Summary
يصف هذا البروتوكول استخدام كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة (ITC) لتحليل حركية الارتباط والتفكك للربط بين أبتامر الحمض النووي والتتراسيكلين، بما في ذلك إعداد العينات، وتشغيل المعايير والعينات، وتفسير البيانات الناتجة.
Abstract
إن تحديد التقارب والسلوك الملزم بين aptamer وهدفه هو الخطوة الأكثر أهمية في اختيار واستخدام aptamer للتطبيق. نظرا للاختلافات الجذرية بين الأبتامر والجزيئات الصغيرة ، يحتاج العلماء إلى بذل الكثير من الجهد في توصيف خصائصها الملزمة. يعد كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة (ITC) نهجا قويا لهذا الغرض. يتجاوز ITC تحديد ثوابت الانفصال (Kd) ويمكن أن يوفر تغيرات المحتوى الحراري وقياس stoichiometry المرتبط للتفاعل بين جزيئين في مرحلة الحل. يجري هذا النهج معايرة مستمرة باستخدام جزيئات خالية من الملصقات ويسجل الحرارة المنبعثة بمرور الوقت على أحداث الربط التي تنتجها كل معايرة بالتحليل الحجمي ، بحيث يمكن للعملية قياس الارتباط بين الجزيئات الكبيرة وأهدافها الصغيرة بحساسية. هنا ، تقدم المقالة إجراء خطوة بخطوة لقياس ITC ل aptamer مختار مع هدف صغير ، التتراسيكلين. يثبت هذا المثال براعة التقنية وإمكاناتها للتطبيقات الأخرى.
Introduction
Aptamers هي شظايا ssDNA أو RNA يتم اختيارها من خلال عملية تطور ذات تقارب وخصوصية عالية الارتباط بالأهداف المرجوة1,2 ، والتي يمكن أن تعمل كعناصر التعرف المتقدمة أو الأجسام المضادة الكيميائية 3,4,5. وبالتالي ، فإن التقارب والخصوصية الملزمين ل aptamers لأهدافهم يلعبان دورا حاسما في اختيار وتطبيق aptamer ، وقد تم استخدام كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة (ITC) على نطاق واسع لأغراض التوصيف هذه. تم استخدام العديد من الأساليب لتحديد تقارب aptamers ، بما في ذلك ITC ، ورنين البلازمون السطحي (SPR) ، والمعايرة بالتحليل الحجمي اللوني ، والرحلان الحراري المجهري (MST) ، وقياس تداخل الطبقة الحيوية (BLI). من بينها ، ITC هي واحدة من أحدث التقنيات لتحديد الارتباط الديناميكي الحراري والحركي لجزيئين في مرحلة الحل. يقوم هذا النهج بإجراء معايرة مستمرة باستخدام جزيئات خالية من الملصقات ويسجل الحرارة المنبعثة بمرور الوقت على أحداث الربط الناتجة عن كل معايرة 6,7. وخلافا للطرق الأخرى، يمكن لمركز التجارة الدولية أن يوفر تقاربا ملزما، والعديد من مواقع الربط، والارتباط الديناميكي الحراري والحركي (الشكل 1 ألف). من هذه المعلمات الأولية ، يتم تحديد تغيرات الطاقة الحرة Gibbs وتغيرات الإنتروبيا باستخدام العلاقة التالية:
ΔG = ΔH-TΔS
وهذا يعني أن مركز التجارة الدولية يقدم لمحة ديناميكية حرارية كاملة للتفاعل الجزيئي لتوضيح آليات الربط (الشكل 1B). من الصعب تحديد تقارب الارتباط للجزيئات الصغيرة ذات الأبتامر بسبب الأحجام المختلفة بشكل كبير بين أبتامر والهدف. وفي الوقت نفسه ، يمكن أن يوفر مركز التجارة الدولية قياسا حساسا دون وضع علامات على الجزيئات وشل حركتها ، مما يوفر وسيلة للحفاظ على البنية الطبيعية للأبتيمر والهدف أثناء القياس. مع السمات المذكورة ، يمكن استخدام ITC كطريقة قياسية لتوصيف الارتباط بين aptamer والأهداف الصغيرة.
بعد الاختيار من قبل مجموعة Gu ، تم دمج هذا aptamer مع منصات مختلفة ، بما في ذلك أجهزة الاستشعار الحيوية الكهروكيميائية القائمة على aptamer ، وفحص aptamer المرتبط بالإنزيم التنافسي ، ولوحة microtiter ، والتي يمكن أن تحقق كشفا عالي الإنتاجية للتتراسيكلين 8,9,10. ومع ذلك ، لم يتم توضيح خصائصه الملزمة بشكل جيد بما يكفي لاختيار النظام الأساسيالمناسب 8 ؛ يجدر توصيف ربط الأبتامر بالتتراسيكلين باستخدام ITC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: يوضح الشكل 2 الخطوات الرئيسية لتجربة مركز التجارة الدولية لتحديد الارتباط الديناميكي الحراري والحركي لأبتمير الحمض النووي والتتراسيكلين.
1. إعداد العينات
ملاحظة: يجب إعداد عينات لمركز التجارة الدولية في نفس المخزن المؤقت لكل من الأبتامر والليغاند لتجنب إطلاق الحرارة الناجم عن خلط مخازن مؤقتة مختلفة من خلية العينة والمحقنة. ويتحقق ذلك عادة من خلال غسيل الكلى لجميع المواد في نفس المخزن المؤقت. يتم تبادل المخزن المؤقت باستخدام بروتوكول مقتبس من بروتوكول مكثف قطع الوزن الجزيئي 3 kDa (MWC) مع بعض التعديلات ، على النحو التالي:
- قم بتنشيط غشاء عمود غسيل الكلى (3 kDa MWC) باستخدام 1x PBS ، الرقم الهيدروجيني 7.4 ، الذي تم شراؤه من الشركة المصنعة ، باستخدام الخطوات التالية: املأ بمخزن مؤقت 1x (PBS) ، وتوازن لمدة 10 دقائق في RT ، وأجهزة طرد مركزي عند 5000 × g لمدة 15 دقيقة.
- قم بإزالة المخزن المؤقت وتحميل 500 ميكرولتر من عينات aptamer في العمود ، وأجهزة الطرد المركزي عند 5000 × g ، وكررها 4x لاستبدال المخزن المؤقت الأصلي ب 1x PBS. عندما يمر المخزن المؤقت عبر الغشاء ، ستمر جميع الجزيئات ذات الكتلة الأقل من 3 kDa عبر الغشاء ، وسيبقى aptamer على الجانب العلوي من الغشاء.
- اجمع أبتامر الحمض النووي المشوه باستخدام ماصة وانقله إلى أنبوب (أنابيب) 1.5 مل الجديد.
- جمع المخزن المؤقت تدفق الأخير لإذابة التتراسيكلين. مسحوق التتراسيكلين نقي وصغير ، لذلك ليست هناك حاجة إلى غسيل الكلى. ومع ذلك ، استخدم المخزن المؤقت السابق للحمض النووي للهدف للتأكد من أن المخزن المؤقت للتجربة في المحقنة يتطابق مع المخزن المؤقت في الخلية المرجعية.
- حدد تركيز أبتامر مرة أخرى باستخدام مطياف مرئي للأشعة فوق البنفسجية. استخدم المخزن المؤقت الأخير للتبادل لضبط التركيز على 40 ميكرومتر تتراسيكلين و 2 ميكرومتر أبتامر.
- قم بطي أبتامر الحمض النووي عن طريق التسخين عند 90 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، والتبريد عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق ، ثم العودة إلى RT لمدة 20 دقيقة.
- قم بتفريغ الأبتامر المطوي والتتراسيكلين الديالي باستخدام محطة إزالة الغاز أو مضخة تفريغ تم ضبطها على 600 مم زئبق عند 25 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة للقضاء على الغازات الذائبة.
2. غسل الأداة وتشغيل مجموعة الاختبار
- قم بتنظيف منافذ المذيبات لضمان وضوح مسار العينة بالكامل. نظف عن طريق التخلص من محلول النفايات وتحميلها بالميثانول النقي والماء والعازل. يحتوي كل منفذ على أكثر من 250 مل لضمان حل كاف للتنظيف.
ملاحظة: يتم إكمال عملية التنظيف تلقائيا بواسطة برنامج تحكم ITC قابل للبرمجة من قبل المستخدم. - اختبر نظافة الجهاز عن طريق تشغيل ITC باستخدام المخزن المؤقت في مخزن مؤقت (أي 1x PBS إلى 1x PBS).
ملاحظة: يظهر خط أساس الضوضاء العادي بين المخزن المؤقت الصغير إلى قمم حقن المخزن المؤقت. عندما يتم تنظيف حقنة المعايرة بالتحليل الحجمي والقنية بشكل كاف وجافة تماما ، سيكون خط الأساس مستقرا ؛ تعكس الزيادة أو النقصان في خط الأساس الأجهزة أو الفقاعات القذرة داخل الأداة ، والتي تحتاج إلى تصحيح قبل تشغيل العينات الفعلية. - اختبر دقة الجهاز باستخدام مجموعة قياسية تتضمن EDTA و CaCl2 (الشكل 3) ، باستخدام البرنامج الافتراضي واتباع الإرشادات الواردة من الشركة المصنعة.
3. تشغيل العينة لتحديد الارتباط بين أبتامر والتتراسيكلين
- قم بإعداد معلمات التشغيل: معدل تحريك يبلغ 200 دورة في الدقيقة ، يعمل عند 25 درجة مئوية ، 2 μM aptamer و 40 μM tetracycline ، 30 حقنة مع 2.0 ميكرولتر لكل منهما ، وقت تأخير 180 ثانية.
- تحقق من وحدات التخزين المطلوبة باستخدام آلة حاسبة برنامج قيد التشغيل. باستخدام معلمة التشغيل هذه ، قم بإجراء قياس ITC باستخدام 230 ميكرولتر من 40 ميكرومتر من التتراسيكلين في حقنة ITC و 485 ميكرولتر من 2 ميكرومتر aptamer في خلية عينة ITC باستخدام ITC.
- قم بتحميل ألواح حقنة التتراسيكلين المائلة والأبتامر المطوي في خلية العينة ، وتجنب الفقاعات ، باستخدام ماصة.
- ابدأ تشغيل أداة ITC بالنقر فوق زر البدء الموجود في البرنامج.
ملاحظة: تتم عملية تشغيل أداة ITC مؤتمتة بالكامل بعد ملء الخلية المرجعية وألواح عينات المعايرة يدويا.
4. تحليل البيانات باستخدام البرامج
- افتح برنامج تحليل البيانات بالنقر المزدوج لبدء تحليل البيانات.
- افتح مسار البيانات الخام المحفوظة لمعرفة ميل الربط.
- افتح علامة تبويب النمذجة واستخدم نماذج ربط مختلفة للعثور على أفضل ملاءمة لمنحنى البيانات. بعد ذلك ، يقوم البرنامج تلقائيا بحساب مخطط الحرارة ITC ومختلف المعلمات الديناميكية الحرارية ، بما في ذلك المحتوى الحراري (ΔH) ، والانتروبيا (ΔS) ، والطاقة الحرة (ΔG) ، وثابت ربط التوازن (Ka) ، و stoichiometry.
- جمع المعلمات الديناميكية الحرارية المحددة من البيانات ومعلومات نموذج التركيب.
- قم بإنشاء تقرير، يتضمن صورا للمخطط الحراري لمركز التجارة الدولية ومختلف المعلمات الديناميكية الحرارية، كما هو موضح في الشكل 4 والجدول 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوفر ITC ثابت فك ارتباط دقيق (Kd) ، وقياس stoichiometry ملزم ، والمعلمات الديناميكية الحرارية للتفاعلات ثنائية الجزيء6. في هذا المثال، يرتبط الأبتامر الذي اختاره كيم وآخرون.9,11 بالتتراسيكلين مع تقاربات ملزمة من K d 1 = 13 μM، K d 2 = 53 nM. ومن المثير للاهتمام ، تم تحديد هذا الربط باستخدام طريقة ترشيح التوازن و Kd المبلغ عنه من 63.3 نانومتر ، والذي لا يختلف كثيرا عن موقع الربط المواتي (الموقع 2). ويعكس نموذج التركيب وقياس الستويشيومتري من مركز التجارة الدولية أن الأبتامر يرتبط بالتتراسيكلين من خلال نسبة ربط 2: 1 مع نموذج الربط المتسلسل (الشكل 4، الجدول 1).
وأشارت البارامترات الدينامية الحرارية التي حددها قياس مركز التجارة الدولية للموقع 2 (ΔH = -1200 kcal/mol و-TΔS = 99.75 kcal/mol) إلى أن تغلب المحتوى الحراري على فقدان انتروبي كبير نسبيا يدفع الربط القوي. يرتبط الارتباط المدفوع بالمحتوى الحراري مع فقدان الإنتروبيا بالتغيرات التوافقية للحمض النووي الريبي ، والتي تم الإبلاغ عنها كسلوكيات ربط بين الحمض النووي الريبي وجزيء صغير. على سبيل المثال ، أبلغ Thoa et al. عن مثل هذا السلوك الملزم (ΔH = -27 kcal / mol و -TΔS = +17 kcal / mol) بين aptamer RNA و Ru (bpy) 312. إلى جانب ذلك، أشار هورويتز وآخرون إلى أن الارتباط المدفوع بالإنتروبيا يرتبط بتقاطع البروفلافين مع أوليغونوكليوتيد (ΔH = -2.6 كيلو كالوري/مول و-TΔS = -3.3 كيلو كالوري/مول)13. بناء على هذه المقارنات ، يعمل aptamer مع سلوك هيكلي للتبديل على الربط المدفوع بالمحتوى الحراري ، مما يسمح باستخدام aptamer كاعتراف لتطوير مستشعر مباشر.
الشكل 1: ثابت فك الارتباط الملزم (Kd) والمظهر الديناميكي الحراري. (أ) يحدد مركز التجارة الدولية ثابت فك الارتباط المرتبط (Kd) والمظهر الديناميكي الحراري، بما في ذلك التغير في المحتوى الحراري (ΔH) والتغير في الإنتروبيا (ΔS). (ب) يوفر المظهر الديناميكي الحراري قوة وآلية التفاعل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الخطوات الرئيسية لتجربة مركز التجارة الدولية. يوضح المخطط الخطوات الرئيسية لتجربة ITC لتحديد الارتباط الديناميكي الحراري والحركي لأبتمير الحمض النووي والتتراسيكلين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: اختبار ITC القياسي بين EDTA و CaCl2. تم استخدام استخلاب Ca2 + -EDTA كرد فعل قياسي للتحقق من صحة ITC. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: مخطط الحرارة ITC لأبتامر الحمض النووي والتتراسيكلين. يعكس النموذج المناسب للارتباط الديناميكي الحراري والحركي أن الربط له موقعان مستقلان للربط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| موقعان متتابعان | د.ك (م) | 1.359 × 10-5 |
| د.ك (م) | 5.378 × 10-8 | |
| ΔH (كيلو كالوري / مول) | 1223 | |
| ΔH (كيلو كالوري / مول) | -1200 | |
| كا (Mˉ¹) | 7.358 × 104 | |
| كا (Mˉ¹) | 1.859 × 107 | |
| ΔS (كالوري / مول K) | 4.123 × 103 | |
| ΔS (كالوري / مول K) | -3.992 × 103 |
الجدول 1: معلمات الارتباط بين أبتامر والتتراسيكلين. يمكن تحديد العديد من المعلمات الديناميكية الحرارية ، بما في ذلك المحتوى الحراري (ΔH) ، والانتروبيا (ΔS) ، والطاقة الحرة (ΔG) ، وثابت ربط التوازن (Ka) ، وقياس stoichiometry ، من خلال آلية ربط جزيئين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تم تعديل الطريقة المعروضة هنا وفقا لتعليمات من TA Instruments وهي كافية لتحديد تقارب الارتباط والديناميكا الحرارية للعديد من aptamers والأهداف المختارة في مركزنا. تتضمن الخطوات الحاسمة من هذا الإجراء تبادل المخزن المؤقت للحصول على هدف يطابق الرباط ، وتشغيل العينات بمعلمات مناسبة ، وإيجاد نموذج مناسب مناسب لتحليل البيانات. يتطلب التسجيل المستمر لإطلاق الحرارة القضاء على جميع حرارة الضوضاء ، مثل عدم تطابق المخزن المؤقت ، وقذارة الخلية والمحقنة ، والفقاعات داخل العينات. في خطوة التبادل العازل ، من الأفضل استخدام آخر مخزن مؤقت لغسيل الكلى أو مخزن مؤقت للتدفق في غشاء غسيل الكلى أو عمود الدوران لإذابة الليجند لأنه من المكلف تبادل الجزيئات الصغيرة مباشرة.
تفترض معظم طرق تحديد التقارب الملزمة الأخرى نسبة ربط 1: 1 بين aptamer و ligand. ومع ذلك ، نظرا لسلوك الربط والحجم المختلف بشكل كبير بين الجزيئات الصغيرة و aptamers ، فإن نموذج الربط 1: 1 ليس دائما دقيقا14,15. في هذا الجانب ، يمكن لمركز التجارة الدولية تقديم بيانات عن قياس stoichiometry الملزم لمعرفة عدد مواقع الربط وإعطاء معلومات حول سلوك الربط 7,15. ويمكن توفير هذه الوظيفة المتقدمة باستخدام نموذج الربط الصحيح من برنامج تحليل مركز التجارة الدولية، إما نموذج الربط في موقع واحد أو موقعين. يمكن تحليل نقطة مشبعة واحدة بنسبة ربط مختلفة تبلغ 1:1 (موقع ربط واحد) أو 1:2 أو 0.5:1 (موقعان للربط). بالنسبة للنموذج المتسلسل ، لا يوجد موقع مشبع متميز ولكن فقط عدد إجمالي من المواقع المشبعة. إذا كانت المواقع متطابقة ، فإن البيانات تتناسب مع التشبع التسلسلي. هناك ، يحتوي موقع التجليد الأول على نسخ فارغة من نفس النوع للاختيار من بينها أكثر من الموقع الثاني ، كما يتضح من انخفاض الطاقة الحرارية المنبعثة من موقع إلى آخر14،15،16. تحدد معلمات الربط ثابت الربط K لكل موقع ربط. في هذه الحالة ، يظهر الارتباط بموقعين متتابعين للربط ، مما يؤكد التغير التوافقي في الجزيء الكلي. على الرغم من أن ITC يقدم العديد من الوظائف المتقدمة لتوصيف الارتباط بين aptamer والجزيئات الصغيرة ، إلا أن عملية التحسين التي تتمتع بظروف جيدة تكلف وقتا7،16،17. إلى جانب ذلك ، بالمقارنة مع الأدوات الأخرى ، فإن معدات ITC باهظة الثمن وتتطلب مناولة من قبل فني مدرب تدريبا جيدا.
في معظم الحالات ، يعد تحديد التقارب الملزم بين aptamer و ligand جزيء صغير أمرا صعبا. ويمكن اعتبار مركز التجارة الدولية طريقة متقدمة لهذا الغرض لأن المركز يوفر تقاربات ملزمة دقيقة للغاية، فضلا عن معلومات دينامية حرارية. من هذه المعلومات ، يمكننا التنبؤ بسلوكها لاستخدامها في الاستخدام السريري أو الكشف. على سبيل المثال ، مع aptamer المحدد مع موقعين ملزمين ، يمكننا اقتطاعه للحفاظ على موقع ربط واحد إذا كان موقع واحد غير موات للربط ، أو يمكننا تقسيم aptamer إلى اثنين من aptamers إذا كان كلا الموقعين الملزمين لهما نفس السلوك. أيضا ، مع سلوك تغيير بنية التشكيل ، يمكننا الجمع بين aptamer ومنصة التبريد لتطوير جهاز استشعار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن أي مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
تم دعم هذا البحث من قبل تمويل البحث والتطوير من Aptagen LLC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3' |
Integrated DNA Technologies, Inc | The sequence is adopted from Gu's research, which has not identified Kd using ITC (refer references 8 and 9) | |
| Affinity ITC Auto Low Volume (190 µL) System Complete–Gold Cells | TA Instruments | 61000.901 | Isothermal titration calorimetry system |
| CaCl2 | Avantor (VWR) | E506-100ML | Calcium chloride 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | The Eppendorf 5417R is unsurpassed in safety, reliability and ease-of-use. Very easy to maintain with a brushless motor that spins up to 16,400 RPM with maximum RCF up to 25,000 x g. |
| Complete Degassing Station (110/230V) | TA Instruments | 6326 | This degasser provides a self-contained stirring platform, vacuum chamber, vacuum port, temperature control and electronic timer for proper sample preparation. |
| EDTA | TekNova | E0375 | EDTA 500 mM, pH 7.5 |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-ONE-W | UV-Vis Spectrophotometer |
| Nanosep, Nanosep MF and NAB Centrifugal Devices | Pall Laboratory | OD030C34 | 3 kDa molecular weight cutoff concentrator |
| PBS pH 7.4 | IBI Scientific | IB70165 | Buffer containing Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate, and Potassium chloride Ultra-Pure Grade Sterile filtered using 0.2 µm filter. Autoclaved at 121 °C for greater than 20 min. |
| Posi-Click 1.7 mL Large Cap Microcentrifuge Tubes | labForce (a Thomas Scientific Brand) | 1149K01 | |
| Tetracycline, Hydrochoride | EMD Millipore Corperation | CAS64-75-5 |
References
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
- Kim, S. H., Thoa, T. T. T., Gu, M. B. Aptasensors for environmental monitoring of contaminants in water and soil. Current Opinion in Environmental Science & Health. 10, 9-21 (2019).
- Dunn, M. R., Jimenez, R. M., Chaput, J. C. Analysis of aptamer discovery and technology. Nature Reviews Chemistry. 1, 0076 (2017).
- Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. SELEX--A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomolecular Engineering. 24 (4), 381-403 (2007).
- Wang, Y., Wang, G., Moitessier, N., Mittermaier, A. K. Enzyme kinetics by isothermal titration calorimetry: Allostery, inhibition, and dynamics. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 583826 (2020).
- Velazquez-Campoy, A., Freire, E. Isothermal titration calorimetry to determine association constants for high-affinity ligands. Nature Protocols. 1 (1), 186-191 (2006).
- Niazi, J. H., Lee, S. J., Gu, M. B. Single-stranded DNA aptamers specific for antibiotics tetracyclines. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 16 (15), 7245-7253 (2008).
- Kim, Y. J., Kim, Y. S., Niazi, J. H., Gu, M. B. Electrochemical aptasensor for tetracycline detection. Bioprocess and Biosystems Engineering. 33 (1), 31-37 (2010).
- Wang, S., et al. Development of an indirect competitive assay-based aptasensor for highly sensitive detection of tetracycline residue in honey. Biosensors & Bioelectronics. 57, 192-198 (2014).
- Kim, Y. S., et al. A novel colorimetric aptasensor using gold nanoparticle for a highly sensitive and specific detection of oxytetracycline. Biosensors & Bioelectronics. 26 (4), 1644-1649 (2010).
- Thoa, T. T., Minagawa, N., Aigaki, T., Ito, Y., Uzawa, T. Regulation of photosensitisation processes by an RNA aptamer. Scientific Reports. 7, 43272 (2017).
- Horowitz, E. D., Lilavivat, S., Holladay, B. W., Germann, M. W., Hud, N. V. Solution structure and thermodynamics of 2',5' RNA intercalation. Journal of the American Chemical Society. 131 (16), 5831-5838 (2009).
- Sigurskjold, B. W. Exact analysis of competition ligand binding by displacement isothermal titration calorimetry. Analytical Biochemistry. 277 (2), 260-266 (2000).
- Neves, M. A. D., Slavkovic, S., Churcher, Z. R., Johnson, P. E. Salt-mediated two-site ligand binding by the cocaine-binding aptamer. Nucleic Acids Research. 45 (3), 1041-1048 (2017).
- Turnbull, W. B., Daranas, A. H. On the value of c: Can low affinity systems be studied by isothermal titration calorimetry. Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14859-14866 (2003).
- Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).
