Caractérisation fonctionnelle des carboxylestérases chez les mouches maison résistant aux insecticides, Musca Domestica

Biochemistry

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Summary

Nous présentons ici un protocole pour produire chambre carboxylestérase mouche protéines in vitro avec un système d’expression baculovirus médiée par cellule insectes et plus tard fonctionnellement caractériser leurs rôles en métabolisant perméthrine, ainsi, conférant aux pyréthrinoïdes résistance en procédant à base de cellules MTT dosage et in vitro études métaboliques.

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Feng, X., Liu, N. Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica. J. Vis. Exp. (138), e58106, doi:10.3791/58106 (2018).

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Abstract

Métabolisme médié par la carboxylestérase est censé jouer un rôle majeur dans la résistance aux insecticides chez les insectes divers. Plusieurs gènes de la carboxylestérase trouvées régulée dans la souche mouche résistant à la maison, tandis que leurs rôles en conférant la résistance aux insecticides restaient à explorer. Ici, nous avons conçu un protocole de caractérisation fonctionnelle des carboxylestérases. Trois expériences d’exemple sont présentés : (1) expression et l’isolement des protéines carboxylestérase grâce à un insecte médiée par les baculovirus Spodoptera frugiperda (Sf9) système d’expression cellulaire ; (2) un MTT à base de cellules (3-[4, 5-dimethykthiazol-2-yl] -2, 5-diphenyltetrazolium bromure) test de cytotoxicité pour mesurer la tolérance des cellules d’insectes à la perméthrine différents traitements ; et (3) in vitro études métaboliques d’explorer les capacités métaboliques des carboxylestérases vers la perméthrine. Le gène de la carboxylestérase MdαE7 a été cloné à partir d’une maison résistante voler souche ALHF et utilisé pour construire un baculovirus recombinant pour l’infection de cellules Sf9. La viabilité cellulaire contre perméthrine différents traitements ont été mesurée avec le test MTT. La tolérance des lymphocytes améliorés du groupe expérimental (cellules de baculovirus infectés MdαE7 recombinant) comparé à ceux des groupes témoins (cellules infectées de baculovirus recombinant CAT et cellules infectées de baculovirus recombinant GFP) de perméthrine traitements a suggéré les fonctionnalités de MdαE7 dans le métabolisme des insecticides, protégeant ainsi les cellules des dommages chimiques. En outre, carboxylestérase protéines étaient exprimées dans des cellules d’insecte Sf9 et isolés pour mener une étude métabolique in vitro . Nos résultats ont indiqué une significative in vitro l’efficacité métabolique de MdαE7 vers la perméthrine, directement indiquant l’implication des carboxylestérases en métabolisant les insecticides et conférant ainsi la résistance aux insecticides dans la maison d’oiseau.

Introduction

Résistance aux insecticides est actuellement un enjeu majeur du contrôle de la mouche de maison dans le monde1,2. Efforts pour déterminer que le mécanisme de résistance aux insecticides permet de mieux comprendre cette question et de fournir ainsi des stratégies novatrices pour efficacement prévenir ou limiter la propagation de la résistance développement3. Carboxylestérases, comme l’une des enzymes de détoxication importants, ont attiré beaucoup d’attention pour leur rôle dans la séquestration et métabolisant les insecticides chez divers insectes4,5,6. Notre étude précédente a identifié plusieurs carboxylestérases en mouches domestiques et leurs niveaux d’expression était non seulement constitutivement régulée dans la souche résistante de ALHF mais peut également être induite à la hausse des niveaux en réponse aux traitements de perméthrine7 . Toutefois, la caractérisation fonctionnelle de ces gènes carboxylestérase dans le métabolisme des insecticides reste à explorer.

Depuis le premier rapport au début des années 19808, un système d’expression de gènes étrangers baculovirus a été largement employé en raison de son efficacité de production riche en protéines et protéines eucaryotes traitement capacités9. Ce système binaire est composé de deux éléments essentiels : le baculovirus recombinant construit des gènes étrangers dans les cellules de l’hôte et l’expression à grande échelle des protéines intéressées par les cellules infectées par des baculovirus recombinant. Ces dernières décennies, le système d’expression baculovirus médié cellulaire a été largement utilisé pour produire des milliers de protéines recombinantes, allant des enzymes cytosoliques aux protéines membranaires chez insecte et10des cellules mammifères. Notre étude précédente a exprimé avec succès plusieurs enzymes CYP450 dans des cellules d’insecte Sf9 avec ce système11. Dans cette étude, nous avons construit un baculovirus recombinant carboxylestérase pour infecter des cellules d’insecte Sf9, explore la tolérance des lymphocytes de perméthrine différents traitements et à grande échelle exprimée carboxylestérase protéines in vitro pour fonctionnelle exploration. Au lieu d’enquêter sur des mélanges d’isozymes carboxylestérase multiples d’homogénats insectes tel qu’adopté par les précédentes études12,13, ce système d’expression baculovirus insectes cellulaire permet l’expression spécifique et isolement des protéines ciblées pour une meilleure caractérisation de leurs propriétés biochimiques et structurales.

Le test de base de sels de tétrazolium (MTT) est une méthode colorimétrique de haut débit développé et optimisé pour mesurer la viabilité des cellules. Cette analyse est basée sur le mécanisme que seulement les cellules vivantes sont capables de métaboliser le réactif MTT de couleur jaune à un précipité de formazan couleur violet foncé, qui peut être analysé par colorimétrie après dissous dans des solvants organiques14, 15. Plusieurs plus précis mais les méthodes fastidieuses, telles que le bleu Trypan exclusion et la thymidine titrage dosage16,17, ont été développés ces dernières années. Cependant, le test MTT basés sur les cellules est encore actuellement reconnu comme la méthode la plus rapide et plus facilement exploités pour détecter rapidement la viabilité cellulaire. Ici, nous utilisons le test MTT pour explorer la tolérance des lymphocytes contre des traitements insecticides. La tolérance accrue des cellules lorsqu’elles sont infectées par la carboxylestérase baculovirus recombinant fortement prend en charge les rôles métaboliques des carboxylestérases aux insecticides, qui suggère à son tour leur implication dans la résistance aux insecticides.

En outre, un essai in vitro métabolique avec a été également menée dans cette étude. Par rapport aux dosages carboxylestérase générales qui utilisent des substrats communs tels que α-naphtyl acétate (α-NA) et β-naphtyl acétate (β-NA) afin de tenir compte des activités hydrolytiques des carboxylestérases, l’étude métabolique in vitro est considéré comme un moyen précis de mesurer directement les activités des carboxylestérases vers insecticides18. Cette méthode a été utilisée avec succès dans divers insectes, pour caractériser plusieurs cytochrome P450s en liaison avec l’insecticide résistance11,19,20. Toutefois, cette méthode n’a pas encore été appliquée dans les études de la carboxylestérase. Avec la disponibilité de la carboxylestérase protéines produites par le système d’expression baculovirus-négociée, nous pouvons effectuer une étude métabolique in vitro des carboxylestérases vers permethrin, qui peut fournir plus de preuves solides de l’implication des carboxylestérases en conférant une résistance aux pyréthrinoïdes dans la maison d’oiseau.

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Protocol

1. l’expression et l’isolement des protéines cibles avec un système d’Expression Baculovirus insectes cellulaire

  1. Directionnellement clone amplicons émoussé-terminée de protéines cibles de mouches domestiques.
    1. Design des amorces PCR de la protéine fluorescente verte (GFP) et le gène de MdαE7 mouche de maison basée sur les séquences et les exigences particulières du vecteur choisi (tableau 1).
    2. Utilisez une ADN polymérase thermostable, relecture et amorces de l’étape 1.1.1 pour effectuer une réaction de PCR de 150 µL (30 µL de tampon de réaction, 3 µL des dNTPs 10 mM, 1,5 µL de l’ADN polymérase, 6 µL de maison modèle mouche ADN, 7,5 µL d’apprêt avant 7,5 µL d’apprêt inverse, avec de l’eau pour un volume final 150 µL). La chaleur de la réaction PCR à 98 ° C pendant 30 s, suivi par 35 cycles de 98 ° C pendant 10 s, 53 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 60 s, puis une extension finale à 72 ° C pendant 2 min).
      1. Exécuter un gel d’agarose à 1 % avec 150 µL de produit de PCR.
    3. Accise les fragments d’ADN cible de l’agarose de gel avec un scalpel tranchant et propre : bp 1317 pour MdαE7 et 858 bp pour GFP. Purifier l’ADN à l’aide disponible dans le commerce de gel extraction kit suivant le protocole du fabricant (Table des matières). Dissoudre l’ADN purifié dans 15 µL d’eau distillée.
    4. Exécuter un gel d’agarose à 1 % avec 1 µL d’ADN purifié pour vérifier l’intégrité. Utilisez un autre 1 µL d’ADN purifié pour mesurer les concentrations avec le spectrophotomètre.
  2. Construire un plasmide d’entrée pour les protéines cibles
    1. Mettre en place la réaction de clonage. Mix fraîchement purifié produits d’ADN de l’étape 1.1.3 et entrée disponible dans le commerce de vecteurs contenant attL-sites (Table des matières) dans un rapport molaire de 1:1 (0,5 à 2 µL du produit PCR frais à des concentrations de 70 à 200 ng/µL : 0,5 vecteur µL). Ajouter 1 µL de solution disponible dans le commerce du sel (1,2 M NaCl2 et 0,06 M MgCl2), puis ajouter de l’eau pour un volume final de 6 µL. Mélanger doucement et laisser incuber à température ambiante pendant 1 h.
    2. Transférer 4 µL du clonage des produits de la réaction à l’étape 1.2.1 dans 50 µL de chimiquement compétent e. coli cellules. Incuber sur glace pendant 30 min. choc thermique des cellules pendant 30 s dans un bain d’eau de 42 ° C sans agitation.
    3. Mettre le tuyau de retour dans la glace pour un autre 2 min. ajouter 250 µL de température ambiante moyenne d’O.S.C. (tryptone 2 % 0,5 % d’extrait de levure 10 mM NaCl ; 2,5 mM KCl ; 10 mM MgCl2; 10 mM MgSO4; 20 mM de glucose). Incuber à 37 ° C pendant 1 h avec secouant doucement.
    4. Répandre le 50-200 µL de la culture bactérienne à l’étape 1.2.3 sur les géloses sélectives de LB (1 g de tryptone, 1 g de NaCl, 0,5 g d’extrait de levure ; 1,5 g d’agar dissous dans 100 mL d’eau distillée. Autoclave et ajouter 0,1 % de kanamycine 50 mg/mL). Incuber les boîtes LB pendant 16 h à 37 ° C pour la croissance de la colonie.
    5. Prélever des colonies de 5 à 10 et remettre en suspension les individuellement dans 5 µL d’eau distillée.
    6. Effectuer des PCR en ajoutant 5 µL de tampon de réaction, 0,5 µL des dNTPs 10 mM, 0,25 µL d’ADN polymérase, 1 µL de suspension colonies, 1,25 ml de 10 µM M13 avant l’apprêt, 1,25 ml de 10 primer inverse de µM du gène cible et l’eau pour un volume final de 25 µL. chauffer la PCR réaction à 98 ° C pendant 30 s, suivi par 35 cycles de 98° C pendant 10 s, 53 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 60 s, puis une extension finale à 72 ° C pendant 2 min (tableau 1).
    7. Re-3 µL de suspension colonies de l’étape 1.2.5 dans médias TB (100 mL de tampon phosphate contenant 0,17 M KH2PO4 et 0,72 M K2HPO4 450 ml de milieu de base bouillon contenant 6 g de tryptone, 12 g de levure et 2 mL de la culture glycérol, stérilisé, contenant 0,1 % kanamycine de 50 mg/mL) pendant 16 h. extraire l’ADN de plasmide ultra purs suivant le protocole du fabricant.
    8. Utilisation 200 ng/µL ultra pure plasmide de l’étape 1.2.7 pour commercial Sanger sequencing avec des amorces M13 et inverses. Vérifiez la bonne insertion du gène cible vecteur basé sur le plan de séquence fourni par le fabricant.
    9. Stocker les échantillons d’ADN de plasmide ultra pure séquence-vérifié des MdαE7 et des GFP à-20 ° C.
      Remarque : Ces pièces sont l’entrée plasmide ADN de MdαE7 et la GFP.
  3. Construire un baculovirus recombinants en effectuant la réaction de recombinaison (LR) Lambda.
    1. Respectivement, mélanger 1 µL de plasmide entrée de 300 ng/µL ADN de GFP, MdαE7 de l’étape 1.2.7 ou ADN plasmidique entrée du gène de le chloramphenicol (CAT) fourni par le kit de transfection cellulaire 5 µl de disponible dans le commerce (contenant attL sites) C-expression ADN linéaire (contenant des sites attR) pour 250 µL PCR tubes. Ajouter le tampon de TE faire un volume total de 8 µL.
      Remarque : Les réactions des GFP et CAT servaient de groupes témoins.
    2. Ajouter 2 µL de commercialement disponible mélange enzymatique recombinaison (LR) Lambda (Table des matières) dans chaque mélange d’étape 1.3.1 pour catalyser la réaction de LR. Doucement, mélanger et laisser incuber à 25 ° C durant la nuit (≈16 h).
      Remarque : La réaction de LR facilite la recombinaison d’un attcontenant L entrée ADN plasmidique avec attC terme contenant R ADN linéaire pour générer un attB-contenant des virus exprimant. Cette étape génère le baculovirus recombinant pour chaque protéine cible.
    3. Diluer 1 µL LR des produits de réaction de l’étape 1.3.2 20 X. Effectuer la PCR à l’aide d’un apprêt avant de polyédrine et V5 reverse primer (tableau 1). 5 µL de produits PCR permet d’exécuter un gel d’agarose à 1 % pour vérifier la qualité. La figure 1 montre un exemple de produit de la réaction de LR du gène MdαE7.

Figure 1
Figure 1 : résultats des exemple de réaction MdαE7 LR par analyse PCR. Diluer 2 µL de réaction LR 200 fois et utiliser 2 µL de dilution ainsi que polyédrine amorce vers l’avant et les inverse amorce V5 pour effectuer un PCR de 25 µL. 5 µL de produits PCR permet d’exécuter de gel d’agarose à 1 % pour vérifier la qualité de la réaction de LR. un

  1. Transfecter de cellules d’insecte Sf9
    1. Culture des cellules Sf9 insectes avec 5 mL de milieu de culture cellulaire complet (un milieu sans sérum avec 10 % sérum fœtal (SVF)) en T25 traitées flacons à 27 ° c.
    2. Retirez le surnageant et rincer les cellules rattaché au fond avec 3 mL de milieu de culture cellulaire complet frais. Transférer 0,5 mL de cellules remises en suspension dans un nouveau flacon T25 traités. Ajouter 4,5 mL de milieu de culture complet. Incuber à 27 ° C pendant 3 à 4 jours jusqu'à ce que le prochain transfert.
    3. Culture de cellules de graines 2 mL d’insecte de croissance phase logarithmique Sf9 (≈3.0-5,0 × 106 cellules) uniformément sur le puits de culture cellulaire. Permettre aux cellules d’attacher pendant au moins 3 h à température ambiante dans la hotte.
    4. Vérifier la fixation des cellules en observant avec un microscope inversé de phase à 250 X. Enlever le milieu de culture cellulaire et remplacez par 2 mL de milieu insecte de Grace.
    5. Préparer la solution de mélange A de transfection (8 µL de réactif de l’infection de cellules disponibles dans le commerce (Table des matières) avec 100 µL de milieu insecte de Grace) et transfection mélange B solution de chaque gène cible (9 µL LR des produits de réaction de l’étape 1.3 avec 100 µL de milieu insecte de Grace sans additifs) dans 1,5 mL centrifuger tubes, respectivement.
    6. Mélanger doucement mélange de transfection A et B en tapant sur les tubes. Incuber à température ambiante pendant 35 min dans la hotte.
    7. Ajouter uniformément le mélange de l’étape 1.4.6 goutte à goutte sur les cellules ensemencées de l’étape 1.4.4. Sceller le puits avec des rubans et incuber à 27 ° C durant la nuit.
    8. Remplacer 2 mL de milieu insecte de Grace avec 2 mL de milieu de culture complet. Ajouter 100 µM ganciclovir dans chaque puits pour sélectionner négativement contre non recombinant baculovirus. Sceller le puits avec du ruban adhésif et incuber à 27 ° C pendant 72 h.
    9. Recueillir le milieu de culture cellulaire 72 h après l’infection de chaque puits et transfert à tubes à centrifuger 1,5 mL. Centrifuger à 1 500 g pendant 5 min à 4 ° C pour éliminer les cellules ou les gros débris.
    10. Transvaser le surnageant dans nouveaux tubes de centrifugeuse de 1,5 mL. Stocker à 4 ° C avec protection contre la lumière.
      Remarque : Ce sont les solutions mères de virus P1 pour chaque gène cible.
    11. Amplifier les actions virale de la P1 de faible-titre (1 × 105-1 × 106 UFP/mL) à un stock de virale de titre élevé P2 (5 × 107-1 × 108 UFP/mL).
    12. Culture de cellules de graines 2 mL d’insecte de croissance phase logarithmique Sf9 (≈3.0-5,0 × 106 cellules) uniformément sur le puits de culture cellulaire. Permettre aux cellules d’attacher pendant au moins 3 h à température ambiante dans la hotte.
    13. Inoculer 5 µL de stock de virus P1 obtenu à l’étape 1.4.10 dans la cellule boutonnée bien d’étape 1.4.12, respectivement. Puis, ajouter 100 µM ganciclovir dans chaque puits. Sceller les puits et incuber à 27 ° C pendant 72 h.
    14. Frais virées solutions mères virus de P2 de 72 h après l’infection. Conserver à 4 ° C avec protection contre la lumière.
      Remarque : Ce sont les solutions mères de virus de P2 pour chaque gène cible.
    15. (Facultatif) Répétez les étapes 1.4.12-1.4.14 5 µl de stock de virus P2 pour recueillir les solutions mères de virus P3.
      Remarque : Ce sont les solutions mères de virus P3 pour chaque gène cible.
    16. Rangez tous le baculovirus construit à 4 ° C avec protection contre la lumière.
      Remarque : Le gène de la GFP et chat ont été servi de groupe témoin. Figure 2 montre les signes de cellules lorsqu’elles sont infectées par baculovirus recombinant GFP à étages d’amplification différents.

Figure 2
Figure 2 : exemple de signes infectés de Sf9 cellules à des étages d’amplification différents baculovirus. La figure montre les cellules baculovirus recombinant GFP sous la lumière naturelle et fluorescentes lumière. Au stade de l’infection du P1, le taux d’infection est faible. Au stade de l’infection du P2, le taux d’infection s’est considérablement amélioré. Au stade de l’infection du P3, presque toutes les cellules ont montré des symptômes du détachement de la plaque de culture cellulaire, augmente de diamètre de la cellule, ainsi que la cessation de la croissance cellulaire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

  1. Expression à grande échelle des protéines cibles dans des cellules d’insecte Sf9
    1. Culture 10 mL de journal croissance insecte Sf9 cellules en phase avec le milieu de culture complet dans des flacons de T25 non traitées.
    2. Ajouter 200 µL de solution mère de virus de P2 (obtenue à l’étape 1.4.14) pour infecter des cultures de cellules à l’étape 1.5.1 pendant 72 h.
    3. Recueillir le milieu de culture cellulaire 72 h après l’infection. Centrifuger à 1 500 x g pendant 5 min à 4 ° C.
    4. Jeter des boulettes de surnageants et laver deux fois avec 1 mL de tampon PBS de 0,1 M (pH 7.5).
    5. Entièrement dissoudre des pastilles de cellule avec 1 mL d’extraction de protéine cellulaire insectes & tampon de lyse (Table des matières). Ajouter 10 % de glycérol dans la lyse cellulaire. Immédiatement conserver à-80 ° C.
    6. Répétez les étapes 1.5.1-1.5.5 pour P2 anti-virus stock de protéines CAT pour servir le groupe témoin.
      Remarque : Répétez l’étape 1.5 en trois exemplaires pour les préparations de protéines différentes.

2. un test de cytotoxicité cellulaire MTT

  1. Culture 5 mL de journal croissance (1,5-2,5 × 106 cellules/mL) insecte Sf9 cellules en phase avec le milieu de culture complet dans des flacons de T25 non traitées.
  2. Ajouter 25 µL de solution mère de virus P1 (obtenue à l’étape 1.4.14) pour infecter des cultures de cellules à l’étape 2.1 pendant 48 h avec agitation douce à 27 ° c.
  3. Préparer 100 mM standard solutions perméthrine dans l’acétonitrile. Diluer à 6,25 mM, 50 mM, 25 mM et 12,5 mM en ajoutant 500 µL, 250 µL, 125 µL et 62,5 µL de solution stock de perméthrine dans un volume total de 1 000 µL, respectivement avec l’acétonitrile.
  4. Les semences uniformément 200 µL de cultures de cellules infectées de l’étape 2.2 additionné de 300 µL de milieu de culture complet dans la plaque 24 puits à une densité de 2 × 105 cellules/mL.
  5. Ajouter 4 µL des solutions titrées de perméthrine (6,25 mM, 12,5 mM, 25 mM et 50 mM) dans chaque puits de faire une concentration finale de 50 µM, 100 µM, 200 µM et 400 µM, respectivement. Ajouter seulement 4 µL d’acétonitrile dans les puits pour les calculs de viabilité de cellules (Figure 3).
  6. Plaques avec les bandes de joint et incuber à 27 ° C pendant 48 h avec protection contre la lumière.
  7. Préparer 5 mg/mL de réactif de MTT (Thiazolyl bleu Tetrazolium Bromide) dissoute dans un tampon (2,0 g de NaCl, 0,05 g de KCl, 0,36 g de NaH2PO4∙2H2O, 0,28 g NaH2PO4, 0,05 g de KH2PO4 dissous dans 200 mL d’eau distillée eau, pH 7,5).
  8. Retirer un milieu de culture cellulaire étape 2.6 après 48 h d’incubation sans toucher à la couche de cellules attachées au fond. Ajouter 200 µL de réactif de MTT en étape 2.7 dans chaque puits. Incuber à 37 ° C pendant 4 h, jusqu'à ce que les précipités de formazan violet foncé forment dans chaque puits (Figure 3).
  9. Incuber à 37 ° C pendant 4 h, jusqu'à ce que les précipités de formazan violet foncé forme dans chaque puits. Ajouter 500 µL de DMSO pour dissoudre entièrement précipités (Figure 3).

Figure 3
Figure 3 : exemple de résultats MTT. Après 48 h après l’infection avec la solution mère de virus P1 de solution de CAT de baculovirus recombinant, uniformément graine 500 µL des cellules exprimant le gène CAT dans une plaque de culture cellulaire de 24 puits. Respectivement, ajouter 4 µL perméthrine à une dose différente (6,25 mM, 12,5 mM, 25 mM et 50 mM) de chaque ligne pour faire la concentration finale de 50 µM et 100 µM, 200 µM 400 µM. La ligne de commande a été traitée avec de l’acétonitrile seulement et marquée comme CK dans la plaque. (A) après 48 h d’incubation à 27 ° C, jeter le milieu de culture cellulaire sur la couche supérieure et le remplacer avec 200 µL de réactifs MTT couleurs jaunes. Puis incuber à 37 ° C pendant 48 h. violet foncé colorée réduction précipite forme dans chaque bien, indiquant que les cellules de survie sont capables de métaboliser la couleur jaune réactifs MTT dans le précipité de couleur pourpre foncé. (B) 500 µL de solvant DMSO a été ajouté dans chaque puits pour dissoudre le précipité formé. La valeur de l’absorbance de chaque bien a été détectée par spectrophotomètre à 540 nm. Que la perméthrine concentrations augmentent, la couleur changera progressivement du rouge foncé à lumière rouge, ce qui suggère que la viabilité de la cellule ont graduellement diminuée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

  1. Transférer 200 µL de solution dissoute dans la plaque de 96 puits. Mesurer les valeurs d’absorbance à 540 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques (Table des matières).
  2. Calculer la viabilité cellulaire en comparant les valeurs d’absorbance des cellules de perméthrine traité avec celles des seules les cellules traitée d’acétonitrile.
  3. Pour le groupe témoin, répéter toutes les étapes avec la solution mère de P2 virus de chloramphénicol acétyltransférase (CAT) baculovirus recombinant obtenu à l’étape 1.4.
  4. Répéter 4 fois pour les préparations de virus différents.

3. essai in Vitro métaboliques avec

  1. Préparer 100 mM standard solutions perméthrine dans l’acétonitrile. Diluer à 6,25 mM, 50 mM, 25 mM et 12,5 mM avec l’acétonitrile. Détecter la surface du pic correspondant au titre de chaque concentration par CLHP. Créez et calculer la courbe d’étalonnage de perméthrine basée sur la surface du pic avec des concentrations différentes de perméthrine.
  2. Mesurer les concentrations de protéine à l’étape 1.5 avec Bradford méthodes21.
  3. Préparez 700 µL de réaction métabolique avec standard de perméthrine 40 µM et 1 mg de protéines obtenues à l’étape 1.5 dissoute dans un tampon Tris-HCl de M 0,2 (pH 7,4). Incuber à 30 ° C pendant 2 h avec agitant doucement. Protéger de la lumière.
  4. Étancher la réaction en ajoutant 700 µL d’acétonitrile glacée. Incuber à 30 ° c pendant 30 min avec agitant doucement. Protéger de la lumière.
  5. Centrifuger le mélange réactionnel à 16 000 x g pendant 2 min à température ambiante. Récupérer le surnageant et le filtre à travers une membrane 0,45 de µm. Transvaser la filtration dans des flacons en verre brun ultraclean pour analyse par CLHP.
  6. Exécutez l’HPLC dans les conditions chromatographiques optimales (phase Mobile A: 90 % acétonitrile et 10 % d’eau ; Phase mobile b : 5 % acétonitrile ajustée à un pH de 2,3 à 85 % d’acide phosphorique). Gradient éluer avec un débit de 1 mL/min et de mesure à une longueur d’onde de 232 nm.
  7. Calculer le pourcentage de déplétion de perméthrine en comparant avec des réactions sans échantillon de protéine ajoutée.
  8. Utiliser CAT protéine obtenue à l’étape 1.5.6 pour servir de contrôle.
  9. Répétez toutes les étapes avec des préparations de protéines différentes à l’étape 1.5.7.

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Representative Results

La viabilité des cellules vers la perméthrine différents traitements (test MTT)

La cytotoxicité de la perméthrine a été examinée dans MdαE7-recombinant baculovirus infectés Sf9 cellules (groupe expérimental) et CAT-recombinant baculovirus (fourni par le kit de baculovirus infecté) infectés (groupe témoin). Les tolérances de cellule renforcée à la perméthrine dans MdαE7 exprimant des cellules fortement appuient les rôles métaboliques de ce carboxylestérase contre les insecticides et les cellules ainsi protéger des dommages chimiques. Dans notre étude, la viabilité des cellules contre les concentrations différentes de perméthrine (50, 100, 200 et 400 µM) a été calculé par rapport à des cellules traitées avec de l’acétonitrile seul. Nos résultats ont montré que la viabilité de MdαE7 exprimant des cellules était significativement plus élevée (allant de 86,00 % à 101.92 %) (Figure 4 b) à celle des cellules de contrôle (allant de 67.59 % à 81,43 %) (Figure 4 a) lorsqu’ils sont exposés à la perméthrine à différentes concentrations, ce qui indique le rôle important des MdαE7 à métaboliser la perméthrine dans des cellules d’insecte.

Figure 4
Figure 4 : la viabilité des cellules d’insecte Sf9 sous traitements différents perméthrine. (A) la viabilité des cellules témoins infectés par CAT baculovirus recombinant (B) la viabilité des cellules expérimentales infecté par MdαE7 baculovirus recombinant. Quatre répétitions ont été menées pour chaque concentration de perméthrine. Données a été montrées comme moyenne ± SEM. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Métabolisme in vitro de perméthrine par MdαE7

Perméthrine métabolisme a été testé en incubant solution étalon perméthrine 40 µM avec MdαE7 protéines extraites des cellules Sf9 infectées. Les réactions avec les protéines de la CAT ont servi de témoins. Le pourcentage de l’appauvrissement de la perméthrine a été calculé par rapport aux réactions sans enzyme ajouté. Les réactions ont été suivies par HPLC en phase inversée après 120 min d’incubation. Étant donné que la perméthrine standard est en réalité un mélange d’isomères cis et trans, deux pics ont été observés dans les profils chromatographiques HPLC, avec des temps d’élution de 10,67 min et min 10,87 perméthrine-trans et cis-perméthrine, respectivement (Figure 5). Le pourcentage de l’appauvrissement de la perméthrine par des protéines de MdαE7 (39.18±3.78 %) était significativement plus élevé que celle des protéines de CAT (7.29±0.81 %) (Figure 6), qui n’est pas seulement correspondre à MTT résultats mais également directement démontre les capacités de MdαE7 en métabolisant perméthrine in vitro.

Figure 5
Figure 5 : profil de l’HPLC de perméthrine standard. La perméthrine standard utilisée dans cette étude est un mélange d’isomères trans-perméthrine et cis-perméthrine. Les flèches rouges indiquent les pics pour l’isomère trans-perméthrine et l’isomère cis-perméthrine, respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : In vitro le métabolisme de la perméthrine par des protéines recombinantes MdαE7 et CAT. On a calculé les pourcentages d’appauvrissement de la couche de perméthrine par les protéines MdαE7 et chat. Trois répétitions ont été menées pour chaque concentration de perméthrine. Données a été montrées comme moyenne ± SEM. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Ces dernières décennies, des systèmes d’expression hétérologue ont été employé couramment pour exprimer et isoler les grandes quantités de protéines, ce qui permet la détermination biochimique et fonctionnelle et la caractérisation des enzymes in vitro. A ce jour, plusieurs systèmes de modèles différents dont Escherichia coli, Pichia pastoris, Sacccharomyces cerevisiaeet Spodoptera frugiperda ont été adaptés pour l’expression de protéine recombinante et le choix de la système in vitro est crucial pour la production à grande échelle des protéines intéressées22,23,24,25. Dans notre étude, le système d’expression baculovirus insectes cellulaire pour générer la maison carboxylestérases mouche a été choisi parce qu’il fournit un environnement intracellulaire semblable à des cellules d’insecte et maintient des capacités de traitement important des eucaryotes 9. Malgré les avantages du système baculovirus-mediated exprimant, ses limitations devraient aussi être examinées. Le système d’expression baculovirus insectes cellulaire peut produire des protéines cibles uniquement si les cellules d’insectes ont été infectés par des baculovirus recombinant construites. Le développement actuel de la création de lignées cellulaires insectes TRANSFORMEES a rendu possible non seulement pour produire constitutivement protéines concernées en l’absence d’infection de baculovirus, mais aussi d’améliorer les capacités de la cellule de glycosylation et pliage protéines générées par le biais de modifications d’ingénierie9.

Pour mieux étudier les rôles des carboxylestérases en métabolisant des insecticides dans les cellules et protégeant ainsi les cellules des dommages chimiques, le test MTT a été réalisé afin de mesurer la cytotoxicité cellulaire contre perméthrine différents traitements. Pendant ce processus, beaucoup de paramètres expérimentaux liés à la revue cell metabolism, tels que les compositions moyennes de cellules, de taux de croissance de cellules, de concentration et de consommation des métabolites d’approvisionnement en énergie, peut influer sur la réduction du MTT et ainsi conduire à inexactes résultats. Pour réduire au minimum les plus / sous-estimation du test MTT, que le milieu de culture cellulaire, état de la croissance cellulaire et les conditions d’incubation constante entre les différents traitements expérimentaux26. Afin de déterminer les effets de la viabilité cellulaire causées par une infection baculovirus plutôt que de perméthrine, nous a montré que le processus d’infection de baculovirus recombinant GFP à des cellules d’insecte Sf9 et constaté qu’à l’étape de l’infection de P2, les cellules ont la plus forte ratio d’infection avec le plus bas taux de décès de cellule par rapport à d’autres stades de l’infection (Figure 2). Cela peut mieux expliquer la raison du choix des cellules au stade d’infection de P2 pour effectuer le test MTT.

En comparant la viabilité des cellules lorsqu’elles sont infectées par des baculovirus recombinant MdαE7 et CAT dans une étude MTT, nous avons trouvé une viabilité accrue des cellules lorsque exprimant des protéines de MdαE7, qui peuvent mieux prendre en charge les rôles métaboliques des carboxylestérases de perméthrine dans les cellules d’insectes et protéger les cellules contre les dommages chimiques (Figure 4). L’in vitro métabolique étude, qui est reconnue comme une méthode directe pour refléter les capacités métaboliques des carboxylestérases vers insecticides, devrait également été explorés pour compenser les limites du test MTT à mieux caractériser les protéines fonctions métaboliques.

Dans cette étude, l’expression hétérologue des carboxylestérases dans des cellules d’insecte Sf9 avec un système d’expression baculovirus-négociée, la mesure de la viabilité cellulaire vers la perméthrine différents traitements par l’analyse de MTT et la caractérisation des carboxylestérases par un métabolisme in vitro d’analyse tous travailler ensemble pour fournir une stratégie systématique, scientifique et précise afin d’étudier le rôle des enzymes de détoxication chez les insectes, ce qui facilite une meilleure compréhension de l’insecticide mécanismes de résistance et ainsi développer des stratégies novatrices pour la lutte antiparasitaire.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs inc. M0491L
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28704
pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli Invitrogen by life technology K240020 S.O.C medium and universal M13 sequence primers were included in this kit.
PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit Invitrogen by life technology K210002
Gateway LR Clonase II Enzyme mix for BaculoDirectTM Kits Invitrogen by life technology 11791-023
BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit Invitrogen by life technology 12562-019 Cellfectin transfection reagent and ganciclovir were included in this kit
pENTR-CAT plasmid Invitrogen by life technology Included in BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit, concentration: 0.5 ug/uL
Heat inactivated Fetal Bovine Serum, Certified Gibco by Life Technologies 10082-139
Sf9 cells in Sf-900 III SFM Gibco by Life Technologies 12659017
Insect Cell-PE LB Insect Cell Protein Extraction & Lysis Buffer G Biosciences by A Geno Technology Inc 786-411
Sf-900 III SFM (1×) Serum Free Medium Complete Gibco by Life Technologies 12658-019
Grace's Insect Medium, unsupplemented Gibco by Life Technologies 11595030
Permethrin (isomers) analytical standard SUPELCO by Solutions WithinTM 442748
Methanol (analytical graded) Sigma-Aldrich 67-56-1
Acetonitrile (analytical graded) Sigma-Aldrich 75-05-8
GHP Acrodisc 25 mm Syringe Filters with 0.45 μm GHP Membrane (HPLC Certified) Pall Life Sciences 21890388
Alliance Waters 2695 HPLC System Waters
T100 Thermal Cycle Bio-Rad Laboratories Inc. 1861096
Nanodrop 2000/2000c Spectrophotometers ThermoFisher Scientific ND2000CLAPTOP
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader BioTek

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References

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