Funktionelle karakterisering af Carboxylesterases i insekticid resistente stuefluer, Musca Domestica

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for at producere hus flyve carboxylesterase proteiner i vitro med en baculovirus medieret insekt celle ekspressionssystem og senere funktionelt karakteriserer deres roller i metaboliske permethrin, dermed overdrage pyrethroid modstand af celle-baseret MTT assay og in vitro- metaboliske undersøgelser.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Feng, X., Liu, N. Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica. J. Vis. Exp. (138), e58106, doi:10.3791/58106 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Carboxylesterase-medieret stofskifte menes at spille en større rolle i insekticidresistens i forskellige insekter. Flere carboxylesterase gener blev fundet op-reguleret i resistent hus flyve stamme, der henviser til, at deres roller i tildeling insekticidresistens forblev for at blive udforsket. Her, vi har udviklet en protokol for den funktionelle karakterisering af carboxylesterases. Tre eksempel eksperimenter præsenteres: (1) udtryk og isolering af carboxylesterase proteiner gennem en baculovirus-medieret insekt Spodoptera frugiperda (Sf9) celle ekspressionssystem; (2) en celle-baserede MTT (3-[4, 5-dimethykthiazol-2-yl] -2, 5-diphenyltetrazolium bromid) cytotoksicitet assay at måle tolerance over for insekt celler til forskellige permethrin behandlinger; og (3) in vitro- metaboliske undersøgelser for at udforske de metaboliske funktioner i carboxylesterases mod permethrin. Carboxylesterase gen MdαE7 var klonet fra en resistent hus flyve stamme ALHF og bruges til at konstruere en rekombinante baculovirus for Sf9 celler infektion. Celle viabilities mod forskellige permethrin behandlinger blev målt med MTT-analysen. Den forbedrede celle tolerance af den eksperimentelle gruppe (MdαE7-rekombinant baculovirus inficerede celler) sammenlignet med kontrolgruppen (kat-rekombinant baculovirus inficerede celler og normal god landbrugspraksis-rekombinant baculovirus inficerede celler) at permethrin behandlinger foreslået funktionerne i MdαE7 i metaboliske insekticider, dermed beskytte celler mod kemiske skader. Udover det, var carboxylesterase proteiner udtrykt i insekt celler, Sf9 og isoleret for at foretage en in vitro- metaboliske undersøgelse. Vores resultater viste en betydelig in vitro- metaboliske effektivitet af MdαE7 mod permethrin, direkte antyder inddragelse af carboxylesterases i metaboliske insekticider og dermed overdrage insekticidresistens i hus fluer.

Introduction

Insekticidresistens er i øjeblikket et stort problem på house flyve kontrol over hele verden1,2. Bestræbelser på at fastlægge mekanismen af insekticidresistens letter forståelsen af dette spørgsmål og dermed give nye strategier til at effektivt forebygge eller minimere spredning af resistens udvikling3. Carboxylesterases, har som en af de store afgiftning enzymer, tiltrukket en masse opmærksomhed for deres roller i binding og metaboliske insekticider i forskellige insekter4,5,6. Vores tidligere undersøgelse har identificeret flere carboxylesterases i stuefluer og deres udtryk niveauer var ikke kun constitutively op-reguleret i den resistent ALHF stamme, men også kan være induceret til højere niveauer i svar på permethrin behandlinger7 . De funktionelle karakterisering af disse carboxylesterase gener i metaboliske insekticider er dog stadig at blive udforsket.

Siden den første rapport i begyndelsen 1980s8, er en baculovirus-medieret fremmed gen expression system blevet bredt ansat på grund af sin høje protein produktionseffektivitet og eukaryote protein behandling kapaciteter9. Denne binære system består af to væsentlige elementer: den beregnede rekombinante baculovirus levere fremmede gener i værtsceller og storstilet udtryk for interesserede proteiner af celler inficeret af rekombinante baculovirus. I de seneste årtier, baculovirus medieret celle udtryk system har været meget anvendt til at producere tusindvis af rekombinante proteiner, lige fra cytosole enzymer til membran-bundet proteiner i insekter og pattedyr celler10. Vores tidligere undersøgelse har med held givet udtryk for flere CYP450 enzymer i insekt Sf9 celler med dette system11. I denne undersøgelse, vi konstrueret en carboxylesterase-rekombinant baculovirus for at inficere insekt Sf9 celler, udforskes celle tolerance over for forskellige permethrin behandlinger og storstilet udtrykt carboxylesterase proteiner i vitro for funktionelle udforskning. I stedet for at undersøge flere carboxylesterase isozyme blandinger fra insekt homogeniseret, som blev vedtaget af tidligere undersøgelser12,13, dette baculovirus-medieret insekt celle udtryk system tillader den specifikke udtryk og isolering af målrettede proteiner for bedre karakterisering af deres biokemiske og strukturelle egenskaber.

Tetrazolium salt-baseret analyse (MTT) er en høj overførselshastighed kolorimetriske metode udviklet og optimeret til måling af cellers levedygtighed. Denne analyse er baseret på den mekanisme, der kun levende celler er i stand til at metaboliske gul-farvet MTT reagens til en mørk lilla farvet formazankoncentrationen bundfald, som kan analyseres kolorimetrisk efter opløst i organiske opløsningsmidler14, 15. Flere mere præcise men tidskrævende metoder, såsom Trypan blå udstødelse og thymidine titrering assay16,17, er blevet udviklet i de seneste år. Dog er cellebaserede MTT assay stadig i øjeblikket anerkendes som den mest hurtig og let betjente metode til hurtigt opdage cellernes levedygtighed. Her bruger vi MTT analysen til at udforske den celle tolerance mod insekticidbehandling. Celler når inficeret med carboxylesterase rekombinante baculovirus stærkt forbedret tolerance understøtter carboxylesterases til insekticider, som til gengæld antyder deres inddragelse i insekticidresistens metaboliske roller.

Derudover blev en in vitro- metaboliske assay også gennemført i denne undersøgelse. Sammenlignet med almindelige carboxylesterase assays, der bruger fælles substrater såsom α-napthyl acetat (α-NA) og β-naphthyl acetat (β-NA) afspejler hydrolytisk aktiviteter af carboxylesterases, betragtes in vitro- metaboliske undersøgelse som en nøjagtig måde til direkte måling af carboxylesterases mod insekticider18aktiviteter. Denne metode har med held været ansat i forskellige insekter til at karakterisere flere cytokrom P450s i forening med insekticid resistens11,19,20. Dog, denne metode har ikke endnu blevet anvendt i carboxylesterase undersøgelser. Med tilgængeligheden af carboxylesterase proteiner produceret af baculovirus-medieret ekspressionssystem, kan vi udføre en in vitro- metaboliske undersøgelse af carboxylesterases mod permethrin, som yderligere kan give stærke beviser for deltagelse af carboxylesterases i tildeling pyrethroid modstand i hus fluer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. udtryk og Isolation af Target proteiner med en Baculovirus-medieret insekt celle ekspressionssystem

  1. Veje klon blunt-ended PCR produkter af target proteiner fra stuefluer.
    1. Design PCR primere af grøn fluorescerende proteiner (normal god landbrugspraksis) og hus flyve MdαE7 genet baseret på deres sekvenser og de særlige krav i den valgte vektor (tabel 1).
    2. Bruge en termostabil, korrekturlæsning DNA polymerase og primere fra trin 1.1.1 til at udføre en 150 µL PCR reaktion (30 µL af reaktion buffer, 3 µL af 10 mM dNTP'er, 1,5 µL DNA polymerase, 6 µL af huset flyve skabelon DNA, 7,5 µL af fremad primer 7,5 µL af reverse primer, med vand til en endelige rumfang 150 µL). Varme PCR reaktion til 98 ° C til 30 s, efterfulgt af 35 cyklusser af 98 ° C til 10 s, 53 ° C til 30 s og 72 ° C i 60 s, og derefter en sidste udvidelse ved 72 ° C i 2 min).
      1. Køre en 1%-agarosegel med 150 µL PCR produkt.
    3. Punktafgifter target DNA fragmenter fra Agarosen gel med en skarp, ren skalpel: 1317 bp for MdαE7 og 858 bp for normal god landbrugspraksis. Rense DNA ved hjælp af kommercielt tilgængelige gel udvinding kit efter producentens protokol (Tabel af materialer). Opløse oprenset DNA i 15 µL destilleret vand.
    4. Køre en 1%-agarosegel med 1 µL af oprenset DNA til at kontrollere integriteten. Bruge en anden 1 µL af oprenset DNA til at måle koncentrationer med spektrofotometret.
  2. Konstruere en post plasmid for target proteiner
    1. Oprettet den kloning reaktion. Bland frisk renset DNA produkter fra trin 1.1.3 og kommercielt tilgængelige post vektorer indeholdende attL-sites (Table of Materials) på en kindtand forholdet 1:1 (0,5-2 µL af frisk PCR produkt på 70-200 ng/µL koncentrationer: 0,5 µL vektor). Derefter tilsættes 1 µL af kommercielt tilgængelige saltopløsning (1,2 M NaCl2 og 0,06 M MgCl2) og tilsæt vand til en endelige mængden af 6 µL. Bland forsigtigt og inkuberes ved stuetemperatur i 1 time.
    2. Overføre 4 µL af kloning reaktionsprodukter i trin 1.2.1 til 50 µL af kemisk kompetente E. coli celler. Inkuberes i isbad i 30 min. Heat-shock celler til 30 s i et 42 ° C vandbad uden rystelser.
    3. Lægge røret tilbage i isen for en anden 2 min. tilføje 250 µL af stuetemperatur S.O.C. medium (2% trypton; 0,5% gærekstrakt; 10 mM NaCl; 2,5 mM KCl; 10 mM MgCl2; 10 mM MgSO4; 20 mM glukose). Der inkuberes ved 37 ° C i 1 time med forsigtigt ryste.
    4. Spred 50-200 µL af bakteriekulturen taktfast 1.2.3 på selektiv LB plader (1 g trypton; 1 g NaCl; 0,5 g af gærekstrakt; 1,5 g agar opløses i 100 mL destilleret vand. Autoklave og tilføje 0,1% af 50 mg/mL kanamycin). Inkuber LB plader i 16 timer ved 37 ° C i kolonien vækst.
    5. Pick 5-10 kolonier og genopslæmmes dem individuelt i 5 µL af destilleret vand.
    6. Udføre PCR ved at tilføje 5 µL af reaktion buffer, 0,5 µL af 10 mM dNTP'er, 0,25 µL DNA polymerase, 1 µL af suspenderede kolonier, 1,25 µL af 10 µM M13 fremad primer, 1,25 µL af 10 µM omvendt primer af target-genet, og vand til endelige mængden af 25 µL. varme PCR reaktion på 98 ° C til 30 s, efterfulgt af 35 cyklusser af 98° C til 10 s, 53 ° C til 30 s og 72 ° C i 60 s, og derefter en sidste udvidelse ved 72 ° C i 2 min. (tabel 1).
    7. Re kultur 3 µL af suspenderede kolonier fra trin 1.2.5 i TB medier (100 mL af fosfat buffer indeholdende 0,17 M KH2PO4 og 0,72 M K2HPO4 med 450 mL af base bouillon medium indeholder 6 g trypton, 12 g gær og 2 mL af glycerol, steriliseret, der indeholder 0,1% 50 mg/mL kanamycin) til 16 h. Uddrag ultra-rene plasmid DNA efter producentens protokol.
    8. Brug 200 ng/µL ultra-rene plasmid fra trin 1.2.7 for kommercielle Sanger sekventering med M13 frem og bak primere. Kontrollér den korrekte indsættelse af target-genet i vektor baseret på sekvensen kortet leveres af producenten.
    9. Gemme sekvens-verificerede ultra-rene plasmid DNA-prøver af MdαE7 og normal god landbrugspraksis i-20 ° C.
      Bemærk: Disse er posten plasmid DNA af MdαE7 og normal god landbrugspraksis.
  3. Konstruere en rekombinante baculovirus ved at udføre Lambda rekombination (LR) reaktion.
    1. Henholdsvis mix 1 µL af 300 ng/µL post plasmid DNA af normal god landbrugspraksis, MdαE7 fra trin 1.2.7 eller post plasmid DNA af chloramphenicol acetyltransferase gen (kat) fra celle Transfektion kit med 5 µL af kommercielt tilgængelige (der indeholder attL websteder) C-sigt lineære DNA (indeholdende attR websteder) i 250 µL PCR rør. Tilføj TE buffer for at gøre en samlet maengde paa 8 µL.
      Bemærk: Reaktioner af normal god landbrugspraksis og kat blev brugt som kontrolgrupper.
    2. Tilføj 2 µL af kommercielt tilgængelige Lambda rekombination (LR) enzymet mix (Table of Materials) i hver blanding af trin 1.3.1 til at katalysere LR reaktion. Forsigtigt blandes og inkuberes ved 25 ° C natten over (≈16 h).
      Bemærk: LR reaktion letter rekombination af en attL-holdige post plasmid DNA med en attR-holdige C-sigt lineære DNA til at generere en attB-holdige udtrykke virus. Dette trin producerer den rekombinante baculovirus for hvert mål protein.
    3. Fortyndes 1 µL af LR reaktionsprodukter fra trin 1.3.2 20 X. Udføre PCR ved hjælp af en Polyhedrin forreste primer og V5 omvendt primer (tabel 1). Brug 5 µL af PCR-produkter til at køre en 1% agarosegel for at kontrollere kvaliteten. Figur 1 viser et eksempel på LR reaktionsprodukt fra MdαE7 gen.

Figure 1
Figur 1: eksempel resultater af MdαE7 LR reaktion ved PCR analyse. Fortyndes 2 µL af LR reaktion 200-fold og bruge 2 µL af fortyndingsluft samt Polyhedrin frem primer og V5 omvendt primer til at udføre en 25 µL PCR. Brug 5 µL af PCR-produkter til at køre 1% agarosegel for at kontrollere kvaliteten af LR reaktion. en

  1. Transfect insekt Sf9 celler
    1. Kultur insekt Sf9 celler med 5 mL af komplet celle vækstmedium (serumfrit medium med 10% føtal bovint serum (FBS)) i T25 behandlet kolber på 27 ˚C.
    2. Fjern supernatanten og skylle bunden-attached celler med 3 mL frisk komplet celle vækstmediet. Overføres 0,5 mL af re suspenderede celler til en ny T25 behandlet målekolbe. Tilføje 4,5 mL af komplet vækstmediet. Der inkuberes ved 27 ° C i 3-4 dage indtil den næste overførsel.
    3. Frø 2 mL af log-fase vækst insekt Sf9 celler kultur (≈3.0-5.0 × 106 celler) jævnt på cellekultur godt. Tillad celler til at vedhæfte i mindst 3 timer ved stuetemperatur i hætten.
    4. Tjek den celle vedhæftede fil ved at observere med en omvendt fase mikroskop på 250 X. Fjerne cellekulturmedium og erstatte med 2 mL af graces insekt medium.
    5. Forberede Transfektion blanding A løsning (8 µL af kommercielt tilgængelige celle infektion reagens (Tabel af materialer) med 100 µL af graces insekt medium) og Transfektion blanding B løsning for hvert mål gen (9 µL af LR reaktionsprodukter fra trin 1.3 med 100 µL af unsupplemented nåde insekt medium) i 1,5 mL centrifugeres rør, henholdsvis.
    6. Bland forsigtigt Transfektion blanding A og B sammen ved at trykke på rør. Inkuber ved stuetemperatur i 35 min. i hætten.
    7. Jævnt tilføje blandingen fra skridt 1.4.6 dråbevis ind på de seedede celler fra trin 1.4.4. Forsegle brønde med bånd og inkuberes ved 27 ° C natten over.
    8. Erstatte 2 mL af graces insekt medium med 2 mL af komplet vækstmediet. Tilsæt 100 µM ganciclovir i hver brønd negativt vælge mod ikke-rekombinant baculovirus. Forsegle brønde med tape og inkuberes ved 27 ° C i 72 timer.
    9. Indsamle 72 h post infektion cellekulturmedium fra hver brønd og overføre til 1,5 mL centrifugeglas. Der centrifugeres ved 1.500 x g i 5 min. ved 4 ° C for at fjerne celler eller store snavs.
    10. Overføre supernatanten til nye 1,5 mL centrifugeglas. Opbevar dem ved 4 ° C med beskyttelse mod lys.
      Bemærk: Disse er P1 virus stamopløsninger for hvert mål gen.
    11. Forstærke det lav-titer P1 viral materiel (1 × 105-1 × 106 pfu/mL) til en høj titer P2 viral bestand (5 × 107-1 × 108 pfu/mL).
    12. Frø 2 mL af log-fase vækst insekt Sf9 celler kultur (≈3.0-5.0 × 106 celler) jævnt på cellekultur godt. Tillad celler til at vedhæfte i mindst 3 timer ved stuetemperatur i hætten.
    13. Podes 5 µL af P1 virus stock fremstillet i trin 1.4.10 i cellen seedede godt af trin 1.4.12, henholdsvis. Derefter, tilføje 100 µM ganciclovir til hver brønd. Forsegle brønde og Inkuber ved 27 ° C i 72 timer.
    14. Indsamle P2 virus stamopløsninger af 72 h efter infektion. Opbevares ved 4 ° C med beskyttelse mod lys.
      Bemærk: Disse er P2 virus stamopløsninger for hvert mål gen.
    15. (Valgfrit) Gentag trinene 1.4.12-1.4.14 med 5 µL af P2 virus stock at indsamle P3 virus stamopløsninger.
      Bemærk: Disse er P3 virus stamopløsninger for hvert mål gen.
    16. Gemme alle de konstruerede baculovirus ved 4 ° C med beskyttelse mod lys.
      Bemærk: Normal god landbrugspraksis og kat genet blev serveret som kontrolgruppe. Figur 2 viste tegn på celler, når inficeret af normal god landbrugspraksis-rekombinant baculovirus på forskellige forstærkning stadier.

Figure 2
Figur 2: eksempel på inficerede tegn af Sf9 celler i forskellige baculovirus forstærkning faser. Figuren viser normal god landbrugspraksis-rekombinant baculovirus celler under naturligt lys og fluorescerende lys. På stadiet P1 infektion er infektion ratio lav. På stadiet P2 infektion blev infektion forholdet betydeligt forbedret. På P3 infektion stadium, næsten alle celler viste symptomer på løsrivelse fra celle kultur plade, øger celle diameter, samt ophør af cellevækst. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Storstilet udtryk for target proteiner i insekt celler, Sf9
    1. Kultur 10 mL af log fase vækst insekt Sf9 celler med komplet vækstmediet i T25 ubehandlede kolber.
    2. Tilføje 200 µL af P2 virus stamopløsning (fremstillet i trin 1.4.14) for at inficere cellekulturer taktfast 1.5.1 i 72 timer.
    3. Indsamle 72 h post infektion cellekulturmedium. Der centrifugeres ved 1.500 x g i 5 min. ved 4 ° C.
    4. Kassér supernatanten og vask pellets to gange med 1 mL af 0,1 M PBS buffer (pH 7,5).
    5. Fuldt opløses celle pellets med 1 mL af insekt celle protein udvinding & lysisbuffer (Tabel af materialer). Tilføje 10% glycerol i celle lysering. Straks opbevares ved-80 ° C.
    6. Gentag trinene 1.5.1-1.5.5 med P2 virus stamopløsning af kat proteiner til at tjene som kontrolgruppen.
      Bemærk: Gentag trin 1,5 i tre eksemplarer til forskellige protein præparater.

2. en celle-baserede MTT cytotoksicitet Assay

  1. Kultur 5 mL af log fase vækst (1,5-2,5 × 106 celler/mL) insekt Sf9 celler med komplet vækstmediet i T25 ubehandlede kolber.
  2. Tilføje 25 µL af P1 virus stamopløsning (fremstillet i trin 1.4.14) for at inficere cellekulturer i trin 2.1 for 48 h med blid ryster på 27 ˚C.
  3. Forberede 100 mM permethrin standard stamopløsninger i acetonitril. Bruge acetonitril til fortyndes til 50 mM, 25 mM, 12,5 mM og 6,25 mM ved at tilføje 500 µL, 250 µL, 125 µL og 62,5 µL permethrin stamopløsning i en samlet maengde paa 1.000 µL, henholdsvis.
  4. Jævnt seed 200 µL af inficerede cellekulturer fra trin 2.2 suppleret med 300 µL af komplet vækstmediet i 24-godt plade med en tæthed på 2 × 105 celler/mL.
  5. Tilføj 4 µL af permethrin standardopløsninger (6,25 mM, 12,5 mM, 25 mM og 50 mM) i hver brønd til at gøre en slutkoncentration 50 µM, 100 µM, 200 µM og 400 µM, henholdsvis. Kun tilføje 4 µL af acetonitril til brønde til celle levedygtighed beregninger (figur 3).
  6. Forsegle plader med bånd og inkuberes ved 27 ° C for 48 h med beskyttelse mod lys.
  7. Forberede 5 mg/mL MTT (Thiazolyl blå Tetrazolium bromid) reagens opløst i buffer (2,0 g NaCl, 0.05 g af KCl, 0,36 g af NaH2PO4∙2H2O, 0,28 g NaH2PO4, 0.05 g KH2PO4 opløst i 200 mL destilleret vand, pH 7,5).
  8. Fjerne cellekulturmedium fra trin 2.6 efter 48 h inkubation uden at røre den nederste-attached cellelag. Tilføje 200 µL af MTT reagens i trin 2.7 i hver brønd. Der inkuberes ved 37 ° C i 4 timer, indtil mørk lilla formazankoncentrationen bundfald dannet i hver brønd (figur 3).
  9. Der inkuberes ved 37 ° C i 4 timer, indtil mørk lilla formazankoncentrationen udfældes form i hver brønd. Tilsættes 500 µL af DMSO fuldt opløses bundfald (figur 3).

Figure 3
Figur 3: eksempel på MTT resultater. Efter 48 timer efter infektion med P1 virus stamopløsning af kat rekombinante baculovirus løsning, jævnt frø 500 µL celler udtrykker kat genet i en 24-godt celle kultur plade. Henholdsvis, tilføje 4 µL permethrin på en anden dosis (6,25 mM, 12,5 mM, 25 mM og 50 mM) i hver række at foretage den endelige koncentration til 50 µM, 100 µM, 200 µM og 400 µM. Rækken kontrol blev behandlet med acetonitril kun og markeret som CK i pladen. (A) efter 48 h inkubation ved 27 ° C, slette cellekulturmedium på det øverste lag og erstatte med 200 µL af gul farvet MTT reagenser. Derefter inkuberes ved 37 ° C i 48 h. mørk lilla farvet reduktion udfældes form i hver godt angiver, at overlevelse celler er i stand til at metaboliske den gule farve MTT reagenserne i mørke lilla farvet bundfaldet. B 500 µL af DMSO opløsningsmiddel blev tilføjet i hver brønd til at opløse det dannede bundfald. Absorbans værdi af hver godt blev opdaget af Spektrofotometer ved 540 nm. Da permethrin koncentrationer stigning, vil farven gradvist ændre fra mørk rød til lyserød, tyder på, at celle viabilities blev gradvist faldt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Overføre 200 µL af opløste løsning til 96-brønd plade. Måling af absorbans værdier ved 540 nm med en mikrotiterplade læser (Tabel af materialer).
  2. Beregne cellernes levedygtighed ved at sammenligne absorbans værdier af permethrin behandlede celler med dem kun acetonitril behandlede celler.
  3. Gentag alle trin med P2 virus stamopløsning af chloramphenicol acetyltransferase (kat) rekombinante baculovirus fremstillet i trin 1.4 for kontrolgruppen.
  4. Gentag 4 gange for forskellige virus præparater.

3. in Vitro metaboliske Assay

  1. Forberede 100 mM permethrin standard stamopløsninger i acetonitril. Bruge acetonitril til fortyndes op til 50 mM, 25 mM, 12,5 mM og 6,25 mM. Registrere den tilsvarende topareal under hver koncentration ved hjælp af HPLC. Opret og Beregn Standardkurven for permethrin baseret på topareal med forskellige permethrin koncentrationer.
  2. Bestemmelse af protein koncentrationen i trin 1.5 med Bradford metoder21.
  3. Forberede 700 µL af metabolisk reaktion med 40 µM permethrin standard og 1 mg af proteiner fremstillet i trin 1,5 opløses i 0,2 M Tris-HCl buffer (pH 7,4). Der inkuberes ved 30 ° C i 2 timer med blid ryster. Beskytte mod lys.
  4. Slukke reaktionen ved at tilføje 700 µL af iskold acetonitril. Der inkuberes ved 30 ˚C for en anden 30 min med blid ryster. Beskytte mod lys.
  5. Der centrifugeres reaktionsblandingen på 16.000 x g i 2 min. ved stuetemperatur. Indsamle supernatanten og filtreres gennem et 0,45 µm membran. Overføre filtrering i ultraclean brun hætteglas til HPLC-analysen.
  6. Køre HPLC under de optimale chromatografiske betingelser (mobil fase A: 90% acetonitril og 10% vand; Mobil fase B: 5% acetonitril justeres til pH 2.3 med 85% phosphorsyre). Gradient elueres med en gennemstrømningshastighed på 1 mL/min og måle ved bølgelængden af 232 nm.
  7. Beregne udtynding procentdelen af permethrin ved at sammenligne med reaktioner uden protein prøve tilføjet.
  8. Bruge kat protein fremstillet i trin 1.5.6 til at tjene som kontrol.
  9. Gentag alle trin med forskellige protein præparater i trin 1.5.7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Cellernes levedygtighed mod forskellige permethrin behandlinger (MTT assay)

Cytotoksicitet af permethrin blev undersøgt i MdαE7-rekombinant baculovirus inficerede Sf9 celler (eksperimentelle gruppe) og kat-rekombinant baculovirus (leveres af baculovirus inficeret kit) inficerede celler (kontrolgruppen). De forbedrede celle tolerancer til permethrin i MdαE7 udtrykker celler kraftigt støtte de metaboliske roller af denne carboxylesterase mod insekticider og dermed beskytte celler fra kemiske skader. I vores undersøgelse, cellernes levedygtighed mod forskellige permethrin koncentrationer (50, 100, 200 og 400 µM) blev beregnet i forhold til celler behandles med acetonitril alene. Vores resultater viste, at levedygtigheden af MdαE7 udtrykker celler var betydeligt højere (lige fra 86,00% til 101.92%) (Figur 4B) end kontrol celler (lige fra 67.59% til 81.43%) (Figur 4A) når de udsættes for permethrin i forskellige koncentrationer, der angiver MdαE7 vigtige roller i metaboliske permethrin i insekt celler.

Figure 4
Figur 4: viabilities af insekt Sf9 celler under forskellige permethrin behandlinger. (A) levedygtigheden af kontrol celler inficeret med kat rekombinante baculovirus b eksperimentel celler inficeret af MdαE7 rekombinante baculovirus levedygtighed. Fire replikationer blev gennemført for hver permethrin koncentration. Data blev vist som gennemsnit ± SEM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

In vitro metabolisme af permethrin af MdαE7

Permethrin stofskifte blev analyseret af inkubere en 40 µM permethrin standard løsning sammen med MdαE7 proteiner udvundet fra inficerede Sf9 celler. Reaktioner med kat proteiner fungerede som kontrol. Udtynding procentdel af permethrin blev beregnet i forhold til reaktioner uden enzym tilføjet. Reaktioner blev overvåget af omvendt-fase HPLC efter en 120 min inkubationstid. Da permethrin standard er faktisk en blanding af cis - og trans-isomerer, to toppe blev observeret i HPLC kromatografiske profiler, med eluering gange 10,67 min og 10.87 min for trans-permethrin og cis-permethrin, henholdsvis (figur 5). Udtynding procentdel af permethrin af MdαE7 proteiner (39.18±3.78%) var betydeligt højere end i kat proteiner (7.29±0.81%) (Figur 6), der er ikke kun være i overensstemmelse med MTT resultater men også direkte viser funktionerne i MdαE7 i metaboliske permethrin i vitro.

Figure 5
Figur 5: The HPLC profil af permethrin standard. Permethrin standard anvendt i denne undersøgelse er en blanding af trans-permethrin og cis-permethrin isomerer. De røde pile angiver toppe for trans-permethrin isomer og cis-permethrin isomer, henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: In vitro metabolisme af permethrin af MdαE7 og kat rekombinante proteiner. Udtynding procenter af permethrin af MdαE7 og kat proteiner blev beregnet. Tre replikationer blev gennemført for hver permethrin koncentration. Data blev vist som gennemsnit ± SEM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I de seneste årtier, har Heterolog ekspression systemer været udbredt at udtrykke og isolere store mængder proteiner, således at biokemiske og funktionelle beslutsomhed og karakterisering af enzymer i vitro. Til dato har flere forskellige modelsystemer, herunder Escherichia coli, Pichia pastoris, Sacccharomyces cerevisiaeog Spodoptera frugiperda er blevet tilpasset for rekombinante protein udtryk, og valget af de in vitro- system er afgørende for storstilet generation af interesserede proteiner22,23,24,25. I vores undersøgelse, blev en baculovirus-medieret insekt celle udtryk system til at generere hus flyve carboxylesterases valgt, fordi det giver en lignende intracellulære miljø til insekt celler og fastholder nogle vigtige eukaryote databehandling 9. trods fordelene ved en baculovirus-medieret udtrykker system, dets begrænsninger bør også behandles. Baculovirus-medieret insekt celle udtryk system kan producere mål proteiner, kun hvis de insekt celler blev smittet med beregnede rekombinante baculovirus. Den nuværende udvikling skabe stabilt transformerede insekt cellelinjer har gjort det muligt ikke blot at constitutively producere interesseret proteiner i mangel af baculovirus infektion, men også at forbedre celle kapaciteter af glycosylating og folde genererede proteiner gennem engineering ændringer9.

For at bedre undersøge roller som carboxylesterases i metaboliske insekticider i celler og dermed beskytte celler fra kemiske skader, blev MTT analyse udført for at måle celle cytotoksicitet mod forskellige permethrin behandlinger. Under denne proces, kan en masse af eksperimentelle parametre tilknyttet celle metabolisme, såsom celle medium kompositioner, celle vækst, koncentration og forbrug af energi forsyning metabolitter, påvirke MTT-reduktion og dermed fører til unøjagtige resultater. At minimere over / undervurdering af MTT assay, holde cellekulturmedium, celle vækst tilstand og inkubation betingelser konsekvent blandt forskellige eksperimentelle behandlinger26. For at bestemme de celle levedygtighed virkninger forårsaget af baculovirus infektion snarere end permethrin, vi viste, at infektion oparbejde af normal god landbrugspraksis-rekombinant baculovirus til insekt celler, Sf9, og fandt, at på stadiet P2 infektion cellerne har det højeste infektion forholdet med laveste celle død ratio sammenlignet med andre infektion faser (figur 2). Dette kan bedre forklare på grund af vælge celler på P2 infektion stadium at foretage MTT assay.

Ved at sammenligne viabilities af celler, når inficeret af MdαE7 - og kat-rekombinant baculovirus i en MTT undersøgelse, fandt vi en forbedret rentabilitet af celler når at udtrykke MdαE7 proteiner, som kan yde bedre støtte til de metaboliske roller af carboxylesterases til permethrin i insekt celler og beskytter celler mod kemiske skader (figur 4). In vitro- metaboliske undersøgelsen, der er anerkendt som en direkte metode til at afspejle de metaboliske funktioner i carboxylesterases mod insekticider, bør også blevet udforsket at kompensere begrænsningerne af MTT assay i bedre kendetegner protein metaboliske funktioner.

I denne undersøgelse, den Heterolog ekspression af carboxylesterases i insekt Sf9 celler med en baculovirus-medieret ekspressionssystem, måling af celle viabilities mod forskellige permethrin behandlinger af MTT analysen og karakterisering af carboxylesterases gennem en in vitro- stofskifte assay alle arbejde sammen for at give en systematisk, videnskabelig og nøjagtige strategi for at undersøge rollerne af afgiftning enzymer i insekter, således at fremme en bedre forståelse af insekticider resistensmekanismer og derved udvikle innovative strategier for Plantebeskyttelse og skadedyr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs inc. M0491L
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28704
pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli Invitrogen by life technology K240020 S.O.C medium and universal M13 sequence primers were included in this kit.
PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit Invitrogen by life technology K210002
Gateway LR Clonase II Enzyme mix for BaculoDirectTM Kits Invitrogen by life technology 11791-023
BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit Invitrogen by life technology 12562-019 Cellfectin transfection reagent and ganciclovir were included in this kit
pENTR-CAT plasmid Invitrogen by life technology Included in BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit, concentration: 0.5 ug/uL
Heat inactivated Fetal Bovine Serum, Certified Gibco by Life Technologies 10082-139
Sf9 cells in Sf-900 III SFM Gibco by Life Technologies 12659017
Insect Cell-PE LB Insect Cell Protein Extraction & Lysis Buffer G Biosciences by A Geno Technology Inc 786-411
Sf-900 III SFM (1×) Serum Free Medium Complete Gibco by Life Technologies 12658-019
Grace's Insect Medium, unsupplemented Gibco by Life Technologies 11595030
Permethrin (isomers) analytical standard SUPELCO by Solutions WithinTM 442748
Methanol (analytical graded) Sigma-Aldrich 67-56-1
Acetonitrile (analytical graded) Sigma-Aldrich 75-05-8
GHP Acrodisc 25 mm Syringe Filters with 0.45 μm GHP Membrane (HPLC Certified) Pall Life Sciences 21890388
Alliance Waters 2695 HPLC System Waters
T100 Thermal Cycle Bio-Rad Laboratories Inc. 1861096
Nanodrop 2000/2000c Spectrophotometers ThermoFisher Scientific ND2000CLAPTOP
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader BioTek

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scott, J. G., et al. Insecticide resistance in house flies from the United States: Resistance levels and frequency of pyrethroid resistance alleles. Pesticide Biochemistry and Physiology. 107, (3), 377-384 (2013).
  2. Li, M., et al. A whole transcriptomal linkage analysis of gene co-regulation in insecticide resistant house flies, Musca domestica. BMC Genomics. 14, 803 (2013).
  3. Liu, N. Insecticide resistance in mosquitoes: impact, mechanisms, and research directions. Annual Review of Entomology. 60, 537-559 (2015).
  4. Grigoraki, L., et al. Transcriptome profiling and genetic study reveal amplified carboxylesterase genes implicated in temephos resistance, in the Asian tiger mosquito Aedes albopictus. e0003771. 9, e0003771 (2015).
  5. Grigoraki, L., et al. Carboxylesterase gene amplifications associated with insecticide resistance in Aedes albopictus: Geographical distribution and evolutionary origin. PLOS Neglected Tropical Diseases. 11, e0005533 (2017).
  6. Wheelock, C., Shan, G., Ottea, J. Overview of carboxylesterases and their role in the metabolism of insecticides. Journal of Pesticide Science. 30, 75-83 (2005).
  7. Feng, X., Li, M., Liu, N. Carboxylesterase genes in pyrethroid resistant house flies, Musca domestica. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 92, 30-39 (2018).
  8. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 65, (1-2), 55-63 (1983).
  9. Jarvis, D. L. Baculovirus-insect cell expression systems. Methods in Enzymology. 463, 191-222 (2009).
  10. Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nature Biotechnology. 22, (12), 1583 (2004).
  11. Gong, Y., Li, T., Feng, Y., Liu, N. The function of two P450s, CYP9M10 and CYP6AA7, in the permethrin resistance of Culex quinquefasciatus. Scientific Reports. 7, (1), 587 (2017).
  12. Cao, C. W., Zhang, J., Gao, X. W., Liang, P., Guo, H. L. Overexpression of carboxylesterase gene associated with organophosphorous insecticide resistance in cotton aphids, Aphis gossypii (Glover). Pesticide Biochemistry and Physiology. 90, (3), 175-180 (2008).
  13. Zhang, L., Gao, X., Liang, P. Beta-cypermethrin resistance associated with high carboxylesterase activities in a strain of house fly, Musca domestica (Diptera: Muscidae). Pesticide Biochemistry and Physiology. 89, 65-72 (2007).
  14. Van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. Cell sensitivity assays: the MTT assay. Cancer cell culture. Humana Press. 237-245 (2011).
  15. Stockert, J. C., Blázquez-Castro, A., Cañete, M., Horobin, R. W., Villanueva, Á MTT assay for cell viability: Intracellular localization of the formazan product is in lipid droplets. Acta Histochemica. 114, (8), 785-796 (2012).
  16. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. A3-B (2001).
  17. Riss, T. L., Moravec, R. A., Niles, A. L., Duellman, S., Benink, H. A., Worzella, T. J., Minor, L. Cell viability assays. Assay Guidance Manual. (2013).
  18. Wheelock, C. E., Shan, G., Ottea, J. Overview of carboxylesterases and their role in the metabolism of insecticides. Journal of Pesticide Science. 30, (2), 75-83 (2005).
  19. Li, X., Schuler, M. A., Berenbaum, M. R. Molecular mechanisms of metabolic resistance to synthetic and natural xenobiotics. Annual Review of Entomology. 52, 231-253 (2007).
  20. Nakamura, Y., et al. The in vitro metabolism of a pyrethroid insecticide, permethrin, and its hydrolysis products in rats. Toxicology. 235, (3), 176-184 (2007).
  21. Kruger, N. J. The Bradford method for protein quantitation. The protein protocols handbook. Humana Press. 15-21 (2002).
  22. Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast. 22, (4), 249-270 (2005).
  23. Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nature Biotechnology. 22, (12), 1583 (2004).
  24. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 72, (2), 211 (2006).
  25. Bulter, T., et al. Functional expression of a fungal laccase in Saccharomyces cerevisiae by directed evolution. Applied Microbiology and Biotechnology. 69, (2), 987-995 (2003).
  26. Stepanenko, A. A., Dmitrenko, V. V. Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability. Gene. 574, (2), 193-203 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics