Screening av bioaktive nanopartikler i phagocytiske immunceller for inhibitorer av Toll-lignende Receptor Signalering

Medicine
 

Summary

Toll-lignende reseptor (TLR) signalering spiller en viktig rolle i patofysiologien til mange humane inflammatoriske sykdommer, og regulering av TLR-responser av bioaktive nanopartikler forventes å være gunstig ved mange inflammatoriske tilstander. THP-1-cellebaserte reporterceller gir en allsidig og robust screeningsplattform for å identifisere nye inhibitorer av TLR-signalering.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Yang, H., Fung, S. Y., Bao, A., Li, Q., Turvey, S. E. Screening Bioactive Nanoparticles in Phagocytic Immune Cells for Inhibitors of Toll-like Receptor Signaling. J. Vis. Exp. (125), e56075, doi:10.3791/56075 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Farmakologisk regulering av Toll-lignende reseptor (TLR) -svar holder stort løfte i behandlingen av mange inflammatoriske sykdommer. Det har imidlertid vært begrenset tilgjengelige forbindelser så langt for å dempe TLR-signalering, og det har ikke vært klinisk godkjente TLR-hemmere (unntatt anti-malarialt hydroksyklorokin) i klinisk bruk. I lys av raske fremskritt innen nanoteknologi, kan manipulering av immunresponsivitet ved hjelp av nano-enheter gi en ny strategi for å behandle disse sykdommene. Her presenterer vi en høy gjennomsiktig screeningsmetode for raskt å identifisere nye bioaktive nanopartikler som hemmer TLR-signalering i fagocytiske immunceller. Denne screeningsplattformen er bygget på THP-1-cellebaserte reporterceller med kolorimetriske og luciferase-analyser. Reportercellene er konstruert fra den humane THP-1 monocytiske cellelinjen ved stabil integrasjon av to inducerbare reporterkonstruksjoner. En uttrykker et utskilt embryonalt alkalisk fosfatase (SEAP) -genUnder kontroll av en promotor inducerbar av transkripsjonsfaktorene NF-KB og AP-1, og den andre uttrykker et utskilt luciferase-reportergen under kontroll av promotorer som er inducerbare av interferon regulatoriske faktorer (IRFs). Etter TLR-stimulering aktiverer reportercellene Transkripsjonsfaktorer og deretter produsere SEAP og / eller luciferase, som kan detekteres under anvendelse av deres tilsvarende substratreagenser. Ved å bruke et bibliotek av hybrider av peptid-gull nanopartikkel (GNP) som ble etablert i våre tidligere studier som et eksempel, identifiserte vi en peptid-GNP-hybrid som effektivt kunne hemme de to armene av TLR4-signalkaskaden utløst av sin prototypiske ligand, lipopolysakkarid (LPS). Funnene ble validert ved standard biokjemiske teknikker, inkludert immunoblotting. Videre analyse fastslår at denne bly hybrid hadde et bredt hemmende spektrum, som virker på flere TLR-veier, inkludert TLR2, 3, 4 og 5. Denne eksperimentelle tilnærmingen tillater en rask vurdering av hvemRa nanopartikkel (eller andre terapeutiske forbindelser) kan modulere spesifikk TLR-signalering i fagocytiske immunceller.

Introduction

Toll-lignende reseptorer (TLRs) er en av hovedelementene i det medfødte immunsystemet som bidrar til den første forsvarslinjen mot infeksjoner. TLR er ansvarlige for å sensere invaderende patogener ved å gjenkjenne et repertoar av patogenassosierte molekylære mønstre (eller PAMPs) og montering av forsvarsreaksjoner gjennom en kaskade av signaltransduksjon 1 , 2 . Det er 10 menneskelige TLR identifisert; Unntatt TLR10 som ligandene forblir uklare, kan hver TLR gjenkjenne en distinkt, konservert gruppe PAMPs. For eksempel kan TLR2 og TLR4, primært lokalisert på celleoverflaten, detektere lipoproteiner og glykolipider fra Gram-positive og Gram-negative bakterier, henholdsvis; Mens TLR3, TLR7 / 8 og TLR9, hovedsakelig tilstede i endosomale rom, kan registrere RNA og DNA-produkter fra virus og bakterier 3 . Når stimulert av PAMP, utløser TLRs viktige immunrespons ved å slippe pro-infLammatoriske mediatorer, rekruttering og aktivering av effektorimmunceller, og koordinering av påfølgende adaptive immunforsvar 4 .

TLR-signaltransduksjonen kan enkelt kategoriseres i to hovedbaner 5 , 6 . Den ene er avhengig av adapter-myeloiddifferensieringsfaktoren 88 (MyD88) - den MyD88-avhengige banen. Alle TLR-er unntatt TLR3 benytter denne banen for å aktivere kappa-lette kjedeforsterker med kaktaktor av aktiverte B-celler (NF-KB) og mitogen-assosierte proteinkinaser (MAPKs), som fører til ekspresjon av proinflammatoriske mediatorer som TNF- A, IL-6 og IL-8. Den andre stien bruker TIR-domene-inneholdende adapter-inducerende interferon-β (TRIF) - TRIF-avhengig eller MyD88-uavhengig sti - for å aktivere interferon (IFN) regulatoriske faktorer (IRFs) og NF-KB, noe som resulterer i produksjon av Type I IFNer. Intact TLR-signaleringEr avgjørende for vår daglige beskyttelse mot mikrobielle og virusinfeksjoner; Mangler i TLR-signalveier kan føre til immunsvikt og er ofte skadelig for menneskers helse. 7

Imidlertid er TLR-signalering et "dobbeltkantet sverd" og overdreven, ukontrollert TLR-aktivering er skadelig. Overaktive TLR-responser bidrar til patogenesen i mange akutte og kroniske humane inflammatoriske sykdommer 8 , 9 . For eksempel er sepsis som er preget av systemisk betennelse og multiorgan skade, hovedsakelig på grunn av akutte, overveldende immunresponser mot infeksjoner, med TLR2 og TLR4 som spiller en avgjørende rolle i sepsispatofysiologien 10 , 11 , 12 . I tillegg har TLR5 vist seg å bidra til kronisk lungebetennelse hos pasienter med cystisk fibrose 13, 14 . Videre er dysregulert endosomal TLR-signalering (f.eks. TLR7 og TLR9) sterkt forbundet med utvikling og progresjon av flere autoimmune sykdommer, inkludert systemisk lupus erythematosus (SLE) og reumatoid artritt (RA) 15 , 16 . Disse konvergerende bevislinjene identifiserer TLR-signalering som et potensielt terapeutisk mål for mange inflammatoriske sykdommer 17 .

Selv om farmakologisk regulering av TLR-responser forventes å være gunstig i mange inflammatoriske tilstander, er det dessverre for øyeblikket svært få forbindelser klinisk tilgjengelige for å hemme TLR-signalering 9 , 17 , 18 . Dette skyldes delvis kompleksiteten og redundansen av TLR-banene involvert i immune homeostasis og sykdomspatologi. Derfor søker etter roman, potenT terapeutiske midler for å målrette flere TLR signalveier kunne bygge bro over et grunnleggende gap, og overvinne utfordringen med å fremme TLR-hemmere inn i klinikken.

I lys av de raske fremskrittene innen nanovitenskap og nanoteknologi, utvikler nanodevices som neste generasjons TLR modulatorer på grunn av deres unike egenskaper 19 , 20 , 23 . Nanoskala-størrelsen gjør at disse nano-terapeutika har bedre biodistribusjon og vedvarende sirkulasjon 24 , 25 , 26 . De kan funksjonaliseres ytterligere for å tilfredsstille de ønskede farmakodynamiske og farmakokinetiske profiler 27 , 28 , 29 . Mer spennende, oppstår bioaktiviteten til disse nye nanoteknikkene fra deres inneboende egenskaper, som kan skreddersys forSpesifikke medisinske applikasjoner, i stedet for bare å virke som et transportmiddel for et terapeutisk middel. For eksempel ble en HDD-lignende nanopartikkel med høy tetthet utformet for å hemme TLR4-signalering ved å fjerne TLR4-liganden LPS 23 . I tillegg har vi utviklet et peptid-gull nanopartikkel-hybridsystem, der de dekorerte peptidene kan endre overflateegenskapene til gullnanopartiklene, og tillate dem å ha ulike bioaktiviteter 30 , 31 , 32 , 33 . Dette gjør dem til en spesiell klasse av narkotika (eller "nanoteknologi") som neste generasjons nano-terapeutikk.

I denne protokollen presenterer vi en tilnærming til å identifisere en ny klasse av peptid-gull nanopartikler (peptid-GNP) hybrider som potensielt kan hemme flere TLR signalveier i fagocytiske immunceller 32 , 33 . Tilnærmingen er basert på kommersielt tilgjengelige THP-1 reportercellelinjer. Reportercellene består av to stabile, inducerbare reporterkonstruksjoner: en bærer et sekretert embryonalt alkalisk fosfatase-gen (SEAP) under kontroll av en promotor som er inducerbar ved transkripsjonsfaktorene NF-KB og aktivatorprotein 1 (AP-1); Den andre inneholder et utskilt luciferase-reportergen under kontroll av promotorer som er inducerbare av interferon regulatoriske faktorer (IRFs). Ved TLR-stimulering fører signaltransduksjonen til aktiveringen av NF-KB / AP-1 og / eller IRFer, som slår på reportergenene til hemmelig SEAP og / eller luciferase; Slike hendelser kan lett oppdages ved hjelp av deres tilsvarende substratreagenser med et spektrofotometer eller luminometer. Ved å bruke denne tilnærmingen til å skjerme vårt tidligere etablerte bibliotek av peptid-GNP-hybrider, identifiserte vi blykandidater som potensielt kan hemme TLR4-signalveier. Den hemmende aktivitet av blypeptid-BNP-hybrider ble deretter validert ved hjelp av en annen biokjemisk tilnærming til immunoblotting, og evaluert på andre TLR-veier. Denne tilnærmingen tillater rask og effektiv screening av nye agenter som retter seg mot TLR-signalveier.

Protocol

1. Fremstilling av cellekulturmedier og reagenser

  1. Forbered det komplette cellekulturmediet R10 ved å tilsette kosttilskuddene av 10% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin og 1 mM natriumpyruvat i RPMI-1640-mediumet.
    1. Forbered utvalgskulturmediet R10-Z ved å tilsette antibiotika Zeocin (200 μg / ml) til R10 for å opprettholde ekspresjonen av SEAP under kontroll av NF-KB / AP-1-aktivering. For å velge for celler som uttrykker både SEAP- og luciferase-reportergener, tilsett både Zeocin (100 μg / mL) og Blasticidin (10 μg / mL) til R10 (som R10-ZB).
  2. Klargjør SEAP-substratløsningen ved å oppløse en pose av substratpulveret ( f.eks. QUANTI-Blue) i 100 ml ultraturt, endotoksinfritt vann i en ren 125 ml glassflaske.
    1. Vask løsningen forsiktig og inkuber den ved 37 ° C i 1 time for å sikre fullstendig oppløsning av substrater.
    2. <Li> Filtrer løsningen med en 0,2 μm membran for å sikre steriliteten (valgfritt), og oppbevar den ved 4 ° C opptil 2 uker før bruk.
  3. Klargjør luciferase-substratoppløsningen ved å oppløse en pose av substratpulveret ( f.eks . QUANTI-Luc) i 25 ml ultrapure, endotoxinfritt vann i et sterilt 50 ml sentrifugerør.
    1. Etter oppløsningen av pulveret, bruk løsningen umiddelbart. Alternativt kan oppløsningen oppbevares ved 4 ° C (opptil en uke) eller ved -20 ° C (opp til en måned) før bruk.
      FORSIKTIG: Begge substratløsninger er lysfølsomme, og bør unngå lys eksponering når det er mulig. Flere fryse-tine sykluser av løsningen kan forårsake ustabilitet av substratet og forkorte holdbarheten.
  4. Forbered stamløsning av phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA) i molekylært dimetylsulfoksid (DMSO) for å ha en konsentrasjon på 500 μg / ml. Lag alikvoter av stamløsningen (10 μl i et 500 μl rør) og lagre dem ved -20 ° C.
  5. Lag LPS (E-coli K12) stamløsning i sterilt, endotoxinfritt vann ved en konsentrasjon på 5 mg / ml, og lag alikvoter for langvarig lagring ved -20 ° C. Klargjør en fungerende LPS-løsning ved å fortynne lager LPS i fosfatbuffert saltvann (PBS) ved en konsentrasjon på 100 μg / ml og lagre ved -20 ° C før bruk.
    FORSIKTIG: Reagenspreparatet for kulturbruk skal utføres i et biosikkerhetsskap, og alle beholderene skal steriliseres før bruk. Gjentatte fryse-tine sykluser av PMA og LPS løsninger bør unngås.

2. Kultur av THP-1 reportercell-avledede makrofager

  1. Bruk to THP-1 reportercellelinjer: THP-1-XBlue og THP-1-Dual-celler. Den førstnevnte har et SEAP-reportergen kontrollert av NF-KB / AP-1, og sistnevnte har et dobbelt reportergen-system, det samme SEAP-reportergen og et IRF-kontrollert luciferasegen. DeIr kulturprosedyrer er identiske med unntak av utvalgskulturmediene.
    1. Tynn en arbeidscellestamme (~ 5 x 10 6 celler) i 10 ml R10-medium, spinn ned cellene ved 300 xg i 5 minutter. Resuspender celler i 10 ml R10 medium, og overfør dem til en T75-dyrkningskolbe. Bytt kulturmediet hver 2-3 dager til cellene når en tetthet på 1 x 10 6 celler / ml.
    2. Når cellevekst når sin kapasitet, til passasje celler redusere celletettheten til i området fra 2-5 x 10 5 celler / ml, slik at cellene kan fortsette å vokse.
    3. Etter minst 1 passasje, begynn å dyrke cellene i utvalgskulturmediet: R10-Z for THP-1-XBlue og R10-ZB for THP-1-Dual. Etter dyrking av cellene med utvalgskulturmedium i minst 1 passasje er celler klare for forsøket.
      FORSIKTIG: Cell overgrowing kan føre til signifikant celledød; Celleevnen skal opprettholde> 98%. Hold oversikt over passasjenummeret som cellenJeg kan oppføre seg annerledes etter mange passasjer (> 20 passasjer).
      MERK: Cell culture flasker kan gjenbrukes flere ganger for å spare kostnader; Denne praksisen kan imidlertid øke risikoen for generell forurensning og krysskontaminering blant forskjellige flasker (hvis man behandler forskjellige cellelinjer samtidig). Under medieutveksling og cellepassasje settes sentrifugeringen til 300 xg i 5 minutter.
  2. For å utføre reportercelleanalyse, frøceller inn i en 96-brønn flatbunnscellekulturplate og skille dem i makrofager. Fremgangsmåten er beskrevet i det følgende.
    1. Overfør cellene fra kolben til et sentrifugerør, spinne ned cellene ved 300 xg i 5 minutter, og resuspender dem i R10 medium ved en konsentrasjon på 1 x 10 6 celler / ml. Tilsett alikvoter av PMA-oppløsningen i cellesuspensjonene med en sluttkonsentrasjon på 50 ng / ml.
    2. Overfør 100 μL av cellesuspensjonene i hver brønn av 96-viLl platen bruker en flerkanalspipett. Inkuber platen ved 37 ° C (i en cellekultur-inkubator) i 24 timer.
    3. Etter inkubering, fjern kultursmediet forsiktig med en vakuumsuger (eller med en flerkanalspipett) og vask forsiktig cellene med PBS (100 μl / brønn) to ganger; Tilsett 100 μL frisk R10 medium i hver brønn. Rest cellene i 2 dager i en inkubator før du utfører reporter-analysen.
      FORSIKTIG: Hviletrinnet er svært viktig for at cellene skal roe seg ned etter PMA-stimulering til sin normale stille status. Dette kan signifikant redusere bakgrunnssignaler fra reportergenene under ustimulerte forhold.
      MERK: Etter 24 stimulering med PMA, blir celler differensiert til makrofaglignende fenotype, med karakteristikk for celleadhesjon i bunnen av brønnen, og et morfologisk trekk ved pseudopodi.

3. Screening for potensielle TLR4 nano-inhibitorer ved hjelp av reporterceller MERK: Siden TLR4-signalering benytter både MyD88-avhengige og TRIF-avhengige baner, blir den valgt som det primære målet for å omfatte et bredt spekter av TLR-signalveier. THP-1-XBlue-reporterceller brukes til å undersøke NF-KB / AP-1-aktiveringen, mens THP-1-Dual-celler er til IRF-aktivering fra TRIF-avhengig signaltransduksjon.

  1. Identifiser optimal LPS dose ved å generere en dose-respons kurve før screening.
    1. Fortynn den arbeidende LPS-løsningen til en endelig konsentrasjon på 0,01 - 100 ng / ml i R10 medium (fortynn i log10 skala). Sett opp platens design og gjør fortynning i en 96-brønn rundbunnsplattform. Pass på at hver brønn har minst 110 μL løsning etter fortynning.
    2. Fjern forsiktig kulturmediet fra den cellepuddeplaten (fra 2.2.3) ved hjelp av en vakuumsuger.
    3. Overfør det LPS-holdige R10-mediumet som er fremstilt i fortynningsplaten (3.1.1) iNto kulturplaten i henhold til utformingen av prøvene. Inkuber platen ved 37 ° C (i en cellekultur-inkubator) i 24 timer.
    4. På 24 timer, overfør forsiktig supernatantene (80 μL / brønn) til en ny 96-brønn rundbunnplate. Utfør den kolorimetriske ogleller luciferase luminescensanalysen på disse løsningene umiddelbart eller lagre dem ved 4 ° C (flere timer) eller -20 ° C (dager) før analyseversjonen.
      MERK: Utformingen av plateoppsettet skal være enkel og klar for eksperiment og dataanalyse. For hver tilstand bør 2-4 replikater vurderes. Inkluder alltid en negativ kontrollgruppe (LPS null). Det anbefales at du bruker THP-1-XBlue-celler til aktivering av NF-KB / AP-1 da de to cellene har en relativt høy bakgrunn for aktivering av NF-KB / AP-1 etter å ha blitt differensiert til makrofager. Det er imidlertid mulig å bruke Dual-celler for rapportering av både NF-KB / AP-1 og IRF-aktivering.
  2. Utvikle fargenImetrisk analyse for aktiveringen av NF-KB / AP-1 og luciferase luminescensanalysen for IRF-aktivering.
    1. For å vurdere NF-KB / AP-1-aktiveringen, overfør 20 μL supernatant av hver prøve til en ny 96-brønn flatbunns kulturplate; Og tilsett 180 μL forvarmet SEAP-substratløsning i hver brønn. Inkuber platen ved 37 ° C i 1 - 2 timer for å tillate fargeutviklingen (rosa til mørk blå). Samle absorpsjonen ved 655 nm på en tallerkenleser.
      FORSIKTIG: Inkubasjonstiden kan varieres basert på fargeutviklingen (30 min opp til inkubasjon over natten). Det anbefales å vente til den optiske tettheten (OD) av den mørkeste fargen når over 1, samtidig som fargenes utvikling (OD> 3) unngås.
    2. For analysen av IRF-aktivering, overfør 10 μl supernatant av hver prøve til en 96-brønn, klar flatbunns-hvitplate. Tilsett luciferase-oppløsningen (50 μL) og samle luminescensen w umiddelbartEll ved godt.
      MERK: Det anbefales at du bruker en luminescensplatteleser med en automatisk injeksjonsfunksjon for å sikre konsistensen i luminescensavlesningen fra godt til godt og fra plate til plate. Hvis substratløsningene injiseres manuelt, må du sørge for en konsekvent inkubasjonstid og leseoppsett for hver brønn.
  3. Utfør screeningsanalysen på ulike peptid-GNP-hybrider med 10 ng / ml LPS-stimulering (basert på 3.1). Følg den samme prosedyren i 3.2 for reporteranalysutviklingen.
    1. Konsentrere peptid-BNP hybrider til 200 nM i R10 medium ved hjelp av sentrifugeringsmetoden. Sentrifuger 20 volumer av hybridoppløsningen (10 nM) ved 18 000 xg i 30 minutter, og forsiktig kasserer supernatanter. Samle hybriderne (i bunnen av røret) i et rør, vask dem med PBS to ganger, og resus suspender hybriderne i ett volum av R10-mediet.
    2. Bland like mengder av de konsentrerte hybrider ogLPS (20 ng / mL) inneholdende R10 medium for å ha en sluttkonsentrasjon av hybrider og LPS til henholdsvis 100 nM og 10 ng / mL.
    3. Fjern kulturmediet fra den dyrkede platen (2.2.3) og tilsett 100 μl av den blandede løsningen i hver brønn (3 replikater for hver tilstand); Inkludere en negativ kontroll (kun medium) og en LPS-kontroll (10 ng / mL LPS uten hybrider).
    4. Etter 24 timer inkubering ved 37 ° C, overfør mediet av hver brønn i et rør og sentrifuger rørene ved 18 000 xg, 4 ° C i 30 minutter. Samle supernatanter (50-80 μL / tube) i en 96-brønn rundbunnplate og utfør reporterassayet som beskrevet i 3.2.
      FORSIKTIG: Når du fjerner supernatanter etter sentrifugering, ikke agitere hybrider i bunnen av røret.
      MERK: Sentrifugeringen i trinn 3.3.4 er svært viktig for å fjerne de ikke-internaliserte nanopartikkelhybrider fra kulturmediet, og kan unngå forstyrrelser av hybrider med koLorimetrisk / luminescensavlesning. Dette skyldes at gull nanopartikler kan absorbere brede bølgelengder av lys avhengig av størrelse og agglomerering.

4. Validere den hemmelige effekten av potensielle kandidater

MERK: For å bekrefte den hemmende effekten av de potensielle kandidatene fra screeningen, benyttes to tilnærminger. Den ene er å undersøke dosisresponsene av stimulantene (LPS) ved en fast hybridkonsentrasjon (eller omvendt); Den andre er å se direkte på inhiberingen på NF-KB / AP-1 og IRF3 signaler via immunoblotting.

  1. I tilnærming 1 utfører reporterassayet med 100 nM av blyhybriderne og to LPS-konsentrasjoner ved 1 ng / ml og 10 ng / ml ved å følge de samme prosedyrene beskrevet i 3.3. Inkluder en inaktiv hybrid (basert på screeningsresultater) som en hybridkontroll for sammenligning.
  2. For den immunoblottende tilnærmingen, følg standard eXperimental prosedyrer.
    1. Kultur THP-1 celler i R10 medium, frø av cellene i en 12-brønns kulturplate (2 x 10 6 celler / brønn), og skiller dem til makrofager ved behandling av cellene med 50 ng / ml PMA i 24 timer, fulgt av hvile I 2 dager.
    2. Etter celledifferensiering, stimulere celler med 10 ng / ml LPS med / uten hybrider (100 nM) over tid (opptil 4 timer). På forskjellige tidspunkter (0, 5, 15, 30, 60, 120 og 240 min), fremstille cellelysater for immunoblotting. Inkluder en inaktiv hybrid som en kontroll.
    3. Sonde signalene til IκBa, fosforylert p65 og fosforylert IRF3 for å undersøke den hemmende effekten av blyhybrider på aktiveringen av NF-KB og IRF3. Probe β-actin og totale IRF3-signaler som interne kontroller.
      MERK: Signaltransduksjonen skjer ofte mye raskere (om noen timer), da uttrykket av reporterenzymer SEAP og luciferase (24 timer). Det anbefales å også perforereMa levedyktighetsanalyse av de testede hybrider ved 24 timer som en annen valideringsmetode.

5. Evaluering av TLR-spesifisiteten

MERK: For å undersøke TLR-spesifisiteten til blypeptid-GNP-hybriden, testes andre TLR-signalveier, inkludert TLR2, TLR3 og TLR5. TLR7, 8 og 9 er utelukket fordi THP-1-avledede makrofager ikke reagerer godt på stimuleringen av disse TLRene på grunn av mangelen på TLR7, 8 og 9-ekspresjon i makrofager 34 .

  1. Test forskjellige konsentrasjoner (1 ng / mL til 25 μg / mL) av ligander spesifikt for TLR2 (Pam3CSK4), TLR3 (poly I: C) og TLR5 (flagellin) på begge reporterceller avledede makrofager for å oppnå optimal konsentrasjon etter det samme Prosedyren i 3.1 og 3.2.
  2. Behandle cellene med blandingene av blyhybriden (100 nM) og hver TLR-ligand ved konsentrasjonen oppnådd fra 5.1 for å evaluere den hemmende spesifisitet av blyhYbrid i henhold til den eksperimentelle prosedyren beskrevet i 3.3. Inkluder den inaktive hybrid som en kontroll for sammenligning.

Representative Results

Den samlede eksperimentelle tilnærmingen er illustrert i figur 1 . De to THP-1-reportercellelinjer, THP-1-XBlue og THP-1-Dual, brukes til å raskt skjerme TLR-responsene ved å undersøke aktiveringen av henholdsvis NF-KB / AP-1 og IRF. Aktivering av NF-KB / AP-1 kan detekteres ved hjelp av SEAP-kolorimetrisk analyse, mens IRF-aktivering overvåkes ved luciferase luminescens. De monocytiske THP-1-cellene kan lett avledes i makrofager for å skjerme nanodevices for deres immunmodulerende aktivitet på de medfødte fagocytiske immunceller. Med reportersystemet kan screeningen gjennomføres på høy måte. En slik tilnærming er allsidig til oppdagelsen av nye immunoterapeutiske midler, spesielt rettet mot medfødt immun signalering, som TLR-signalering.

Skjermprosedyren og representative resultater vises i figur 2A Og 2B ). Forskjellige konsentrasjoner av TLR ligander (TLR4 som et eksempel) blir først testet for å oppnå optimal konsentrasjon for den faktiske screening av peptid-GNP hybrider. TLR4-stimuleringen av LPS resulterte i aktiveringen av NF-KB / AP-1 og produksjonen av SEAP. Den frigjorte SEAP konverterte substratet og endret sin fotofysiske egenskap, som kunne overvåkes ved å skifte i lysabsorpsjonen, noe som førte til løsningsfargeendringen ( figur 2C ). En slik forandring er proporsjonal med mengden av SEAP frigjort ved stimulering, og kan kvantifiseres ved å måle absorbansen ved 655 nm på et spektrofotometer ( figur 2D ). På samme måte førte aktiveringen av IRFer (utløst av LPS) til uttrykket av luciferaserE, som katalyserte substratet for å produsere luminescens ( figur 2E ). Basert på disse dose responsene ble en optimal konsentrasjon av LPS (10 ng / ml) brukt til å skjerme et lite tidligere etablert bibliotek av peptid-GNP hybrider ( Tabell 1 ). Fremstillingen av hybrider og deres fysisk-kjemiske egenskaper ble beskrevet i våre tidligere publikasjoner 30 , 31 , 32 . Fra screeningen ble en gruppe hybrider (P12 og dets derivater) identifisert for deres potente hemmende aktivitet på både NF-KB / AP-1 og IRF-aktivering utløst av LPS ( Figur 2F ); Interessant, hybrid P13, bare litt forskjellig fra P12 i peptidbeleggene, hadde ingen inhibitorisk aktivitet, som kunne betjenes som en hybridkontroll for sammenligning. P13-derivatene viste forskjellig grad av mild hemmende aktivitet, avhengig av denR dekorert peptid på overflaten.

Etter å ha identifisert bly hybrid er det viktig å validere den hemmende aktiviteten. Inhiberingen ble først bekreftet ved å undersøke hybridforholdene til hybridene til LPS for å utelukke potensielle falske positive resultater på grunn av tekniske artefakter. Etter hvert som konsentrasjonen av LPS økte, ble den hemmende effekten av hybrid (ved en fast konsentrasjon) redusert som forventet ( figur 3A Og 3B ). For ytterligere å sikre at den observerte inhiberingen fra reporteranalysene faktisk var et resultat av nedregulering av NF-KB og IRF-signalering med bly-hybriden, ble immunoblottingen utført for å direkte vurdere proteinsignaltransduksjonen over tid. Aktiveringen av NF-KB og IRF3 ble undersøkt ved å undersøke fosforyleringen av NF-KB subunit p65 og nedbrytningen av NF-KB inhibitoren IκBa og fosforYlation av henholdsvis IRF3. Som vist i figur 3C kunne bly hybrid P12 redusere p65 fosforylering, hemme IκBa nedbrytning og forsinket IRF3 fosforylering, mens den inaktive hybrid P13 ikke kunne (data ikke vist). Alle disse resultatene bekreftet at den identifiserte blyhybriden var i stand til å hemme LPS-mediert TLR4-signalering ved å regulere både NF-KB og IRF3-aktivering.

I tillegg til TLR4-signalering ble den inhibitoriske aktiviteten til bly-hybriden ytterligere evaluert på andre TLR-veier, inkludert TLR2, TLR3 og TLR5 for å adressere TLR-spesifisiteten. Som vist i figur 4 var bly-hybrid P12 i stand til å redusere TLR2- og TLR5-mediert NF-KB / AP-1-signalering, så vel som TLR3-mediert IRF-aktivering; Igjen viste den inaktive hybrid P13 ikke noen hemmende aktivitet. Disse resultatene antydet at den identifiserte blyhybriden har en sterk inhibito Ry aktivitet på flere TLR baner.

Figur 1
Figur 1: Samlet eksperimentell tilnærming til høy gjennomstrømnings screening av TLR-hemmere ved hjelp av reportercelleanalysen. To reportercellelinjer brukes: THP-1-XBlue og THP-1-Dual. Den førstnevnte har et SEAP-reportergen under kontroll av NF-KB / AP-1-aktivering, mens Dual-systemet har et ekstra luciferase-reportergen under kontroll av IRFs-aktivering. Disse cellene kan lett differensieres til makrofager for høy gjennomstrømnings screening av immune modulerende nanopartikler på medfødt immunsystem. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Ftp_upload / 56075 / 56075fig2.jpg "/>
Figur 2: Høy gjennomsøking av nano-hemmere på TLR4-signalering.
( A ) Et system av eksperimentelle prosedyrer. ( B ) Et optisk mikroskopisk bilde av differensierte makrofager (200x forstørrelse). ( C ) Et representativt bilde av løsningsfargen endres fra SEAP-reporter-analysen; Fargen på substratløsningen ble til lilla eller mørkblå (fra originalrosa), avhengig av SEAP-uttrykket i kulturmediet. ( D ) Kvantitativ analyse av SEAP-substratabsorpsjonen ved 655 nm som respons på LPS-stimulering. ( E ) Luciferase luminescensen fra IRF-reportersystemet i forhold til LPS-stimulering. ( F ) High-throughput-screening som identifiserer blypeptid-GNP-hybrid P12 og dets derivater i å inhibere både NF-KB / AP-1 og IRF-veier for TLR4-signalering; Hybridkonsentrasjonen = 100 nM; LPSKonsentrasjon = 10 ng / mL; Linjen representerer gjennomsnittlig ± standardavvik; N = 2. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3
Figur 3: Validering av den hemmende aktiviteten til blyhybriden. Bekreftelse av den hemmende effekten av bly hybrid med forskjellige konsentrasjoner av LPS på både ( A ) SEAP og ( B ) luciferase reporter-systemer. ( C ) Bekreftelse av inhiberingen av bly hybrid på NF-KB og IRF3 signalering via immunoblotting. Den inaktive hybrid P13 ble anvendt som en hybridkontroll for sammenligning. Hybridkonsentrasjonen = 100 nM; LPS-konsentrasjonen = 10 ng / ml; Linjen representerer gjennomsnittlig ± standardavvik; N = 3; * Og *** betegner p <0,05 aNd p <0,001, ved hjelp av enveis ANOVA-analyse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4
Figur 4: Inhibitorisk effekt av bly hybrid på andre TLR signalveier.
Inhiberingen av NF-KB / AP-1 ved bly-hybrid etter TLR2-stimuleringen (Pam3CSK4 = 1 ng / ml) ( A ) og TL5-stimulering (flagellin = 100 ng / ml) ( B ). ( C ) Reduksjonen av både NF-KB / AP-1 og IRF-signalering med bly-hybrid etter TLR3-stimulering (poly I: C = 25 μg / ml). Hybridkonsentrasjonen = 100 nM; Linjen representerer gjennomsnittlig ± standardavvik; N = 3; *, ** og *** angir henholdsvis p <0,05, p <0,01 og p <0,001Enveis ANOVA analyse; Ns: ikke-signifikant. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1
Tabell 1: Et lite bibliotek med peptid-BNP-hybrider etablert i våre tidlige studier.
Hybriderne er laget av en gull nanopartikkelkjerne (~ 13 nm i diameter) og forskjellige heksapeptidbelegg på overflaten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Siden TLR er involvert i patogenesen av mange inflammatoriske sykdommer, har de oppstått som terapeutiske mål for modulering av immunresponser og inflammatoriske tilstander. Den kliniske utviklingen av terapeutiske midler for å hemme TLR-signalveier har imidlertid hatt begrenset suksess til dags dato. Det antimalariale legemiddelhydroksyklorokinet som hemmer TLR7 og TLR9 er i klinisk bruk 35 , 36 . Tilsvarende har bare et begrenset antall forbindelser utviklet seg til kliniske studier, inkludert eritoran, en TLR4-antagonist, som viste sterke hemmevirkninger på LPS-medierte inflammatoriske responser i prekliniske studier 37 , 38 , viste positive resultater i kliniske fase I / II kliniske studier Forsøk 39 , 40 , 41 , men i siste instans fasen III-forsøket mislyktes i å redusere dødelighetenAv pasienter med alvorlig sepsis 42 . Denne feilen har mange mulige årsaker, det ene er at sepsisassosierte inflammatoriske responser ofte utløses gjennom flere TLR-veier, og dermed kan blokkering av bare TLR4 ikke være tilstrekkelig til å redusere den overveldende betennelsen. Derfor kan utvikling av nye, potente poly-TLR-hemmere overvinne slike kliniske utfordringer og bli neste generasjons antiinflammatoriske terapeutiske midler. Skjermstrategien og protokollen som beskrives her, forventes å fungere som et effektivt eksperimentelt verktøy ved å studere TLR-signalering, og enda viktigere som en narkotikaoppdagingsplattform for å akselerere søket etter neste generasjons TLR-hemmere.

Denne screening-tilnærmingen gir flere fordeler ved å søke etter nye TLR-hemmere. For det første kan screeningen oppnås på høy måte gjennom bruk av reportercellesystemene som er raske, følsomme og kvantitative. For det andre, med begge reportercellelinjer,Screeningen kan gjøres for å dekke et bredt spekter av TLR-signalkaskader, inkludert NF-KB / AP-1-stien og type I interferon-signalering (via IRF); Derfor er de ideelle for screening av flere TLR-veier. For det tredje er disse reportercellene genetisk konstruert fra den humane monocytiske THP-1-cellelinjen, som er et godt modellsystem for å studere tiltak rettet mot den medfødte immunresponsen. For det fjerde er cellelinjen lett opprettholdt, og spesielt kan den differensieres til makrofager; Og siden makrofager spiller en nøkkelrolle i mange sykdomsassosierte inflammatoriske tilstander, tjener de som et ideelt mål for screening av immunoterapeutika rettet mot TLR-signalering. For det femte har monocytter og makrofager en imponerende fagocytisk kapasitet, noe som muliggjør høy opptak av nanopartiklene, noe som gjør dem spesielt egnet til å studere terapeutiske midler for nanoskala. Videre kan denne screeningsprotokollen brukes for å søke etter ikke bare den nano-baserte therApeutiske midler, men også andre typer bioaktive forbindelser.

Selv om denne skjermplattformen er svært allsidig og robust, må man være forsiktig med å unngå falsk oppdagelse. Screeningen er primært basert på reporterassayet, som er avhengig av ekspresjonen av reportergenet under kontroll av spesifikke signaleringshendelser. Ideelt sett er reportergenekspresjonen (SEAP og luciferase) proporsjonal med intensiteten til signaltransduksjonsveien av interesse, og virkningen av medikamentkandidatene reflekteres i analysebestemmelsene. Imidlertid kan i virkeligheten eventuelle biologiske hendelser oppstrøms for reporter-genuttrykket påvirke resultatet, noe som noen ganger fører til en falsk positiv oppdagelse. For eksempel kan lavt uttrykk for SEAP skyldes inhibering av proteinsynteseprosessen i stedet for fra nedreguleringen av TLR-signalering 43 . For å unngå en slik falsk oppdagelse, identifiserer den hemmende aktivitetenD kandidater bør alltid valideres, og gullstandardmetoden er å se direkte på signalveiene via immunoblotting. Et annet viktig aspekt ved screening av nanopartikkelbaserte terapeutiske midler er overflateegenskapene til disse nanodevices. Basert på overflatemodifikasjonene, kan nanodevices ha forskjellig biologisk aktivitet. Imidlertid kan de også ha ikke-spesifikk bindingsevne til visse biomolekyler. I tilfelle ikke-spesifikk binding til SEAP eller luciferase, kan den katalytiske aktiviteten til substratene kompromitteres av disse nanodevices, hvilket fører til potensiell falsk oppdagelse. Inkludert ekstra kontrollgrupper ( f.eks . Bare nanodevice) i screeningen reduserer risikoen for falsk oppdagelse. Sist men ikke minst, må cytotoksisiteten til de identifiserte blykandidatene undersøkes for å utelukke cytotoksisitet som en medvirkende faktor til falsk oppdagelse. Dette kan gjøres samtidig under screeningsprosessen ved bruk av en standard levedyktighetsanalyse ( f.eks .MTS eller MTT), eller i et eget eksperiment.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gjerne anerkjenne støtten fra programmet for professor i spesialavtale (Eastern Scholar) ved Shanghai Institutions of Higher Learning (HY), startfondet fra Shanghai First People's Hospital (HY), Gaofeng Clinical Medicine Grant-støtte fra Shanghai Jiaotong University School of Medicine (HY), og finansieringen fra Crohns og Colitis Foundation of Canada (CCFC) (SET og HY).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
THP-1-XBlue reporter cell InvivoGen thpx-sp keep cell culture passage under 20
THP-1-Dual repoter cell InvivoGen thpd-nfis keep cell culture passage under 20
RPMI-1640 (no L-glutamine) GE Health Care SH30096.02 Warm up to 37 °C before use; add supplements to make a complete medium R10
Fetal bovine serum (qualified) Thermo Fisher Scientific 12484028 Heat inactivated; 10% in RPMI-1640
L-glutamine Thermo Fisher Scientific SH30034.02 2 mM in the complete medium R10
Sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific 11360-070 1 mM in the complete medium R10
Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium, magnesium GE Health Care SH30028.02 Use for cell washing and reagent preparation
QUANTI-Blue InvivoGen rep-qb1 SEAP substrate
QUANTI-Luc InvivoGen rep-qlc2 Luciferase substrate
Zeocin InvivoGen ant-zn-1 Selection antibiotics for reporter cells
Blasticidin InvivoGen anti-bl-1 Selection antibiotics for reporter cells
Dimethyl sulfoxide (DMSO) for molecular biology Sigmal-Aldrich D8418-100ML Use for reagent preparation
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) for molecular biology Sigmal-Aldrich P1585-1MG Use for cell differentiation
Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli K12 InvivoGen tlrl-eklps TLR4 ligand
Pam3CSK4 InvivoGen tlrl-pms TLR2/1 ligand
Poly (I:C) HMW InvivoGen tlrl-pic TLR3 ligand
Flagellin from S. Typhimurium (FLA-ST), ultrapure InvivoGen tlrl-epstfla TLR5 ligand
SpectraMax Plus 384 microplate reader Molecular Devices N/A Read colorimetric assay
Infinite M200 Pro multimode microplate reader with injectors Tecan N/A Read luminiscience
Microfuge 22R centrifuge Beckman Coulter N/A Temperature controlled micro-centrifugator (up to 18,000 g)
Allegra X-15R centrifuge Beckman Coulter N/A Temperature controlled general purpose centrifugator (for cell culture use)
Costar assay plate, 96-well white with clear flat bottom, tissue culure treated Corning Costar 3903 Used for luminiscence assay

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Akira, S., Takeda, K. Toll-like receptor signalling. Nat Rev Immunol. 4, (7), 499-511 (2004).
  2. Beutler, B. A. TLRs and innate immunity. Blood. 113, (7), 1399-1407 (2009).
  3. Gay, N. J., Symmons, M. F., Gangloff, M., Bryant, C. E. Assembly and localization of Toll-like receptor signalling complexes. Nat Rev Immunol. 14, (8), 546-558 (2014).
  4. Palm, N. W., Medzhitov, R. Pattern recognition receptors and control of adaptive immunity. Immunol Rev. 227, (1), 221-233 (2009).
  5. Kawasaki, T., Kawai, T. Toll-like receptor signaling pathways. Front Immunol. 5, 461 (2014).
  6. Uematsu, S., Akira, S. Toll-like receptors and Type I interferons. J Biol Chem. 282, (21), 15319-15323 (2007).
  7. Maglione, P. J., Simchoni, N., Cunningham-Rundles, C. Toll-like receptor signaling in primary immune deficiencies. Ann N Y Acad Sci. 1356, 1-21 (2015).
  8. Drexler, S. K., Foxwell, B. M. The role of toll-like receptors in chronic inflammation. Int J Biochem Cell Biol. 42, (4), 506-518 (2010).
  9. O'Neill, L. A., Bryant, C. E., Doyle, S. L. Therapeutic targeting of Toll-like receptors for infectious and inflammatory diseases and cancer. Pharmacol Rev. 61, (2), 177-197 (2009).
  10. Harter, L., Mica, L., Stocker, R., Trentz, O., Keel, M. Increased expression of toll-like receptor-2 and -4 on leukocytes from patients with sepsis. Shock. 22, (5), 403-409 (2004).
  11. Roger, T., et al. Protection from lethal gram-negative bacterial sepsis by targeting Toll-like receptor 4. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (7), 2348-2352 (2009).
  12. Tsujimoto, H., et al. Role of Toll-like receptors in the development of sepsis. Shock. 29, (3), 315-321 (2008).
  13. Blohmke, C. J., et al. TLR5 as an anti-inflammatory target and modifier gene in cystic fibrosis. J Immunol. 185, (12), 7731-7738 (2010).
  14. Hartl, D., et al. Innate immunity in cystic fibrosis lung disease. J Cyst Fibros. 11, (5), 363-382 (2012).
  15. Celhar, T., Fairhurst, A. M. Toll-like receptors in systemic lupus erythematosus: potential for personalized treatment. Front Pharmacol. 5, 265 (2014).
  16. Chen, J. Q., Szodoray, P., Zeher, M. Toll-Like Receptor Pathways in Autoimmune Diseases. Clin Rev Allergy Immunol. 50, (1), 1-17 (2016).
  17. Hennessy, E. J., Parker, A. E., O'Neill, L. A. Targeting Toll-like receptors: emerging therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9, (4), 293-307 (2010).
  18. Hedayat, M., Netea, M. G., Rezaei, N. Targeting of Toll-like receptors: a decade of progress in combating infectious diseases. Lancet Infect Dis. 11, (9), 702-712 (2011).
  19. Huang, L., et al. Engineering DNA nanoparticles as immunomodulatory reagents that activate regulatory T cells. J Immunol. 188, (10), 4913-4920 (2012).
  20. Lemos, H., et al. Activation of the STING adaptor attenuates experimental autoimmune encephalitis. J Immunol. 192, (12), 5571-5578 (2014).
  21. Hess, K. L., Andorko, J. I., Tostanoski, L. H., Jewell, C. M. Polyplexes assembled from self-peptides and regulatory nucleic acids blunt toll-like receptor signaling to combat autoimmunity. Biomaterials. 118, 51-62 (2017).
  22. Tostanoski, L. H., et al. Design of Polyelectrolyte Multilayers to Promote Immunological Tolerance. ACS Nano. (2016).
  23. Foit, L., Thaxton, C. S. Synthetic high-density lipoprotein-like nanoparticles potently inhibit cell signaling and production of inflammatory mediators induced by lipopolysaccharide binding Toll-like receptor 4. Biomaterials. 100, 67-75 (2016).
  24. He, C., Hu, Y., Yin, L., Tang, C., Yin, C. Effects of particle size and surface charge on cellular uptake and biodistribution of polymeric nanoparticles. Biomaterials. 31, (13), 3657-3666 (2010).
  25. Hirn, S., et al. Particle size-dependent and surface charge-dependent biodistribution of gold nanoparticles after intravenous administration. Eur J Pharm Biopharm. 77, (3), 407-416 (2011).
  26. Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery. Nat Biotechnol. 33, (9), 941-951 (2015).
  27. Arvizo, R. R., et al. Modulating pharmacokinetics, tumor uptake and biodistribution by engineered nanoparticles. PLoS One. 6, (9), e24374 (2011).
  28. Ernsting, M. J., Murakami, M., Roy, A., Li, S. D. Factors controlling the pharmacokinetics, biodistribution and intratumoral penetration of nanoparticles. J Control Release. 172, (3), 782-794 (2013).
  29. Lin, P. J., Tam, Y. K. Enhancing the pharmacokinetic/pharmacodynamic properties of therapeutic nucleotides using lipid nanoparticle systems. Future Med Chem. 7, (13), 1751-1769 (2015).
  30. Yang, H., Fung, S. Y., Liu, M. Programming the cellular uptake of physiologically stable peptide-gold nanoparticle hybrids with single amino acids. Angew Chem Int Ed Engl. 50, (41), 9643-9646 (2011).
  31. Yang, H., et al. Amino Acid Structure Determines the Immune Responses Generated by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. Particle & Particle Systems Characterization. 30, (12), 1039-1043 (2013).
  32. Yang, H., et al. Amino Acid-Dependent Attenuation of Toll-like Receptor Signaling by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. ACS Nano. 9, (7), 6774-6784 (2015).
  33. Yang, H., et al. Endosomal pH modulation by peptide-gold nanoparticle hybrids enables potent anti-inflammatory activity in phagocytic immune cells. Biomaterials. 111, 90-102 (2016).
  34. Ospelt, C., Gay, S. TLRs and chronic inflammation. Int J Biochem Cell Biol. 42, (4), 495-505 (2010).
  35. Kuznik, A., et al. Mechanism of endosomal TLR inhibition by antimalarial drugs and imidazoquinolines. J Immunol. 186, (8), 4794-4804 (2011).
  36. Lee, S. J., Silverman, E., Bargman, J. M. The role of antimalarial agents in the treatment of SLE and lupus nephritis. Nat Rev Nephrol. 7, (12), 718-729 (2011).
  37. Mullarkey, M., et al. Inhibition of endotoxin response by e5564, a novel Toll-like receptor 4-directed endotoxin antagonist. J Pharmacol Exp Ther. 304, (3), 1093-1102 (2003).
  38. Barochia, A., Solomon, S., Cui, X., Natanson, C., Eichacker, P. Q. Eritoran tetrasodium (E5564) treatment for sepsis: review of preclinical and clinical studies. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 7, (4), 479-494 (2011).
  39. Rossignol, D. P., et al. Safety, pharmacokinetics, pharmacodynamics, and plasma lipoprotein distribution of eritoran (E5564) during continuous intravenous infusion into healthy volunteers. Antimicrob Agents Chemother. 48, (9), 3233-3240 (2004).
  40. Rossignol, D. P., Wong, N., Noveck, R., Lynn, M. Continuous pharmacodynamic activity of eritoran tetrasodium, a TLR4 antagonist, during intermittent intravenous infusion into normal volunteers. Innate Immun. 14, (6), 383-394 (2008).
  41. Tidswell, M., et al. Phase 2 trial of eritoran tetrasodium (E5564), a toll-like receptor 4 antagonist, in patients with severe sepsis. Crit Care Med. 38, (1), 72-83 (2010).
  42. Opal, S. M., et al. Effect of eritoran, an antagonist of MD2-TLR4, on mortality in patients with severe sepsis: the ACCESS randomized trial. JAMA. 309, (11), 1154-1162 (2013).
  43. Fung, S. Y., et al. Unbiased screening of marine sponge extracts for anti-inflammatory agents combined with chemical genomics identifies girolline as an inhibitor of protein synthesis. ACS Chem Biol. 9, (1), 247-257 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics