達は「両刃の剣」であり、過度の制御されていないTLR活性化は有害である。過活動TLR応答は、多くの急性および慢性ヒトの炎症性疾患における病因8、9に貢献しています。全身性炎症および多臓器損傷によって特徴付けられる例えば、敗血症のために、TLR2およびTLR4は、敗血症の病態生理10、11、12で重要な役割を果たしていると、感染症に向けて急性、圧倒的な免疫応答の主な原因です。さらに、TLR5は、嚢胞性線維症の患者の慢性肺炎症に寄与することが分かっている1314 。また、異常調節エンドソームTLRシグナル(例えば、TLR7およびTLR9)が強く、全身性エリテマトーデス(SLE)及び関節リウマチ(RA)15、16を含むいくつかの自己免疫疾患の発症および進行に関連しています。これらの収束している証拠は、TLRシグナル伝達が多くの炎症性疾患の潜在的治療標的であることを示している17

TLR応答の薬理学的調節は、多くの炎症状態において有益であると予想されるが、残念ながら、現在TLR 9、17、18シグナル伝達を阻害するために臨床的に利用可能な非常に少ない化合物です。これは、免疫恒常性および疾患の病理に関与するTLR経路の複雑さおよび重複に一部原因がある。したがって、新しい、potenを探して複数のTLRシグナル伝達経路を標的とする治療剤は、基本的なギャップを埋めることができ、TLR阻害剤を臨床病院に進めるという課題を克服することができる。

ナノサイエンスおよびナノテクノロジーの急速な進歩に照らして、ナノデバイスは、それらのユニークな特性19、20、23のために次世代のTLRモジュレーターとして浮上しています。ナノスケールの大きさは、これらのナノ治療は、より良い生体分布および持続循環24、25、26有することを可能にします。彼らはさらに、所望の薬力学を満たすために官能化することができると薬物動態は27、28、29プロファイル 。より興味深いことに、これらの新規なナノデバイスの生物活性は、それらの固有の特性から生じ、これは単に治療剤の送達媒体として作用するのではなく、特定の医療用途に使用することができる。例えば、ナノ粒子様高密度リポタンパク質(HDL)は、TLR4リガンドLPS 23を捕捉することによりTLR4シグナル伝達を阻害するように設計されました。加えて、我々は、装飾されたペプチドが金ナノ粒子の表面特性を変化させ、そしてそれらは、様々な生体活動30、31、32、33有することを可能にすることができるペプチド、金ナノ粒子ハイブリッドシステムを開発しました。これにより、次世代のナノ治療薬としての特殊なクラスの薬物(または「ナノ薬物」)となります。

このプロトコールでは、貪食免疫細胞32中の複数のTLRシグナル伝達経路を強力に阻害することができるペプチド - 金ナノ粒子(ペプチド - GNP)ハイブリッドの新規なクラスを同定するためのアプローチを提示する32 33 。このアプローチは、市販のTHP-1レポーター細胞系に基づいている。レポーター細胞は、2つの安定した誘導性レポーター構築物からなる:転写因子NF-κBおよびアクチベータータンパク質1(AP-1)によって誘導されるプロモーターの制御下に分泌胚性アルカリホスファターゼ(SEAP)遺伝子を保持する。他方は、インターフェロン調節因子(IRF)によって誘導可能なプロモーターの制御下に分泌型ルシフェラーゼレポーター遺伝子を含む。 TLR刺激に際して、シグナル伝達はNF-κB/ AP-1および/またはIRFの活性化をもたらし、レポーター遺伝子をSEAPおよび/またはルシフェラーゼを秘密にする。そのような事象は、それらの対応する基質試薬を分光光度計または照度計で容易に検出することができる。以前に確立されたペプチドGNPハイブリッドのライブラリーをスクリーニングするこのアプローチを用いて、我々はTLR4シグナル伝達経路を強力に阻害し得る鉛候補を同定した。リードペプチド含有ペプチドの阻害活性は、次いでGNPハイブリッドをイムノブロッティングの別の生化学的手法を用いて検証し、他のTLR経路で評価した。このアプローチは、TLRシグナル伝達経路を標的とする新規薬剤の迅速で効果的なスクリーニングを可能にする。

Protocol

1.細胞培養培地および試薬の調製

  1. RPMI-1640培地に10%ウシ胎児血清(FBS)、2mM L-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウムのサプリメントを加えて完全な細胞培養液R10を調製します。
    1. NF-κB/ AP-1活性化の制御下でSEAPの発現を維持するためにR10に抗生物質Zeocin(200μg/ mL)を添加することにより、選択培地R10-Zを調製する。 SEAPとルシフェラーゼレポーター遺伝子の両方を発現する細胞を選択するには、ゼオシン(100μg/ mL)とブラストサイジン(10μg/ mL)の両方をR10に加える(R10-ZBとして)。
  2. 清浄な125mLガラスフラスコ中で、100mLの超純粋エンドトキシンフリー水に基質粉末の1つの袋( 例えば 、QUANTI-Blue)を溶解することによって、SEAP基質溶液を調製する。
    1. 溶液を静かに振り、37℃で1時間インキュベートして、基質の完全な溶解を確認します。
    2. <滅菌(オプション)を確実にするために0.2μmメンブレンを使用して溶液をろ過し、使用前2週間まで4℃で保存します。
  3. 基質粉末( 例えば 、QUANTI-Luc)の1つの袋を、滅菌50mL遠心分離管内の25mL超高純度エンドトキシンフリー水に溶解することによって、ルシフェラーゼ基質溶液を調製する。
    1. 粉末を完全に溶解した後、すぐに溶液を使用してください。あるいは、使用前に4℃(1週間まで)または-20℃(1ヶ月まで)で保存してください。
      注意:両方の基質溶液は光に敏感であり、いつでも可能な限り露光を避けるべきです。溶液の複数の凍結融解サイクルは、基材の不安定性を引き起こし、その有効期間を短くする可能性がある。
  4. 分子量ジメチルスルホキシド(DMSO)中のホルボール12-ミリステート13-アセテート(PMA)のストック溶液を500μg/ mLの濃度に調製する。原液のアリコートを作る(500μLチューブに10μL)を入れ、-20°Cで保存します。
  5. LPS(E-coli K12)原液を無菌エンドトキシンフリー水中に5mg / mLの濃度で調製し、-20℃で長期保存用に分注する。ストックLPSをリン酸緩衝食塩水(PBS)に100μg/ mLの濃度で希釈し、使用する前に-20℃で保存することにより、作用するLPS溶液を調製する。
    注意:培養用試薬は、バイオセーフティキャビネット内で調製し、すべての容器を使用前に滅菌する必要があります。 PMAおよびLPS溶液の繰り返しの凍結融解サイクルは避けるべきである。

2. THP-1レポーター細胞由来マクロファージの培養

  1. 2つのTHP-1レポーター細胞株:THP-1-XBlueおよびTHP-1-Dual細胞を使用する。前者はNF-κB/ AP-1によって制御されるSEAPレポーター遺伝子を有し、後者は二重レポーター遺伝子システム、同じSEAPレポーター遺伝子およびIRF制御ルシフェラーゼ遺伝子を有する。ザ選択培地以外の培養手順は同一である。
    1. 10mLのR10培地中で作業細胞ストック(約5×10 6細胞)を解凍し、細胞を300×gで5分間スピンダウンする。 10mLのR10培地に細胞を再懸濁し、T75培養フラスコに移す。細胞が1×10 6細胞/ mLの密度に達するまで培養培地を2〜3日おきに交換する。
    2. 細胞増殖がその能力に達すると、細胞を通過させて細胞密度を2〜5×10 5細胞/ mLの範囲に減少させるので、細胞は増殖し続けることができる。
    3. 少なくとも1継代後、選択培養培地:THP-1-XBlueについてはR10-Z、THP-1-デュアルについてはR10-ZBの細胞を培養し始める。選択培養培地で細胞を少なくとも1回継代培養した後、細胞は実験の準備が整う。
      注意:細胞の過剰増殖は、重大な細胞死につながる可能性があります。細胞生存率は> 98%を維持すべきである。通行回数を記録しておく多くの継代(20継代以上)後に異なる挙動を示す可能性があります。
      注:細胞培養フラスコはコストを節約するために数回再使用することができます。しかし、このプラクティスは、異なるフラスコ間での一般的な汚染および交差汚染のリスクを増大させる可能性がある(異なる細胞株を同時に取り扱う場合)。培地交換および細胞通過の間、遠心分離を300xgで5分間に設定する。
  2. レポーター細胞アッセイを行うために、96ウェル平底細胞培養プレートに細胞を播種し、それらをマクロファージに分化させる。手順は次のとおりです。
    1. フラスコから遠心チューブに細胞を移し、5分間300xgで細胞をスピンダウンし、1×10 6細胞/ mLの濃度でR10培地にそれらを再懸濁する。最終濃度50ng / mLの細胞懸濁液にPMA溶液のアリコートを添加する。
    2. 100μLの細胞懸濁液を96ウェルの各ウェルに移すマルチチャンネルピペットを使用してプレートを洗浄した。プレートを37℃(細胞培養インキュベーター内)で24時間インキュベートする。
    3. インキュベーション後、真空アスピレーター(またはマルチチャンネルピペットを使用)を用いて注意深く培地を除去し、PBS(100μL/ウェル)で細胞を2回静かに洗浄する。各ウェルに100μLの新鮮なR10培地を加える。レポーターアッセイを行う前にインキュベーターで2日間細胞を休止する。
      注意:PMA刺激後に細胞が正常な静かな状態に落ち着くようにするには、休息するステップが非常に重要です。これは、非刺激条件下でレポーター遺伝子のバックグラウンドシグナルを有意に減少させることができる。
      注:PMAで24回刺激した後、細胞はマクロファージ様表現型に分化し、ウェルの底に細胞接着の特徴をもち、偽妊娠の形態学的特徴を有する。

3.レポーター細胞を用いた潜在的TLR4ナノインヒビターのスクリーニング注記:TLR4シグナル伝達は、MyD88依存性経路とTRIF依存性経路の両方を利用するため、幅広いTLRシグナル伝達経路を網羅する主要な標的として選択される。 THP-1-XBlueレポーター細胞は、主にNF-κB/ AP-1活性化を検査するために使用されるが、THP-1-デュアル細胞は、TRIF依存性シグナル伝達からのIRF活性化のためである。

  1. スクリーニングの前に用量反応曲線を作成することにより、最適なLPS用量を特定する。
    1. 作用するLPS溶液をR10培地(log10スケールで希釈する)中で0.01〜100 ng / mLの最終濃度に希釈する。プレート設計をレイアウトし、96ウェル丸底培養プレートで希釈する。希釈後、各ウェルに最低110μLの溶液が含まれていることを確認してください。
    2. 静かに真空吸引器を用いて細胞を播種したプレート(2.2.3から)から培地を除去する。
    3. 希釈プレート(3.1.1)に調製したR10培地を含むLPSを移すi試料のレイアウトに従って培養プレートに移す。プレートを37℃(細胞培養インキュベーター内)で24時間インキュベートする。
    4. 24時間後、上清(80μL/ウェル)を注意深く新しい96ウェル丸底プレートに移す。これらの溶液で比色および/またはルシフェラーゼルミネッセンスアッセイを直ちに実施するか、アッセイの開発前に4℃(数時間)または-20℃(日)で保存します。
      注:プレートレイアウトの設計は、実験とデータ分析のためにシンプルで明確でなければなりません。各条件について、2-4回の反復を考慮する必要があります。常に陰性対照群(LPSヌル)を含む。 NF-κB/ AP-1活性化のためにTHP-1-XBlue細胞を使用することが推奨される。なぜなら、デュアル細胞はマクロファージに分化した後にNF-κB/ AP-1活性化のバックグラウンドが比較的高いからである。しかし、NF-κB/ AP-1およびIRF活性化の両方を報告するために二重細胞を使用することが可能である。
  2. 色を開発するIRF活性化のためのNF-κB/ AP-1活性化およびルシフェラーゼルミネッセンスアッセイのイミトリックアッセイ。
    1. NF-κB/ AP-1活性化を評価するために、各サンプルの上清20μLを新しい96ウェル平底培養プレートに移す。予熱したSEAP基質溶液180μLを各ウェルに加える。プレートを37℃で1〜2時間インキュベートして発色させる(ピンク〜ダークブルー)。プレートリーダー上で655nmでの吸収を集める。
      注意:インキュベーション時間は、発色(30分〜一晩のインキュベーション)に基づいて変化させることができます。発色(OD> 3)の飽和を避けながら、暗い色の光学濃度(OD)が1を超えるまで待つことをお勧めします。
    2. IRF活性化の分析のために、各サンプルの上清10μLを96ウェル透明平底白板に移す。ルシフェラーゼ溶液(50μL)を添加し、直ちに発光wまあまあ。
      注記:ウェルからウェルまで、およびプレート間でのルミネッセンス読み取りの一貫性を保証するために、自動注入機能を備えたルミネセンスプレートリーダーを使用することを強くお勧めします。基質溶液を手動で注入する場合は、ウェルごとに一定のインキュベーション時間と読み取り設定を確保してください。
  3. 10ng / mLのLPS刺激(3.1に基づく)を有する様々なペプチド-NDPハイブリッドについてのスクリーニングアッセイを行う。レポーターアッセイの開発については、3.2の同じ手順に従ってください。
    1. 遠心分離法を用いてR10培地中で200nMにペプチドGNPハイブリッドを濃縮する。 20,000倍量のハイブリッド溶液(10nM)を18,000×gで30分間遠心分離し、上清を慎重に捨てる。ハイブリッド(チューブの底にある)をチューブに集め、PBSで2回洗浄し、ハイブリッドをR10培地の1つのボリュームに再懸濁する。
    2. 同量の濃縮ハイブリッドとハイブリッドおよびLPSの最終濃度がそれぞれ100nMおよび10ng / mLになるように、R10培地を含むLPS(20ng / mL)を添加した。
    3. 培養プレートから培養液を除去し(2.2.3)、混合液100μLを各ウェルに加える(条件ごとに3回)。ネガティブコントロール(培地のみ)およびLPSコントロール(ハイブリッドなしの10ng / mL LPS)を含む。
    4. 37℃で24時間インキュベートした後、各ウェルの培地をチューブに移し、チューブを18,000×g、4℃で30分間遠心する。 96ウェル丸底プレートに上清(50〜80μL/チューブ)を集め、3.2で説明したようにレポーターアッセイを行う。
      注意:遠心分離後に上清を捨てるときは、チューブの底にハイブリッドをかき混ぜないでください。
      注:ステップ3.3.4の遠心分離は、非内在化ナノ粒子ハイブリッドを培養培地から取り除くために非常に重要であり、ハイブリッドのコロニーへの干渉を回避することができる測色/ルミネッセンス測定。これは、金ナノ粒子がその大きさおよび凝集に応じて広い波長の光を吸収することができるためである。

潜在的候補者の阻害効果の検証

注:スクリーニングから潜在的候補者の阻害効果を確認するために、2つのアプローチが用いられる。 1つは、固定されたハイブリッド濃度(またはその逆)での刺激物(LPS)の用量反応を調べることである。もう一つはイムノブロッティングによるNF-κB/ AP-1およびIRF3シグナルの阻害を直接見ることである。

  1. アプローチ1では、3.3で説明したのと同じ手順に従って、100 nMの鉛ハイブリッドと1 ng / mLと10 ng / mLの2つのLPS濃度でレポーターアッセイを行います。比較のためのハイブリッドコントロールとして、スクリーニング結果に基づいて非ハイブリッドを含める。
  2. イムノブロッティング法の場合は、標準experimental手続き。
    1. R10培地中のTHP-1細胞を培養し、細胞を12ウェル培養プレート(2×10 6細胞/ウェル)に播種し、細胞を50ng / mLのPMAで24時間処理してからマクロファージに分化させ、 2日間。
    2. 細胞分化後、ハイブリッド(100nM)の有無にかかわらず、10ng / mLのLPSで細胞を刺激する(最大4時間)。様々な時点(0,5,15,30,60,120および240分)で、イムノブロッティングのために細胞溶解物を調製する。コントロールとして非アクティブなハイブリッドを含める。
    3. IκBα、リン酸化されたp65、およびリン酸化されたIRF3のシグナルを調べて、NF-κBおよびIRF3の活性化に対する鉛ハイブリッドの阻害効果を調べる。 β-アクチンシグナルとトータルIRF3シグナルを内部コントロールとしてプローブする。
      注:シグナル伝達は、しばしばレポーター酵素SEAPおよびルシフェラーゼ(24時間)の発現よりもはるかに速く(数時間以内に)起こる。それはまた、24時間後の試験したハイブリッドの生存率アッセイを別の検証方法として用いた。

5. TLR特異性の評価

注:リードペプチド - GNPハイブリッドのTLR特異性を調べるために、TLR2、TLR3およびTLR5を含む他のTLRシグナル伝達経路を試験する。 THP-1由来のマクロファージは、マクロファージ34におけるTLR7,8,9発現の欠如のために、これらのTLRの刺激にうまく応答しないため、TLR7,8および9は除外される34

  1. TLR2(Pam3CSK4)、TLR3(ポリI:C)およびTLR5(フラジェリン)に特異的なリガンドの様々な濃度(1ng / mL〜25μg/ mL)を、マクロファージ由来の両方のレポーター細胞で試験して、 3.1および3.2の手順。
  2. 5.1から得られた濃度の鉛ハイブリッド(100nM)と各TLRリガンドとの混合物で細胞を処理して、鉛hの阻害特異性を評価する3.3に記載されている実験手順に従った。比較のための対照として非ハイブリッドを含める。

Representative Results

全体的な実験手法を図1に示します 。 2つのTHP-1レポーター細胞株、THP-1-XBlueおよびTHP-1-Dualを用いて、NF-κB/ AP-1およびIRFの活性化をそれぞれプロービングすることにより、TLR応答を迅速にスクリーニングする。 NF-κB/ AP-1の活性化は、SEAP比色アッセイによって検出することができるが、IRF活性化は、ルシフェラーゼルミネセンスによってモニターする。単球THP-1細胞は、生来の貪食免疫細胞に対する免疫調節活性についてナノデバイスをスクリーニングするためにマクロファージに容易に誘導することができる。レポーターシステムを用いて、ハイスループットの様式でスクリーニングを行うことができる。このようなアプローチは、新しい免疫療法剤の発見、特にTLRシグナル伝達のような先天性免疫シグナル伝達を標的とすることに多目的である。

スクリーニング手順および代表的な結果は、 図2A 2B )。ペプチド - GNPハイブリッドの実際のスクリーニングのための最適濃度を得るために、異なる濃度のTLRリガンド(例としてTLR4)を最初に試験する。 LPSによるTLR4刺激は、NF-κB/ AP-1の活性化およびSEAPの産生をもたらした。放出されたSEAPは基質を変換し、その光物性を変化させた。これは光吸収のシフトによってモニターすることができ、溶液の色の変化をもたらした( 図2C )。そのような変化は、刺激の際に放出されるSEAPの量に比例し、分光光度計で655nmでの吸光度を測定することによって定量することができる( 図2D )。同様に、(LPSによって引き起こされる)IRFの活性化は、ルシフェラーゼの発現を導いたこれは基質を触媒してルミネッセンスを生成した( 図2E )。これらの用量反応に基づいて、最適な濃度のLPS(10ng / mL)を用いて以前に確立されたペプチド - GNPハイブリッドの小さなライブラリーをスクリーニングした( 表1 )。ハイブリッドの作製とそれらの物理化学的特性は、我々の以前の出版物30、31、32に記載されました。スクリーニングから、NF-κB/ AP-1およびLPSによって誘発されたIRF活性化( 図2F )の両方に対するそれらの強力な阻害活性について、ハイブリッドの群(P12およびその誘導体)が同定された。興味深いことに、ペプチドコーティング中のP12とわずかに異なるハイブリッドP13は、阻害活性を全く有さず、比較のためのハイブリッド対照として役立ち得る。 P13誘導体は、他にも様々な軽度の阻害活性を示した表面に飾られたペプチド。

鉛ハイブリッドを同定した後、阻害活性を検証することが重要である。この阻害は、LPSに対するハイブリッドの異なる比率を調べることによって、技術的な成果物による潜在的な偽陽性の結果を排除することによって最初に確認された。 LPSの濃度が増加するにつれて、ハイブリッドの阻害効果(固定濃度で)は予想通り減少した( 図3A 3B )。レポーターアッセイからの観察された阻害が実際に鉛ハイブリッドによるNF-κBおよびIRFシグナル伝達のダウンレギュレーションの結果であることをさらに確実にするために、イムノブロッティングを行って経時的なタンパク質シグナル伝達を直接評価した。 NF-κBサブユニットp65のリン酸化およびNF-κB阻害剤IκBαの分解を調べることにより、NF-κBおよびIRF3の活性化を調べたそれぞれIRF3の増加を示す。 図3Cに示されるように、鉛ハイブリッドP12は、p65リン酸化を減少させ、IκBα分解を阻害し、IRF3リン酸化を遅延させるが、不活性ハイブリッドP13はできなかった(データ示さず)。これらの全ての結果は、同定された鉛ハイブリッドが、NF-κB活性化およびIRF3活性化の両方をダウンレギュレーションすることによって、LPS媒介TLR4シグナル伝達を阻害し得ることを確認した。

TLR4シグナル伝達に加えて、鉛ハイブリッドの阻害活性を、TLR2、TLR3およびTLR5を含む他のTLR経路でさらに評価して、TLR特異性に対処した。 図4に示すように、鉛ハイブリッドP12は、TLR2媒介IRF活性化と同様に、TLR2およびTLR5媒介NF-κB/ AP-1シグナル伝達を減少させることができた。再び、不活性ハイブリッドP13は阻害活性を示さなかった。これらの結果は、同定された鉛ハイブリッドが強力な阻害剤複数のTLR経路に対するry活性

図1
図1:レポーター細胞アッセイを用いたTLR阻害剤のハイスループットスクリーニングの全体的な実験的アプローチ。 2つのレポーター細胞株、THP-1-XBlueおよびTHP-1-デュアルが使用される。前者は、NF-κB/ AP-1活性化の制御下にあるSEAPレポーター遺伝子を有するが、二重系はIRF活性化の制御下に追加のルシフェラーゼレポーター遺伝子を有する。これらの細胞は、自然免疫シグナル伝達における免疫調節性ナノ粒子のハイスループットスクリーニングのために、マクロファージに容易に分化され得る。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

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図2:TLR4シグナル伝達に対するナノインヒビターのハイスループットスクリーニング。
A )実験手順のスキーム。 ( B )分化マクロファージ(倍率200倍)の光学顕微鏡画像。 ( C )SEAPレポーターアッセイからの溶液色の変化の代表的な画像;培地中のSEAP発現に依存して、基質溶液の色が紫色または暗青色(元のピンク色から)に変わった。 ( D )LPS刺激に応答した655nmでのSEAP基質吸収の定量分析。 ( E )LPS刺激に比例したIRFレポーター系からのルシフェラーゼ発光。 ( F )TLR4シグナル伝達のNF-κB/ AP-1およびIRF経路の両方を阻害する際のリードペプチド-NDPハイブリッドP12およびその誘導体を同定するハイスループットスクリーニング;ハイブリッド濃度= 100nM; LPS濃度= 10ng / mL;バーは平均±標準偏差を表す。 n = 2. この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図3
図3:鉛ハイブリッドの阻害活性の検証。A )SEAPおよび( B )ルシフェラーゼレポーター系の両方における種々の濃度のLPSによる鉛ハイブリッドの阻害効果の確認。 ( C )イムノブロッティングによるNF-κBおよびIRF3シグナル伝達における鉛ハイブリッドの阻害を確認する。非活性ハイブリッドP13を比較のためのハイブリッド対照として用いた。ハイブリッド濃度= 100nM; LPS濃度= 10ng / mL;バーは平均±標準偏差を表す。 n = 3; *および***はp <0.05nd p <0.001であった。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図4
図4:他のTLRシグナル伝達経路に対する鉛ハイブリッドの阻害効果。
TLR2刺激(Pam3CSK4 = 1ng / mL)( A )およびTL5刺激(フラジェリン= 100ng / mL)( B )後の鉛ハイブリッドによるNF-κB/ AP-1の阻害。 ( C )TLR3刺激(ポリI:C =25μg/ mL)後の鉛ハイブリッドによるNF-κB/ AP-1およびIRFシグナル伝達の両方の減少。ハイブリッド濃度= 100nM;バーは平均±標準偏差を表す。 n = 3; *、**、および***はそれぞれ、p <0.05、p <0.01およびp <0.001を用いて、一元配置ANOVA分析; ns:有意ではない。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

表1
表1:我々の初期の研究で確立されたペプチド - GNPハイブリッドの小さなライブラリー。
ハイブリッドは、金ナノ粒子コア(直径約13nm)および表面上の種々のヘキサペプチドコーティングからなる。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

Discussion

TLRは多くの炎症性疾患の病因に関与しているので、免疫応答および炎症状態の調節のための治療標的として浮上している。しかし、TLRシグナル伝達経路を阻害するための治療薬の臨床開発はこれまで成功していない。 TLR7およびTLR9を阻害する抗マラリア薬のヒドロキシクロロキンは、臨床使用35、36です。同様に、化合物の限られた数は、前臨床試験37、38におけるLPS媒介性炎症反応に強力な阻害効果を示しエリトラン、TLR4アンタゴニスト、を含む臨床試験に進行した、臨床フェーズI / IIで陽性の結果を示しました。試験39、40、41、最終的に第III相試験は、死亡率を減少させることができませんでした重度の敗血症の患者42 。この敗血症には多くの可能性があり、敗血症に関連する炎症反応はしばしば複数のTLR経路を介して誘発されるため、TLR4のみをブロックすることは圧倒的な炎症を軽減するには不十分である可能性がある。したがって、新規かつ強力なポリ-TLR阻害剤を開発することは、このような臨床上の課題を克服し、次世代の抗炎症治療剤になる可能性がある。ここに記載されたスクリーニング戦略およびプロトコルは、TLRシグナル伝達を研究する効率的な実験的ツールとして、そしてより重要なことに、次世代TLR阻害剤の探索を加速する創薬プラットフォームとして期待されている。

このスクリーニングアプローチは、新しいTLR阻害剤の探索においていくつかの利点を提供する。第1に、高速、高感度、定量的なレポーター細胞システムを用いて、ハイスループット様式でスクリーニングを達成することができる。第二に、両方のレポーター細胞株では、スクリーニングは、NF-κB/ AP-1経路およびI型インターフェロンシグナル伝達(IRFを介する)を含む幅広いTLRシグナル伝達カスケードをカバーするために行うことができる。従って、それらは複数のTLR経路のスクリーニングに理想的である。第3に、これらのレポーター細胞は、ヒト単球THP-1細胞株から遺伝的に操作されている。これは、本来の免疫応答を標的とする介入を研究するための良好なモデル系である。第4に、細胞株は容易に維持され、特に、マクロファージに分化することができる。マクロファージは多くの疾患関連炎症状態において重要な役割を果たすため、TLRシグナル伝達を標的とする免疫療法剤のスクリーニングに理想的な標的として役立つ。第5に、単球およびマクロファージは、ナノ粒子の高い細胞摂取を可能にする印象的な貪食能を有し、ナノスケールの治療剤の研究に特に適している。さらに、このスクリーニングプロトコルは、ナノベースの探索だけでなく他のタイプの生物活性化合物も含む。

このスクリーニングプラットフォームは非常に多用途で堅牢ですが、誤った発見を避けるためには注意が必要です。スクリーニングは、主として、特異的なシグナル伝達事象の制御下でのレポーター遺伝子の発現に依存するレポーターアッセイに基づいている。理想的には、レポーター遺伝子発現(SEAPおよびルシフェラーゼ)は、関心のあるシグナル伝達経路の強度に比例し、薬剤候補の影響がアッセイの読み出し値に反映される。しかしながら、実際には、レポーター遺伝子発現の上流に生じる生物学的事象が結果に影響を及ぼし、時には偽陽性の発見に至ることもある。例えば、SEAPの低発現は、TLRシグナル伝達のダウンレギュレーションからではなく、タンパク質合成プロセスの阻害から生じ得る43 。このような誤った発見を避けるために、同定の阻害活性候補者は常に検証されるべきであり、ゴールドスタンダードの方法はイムノブロッティングによってシグナル伝達経路を直接見ることである。ナノ粒子ベースの治療剤をスクリーニングする際の別の重要な側面は、これらのナノデバイスの表面特性である。表面改質剤に基づいて、ナノデバイスは様々な生物学的活性を有することができる。しかしながら、それらはまた、特定の生体分子に対して非特異的結合能力を有し得る。 SEAPまたはルシフェラーゼへの非特異的結合の場合、基質への触媒活性は、これらのナノデバイスによって損なわれ、誤った発見の可能性を導く可能性がある。スクリーニングに特別な対照群( 例えば 、ナノデバイスのみ)を含めることは、誤った発見のリスクを低減する。最後に、偽発見に寄与する因子として細胞傷害性を排除するために、同定された鉛候補の細胞傷害性を調べなければならない。これは、標準生存率アッセイ( 例えば 、MTSまたはMTT)、または別の実験で行った。

Disclosures

著者は何も開示することはない。

Acknowledgments

著者は、上海第一人民病院(HY)からの出発基金、上海交通大学からのGaofeng Clinical Medicine Grant支援の上級機関(HY)の特別任命教授(東部奨学生)のためのプログラムからの支援を認めたいと思います(HY)、およびカナダのクローン病および大腸炎財団(CCFC)(SETおよびHY)からの資金提供を受けています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
THP-1-XBlue reporter cell InvivoGen thpx-sp keep cell culture passage under 20
THP-1-Dual repoter cell InvivoGen thpd-nfis keep cell culture passage under 20
RPMI-1640 (no L-glutamine) GE Health Care SH30096.02 Warm up to 37 °C before use; add supplements to make a complete medium R10
Fetal bovine serum (qualified) Thermo Fisher Scientific 12484028 Heat inactivated; 10% in RPMI-1640
L-glutamine Thermo Fisher Scientific SH30034.02 2 mM in the complete medium R10
Sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific 11360-070 1 mM in the complete medium R10
Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium, magnesium GE Health Care SH30028.02 Use for cell washing and reagent preparation
QUANTI-Blue InvivoGen rep-qb1 SEAP substrate
QUANTI-Luc InvivoGen rep-qlc2 Luciferase substrate
Zeocin InvivoGen ant-zn-1 Selection antibiotics for reporter cells
Blasticidin InvivoGen anti-bl-1 Selection antibiotics for reporter cells
Dimethyl sulfoxide (DMSO) for molecular biology Sigmal-Aldrich D8418-100ML Use for reagent preparation
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) for molecular biology Sigmal-Aldrich P1585-1MG Use for cell differentiation
Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli K12 InvivoGen tlrl-eklps TLR4 ligand
Pam3CSK4 InvivoGen tlrl-pms TLR2/1 ligand
Poly (I:C) HMW InvivoGen tlrl-pic TLR3 ligand
Flagellin from S. Typhimurium (FLA-ST), ultrapure InvivoGen tlrl-epstfla TLR5 ligand
SpectraMax Plus 384 microplate reader Molecular Devices N/A Read colorimetric assay
Infinite M200 Pro multimode microplate reader with injectors Tecan N/A Read luminiscience
Microfuge 22R centrifuge Beckman Coulter N/A Temperature controlled micro-centrifugator (up to 18,000 g)
Allegra X-15R centrifuge Beckman Coulter N/A Temperature controlled general purpose centrifugator (for cell culture use)
Costar assay plate, 96-well white with clear flat bottom, tissue culure treated Corning Costar 3903 Used for luminiscence assay

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