Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt die Verwendung der isothermen Titrationskalorimetrie (ITC) zur Analyse der Assoziation und Dissoziationskinetik der Bindung zwischen einem DNA-Aptamer und Tetracyclin, einschließlich Probenvorbereitung, Ausführung von Standards und Proben und Interpretation der resultierenden Daten.
Abstract
Die Bestimmung der Bindungsaffinität und des Bindungsverhaltens zwischen einem Aptamer und seinem Ziel ist der wichtigste Schritt bei der Auswahl und Verwendung eines Aptamers für die Anwendung. Aufgrund der drastischen Unterschiede zwischen dem Aptamer und kleinen Molekülen müssen Wissenschaftler viel Aufwand betreiben, um ihre Bindungseigenschaften zu charakterisieren. Die isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) ist ein leistungsfähiger Ansatz für diesen Zweck. ITC geht über die Bestimmung von Dissoziationskonstanten (Kd) hinaus und kann die Enthalpieänderungen und die Bindungsstöchiometrie der Wechselwirkung zwischen zwei Molekülen in der Lösungsphase liefern. Dieser Ansatz führt eine kontinuierliche Titration mit markierungsfreien Molekülen durch und zeichnet die im Laufe der Zeit freigesetzte Wärme bei den Bindungsereignissen auf, die bei jeder Titration erzeugt werden, so dass der Prozess die Bindung zwischen Makromolekülen und ihren kleinen Zielen empfindlich messen kann. Hier stellt der Artikel ein schrittweises Verfahren der ITC-Messung eines ausgewählten Aptamers mit einem kleinen Ziel, Tetracyclin, vor. Dieses Beispiel beweist die Vielseitigkeit der Technik und ihr Potenzial für andere Anwendungen.
Introduction
Aptamere sind ssDNA- oder RNA-Fragmente, die durch einen Evolutionsprozess mit hoher Bindungsaffinität und Spezifität zu den gewünschten Zielen 1,2 selektiert werden, die als fortgeschrittene Erkennungselemente oder chemische Antikörper 3,4,5 wirken können. Daher spielen die Bindungsaffinität und Spezifität von Aptameren an ihre Ziele eine entscheidende Rolle bei der Auswahl und Anwendung eines Aptamers, und die isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) wurde für diese Charakterisierungszwecke häufig verwendet. Viele Ansätze wurden verwendet, um die Affinität von Aptameren zu bestimmen, einschließlich ITC, Oberflächenplasmonenresonanz (SPR), kolorimetrische Titration, mikroskalige Thermophorese (MST) und Bio-Schichtinterferometrie (BLI). Unter ihnen ist ITC eine der neuesten Techniken, um die thermodynamische und kinetische Assoziation von zwei Molekülen in der Lösungsphase zu bestimmen. Dieser Ansatz führt eine kontinuierliche Titration unter Verwendung markierungsfreier Moleküle durch und zeichnet die im Laufe der Zeit freigesetzte Wärme bei den bei jeder Titration erzeugten Bindungsereignissen auf 6,7. Im Gegensatz zu anderen Methoden kann ITC Bindungsaffinität, mehrere Bindungsstellen sowie thermodynamische und kinetische Assoziationen bieten (Abbildung 1A). Aus diesen Anfangsparametern werden die Gibbs-Änderungen der freien Energie und die Entropieänderungen unter Verwendung der folgenden Beziehung bestimmt:
ΔG = ΔH-TΔS
Das bedeutet, dass ITC ein vollständiges thermodynamisches Profil der molekularen Wechselwirkung bietet, um die Bindungsmechanismen aufzuklären (Abbildung 1B). Die Bestimmung der Bindungsaffinität für kleine Moleküle mit einem Aptamer ist aufgrund der drastisch unterschiedlichen Größen zwischen Aptamer und Target schwierig. In der Zwischenzeit kann ITC empfindliche Messungen ohne Markierung und Immobilisierung von Molekülen durchführen, was ein Mittel bietet, die natürliche Struktur des Aptamers und des Ziels während der Messung beizubehalten. Mit den genannten Attributen kann ITC als Standardmethode zur Charakterisierung der Bindung zwischen einem Aptamer und kleinen Targets verwendet werden.
Nach der Auswahl durch die Gu-Gruppe wurde dieses Aptamer in verschiedene Plattformen integriert, darunter elektrochemische Aptamer-basierte Biosensoren, ein kompetitiver enzymgebundener Aptamer-Assay und eine Mikrotiterplatte, die einen Hochdurchsatznachweis von Tetracyclin 8,9,10 erreichen kann. Seine Bindungseigenschaften sind jedoch nicht gut genug aufgeklärt, um die richtige Plattform8 zu wählen; Es lohnt sich, die Bindung des Aptamers an das Tetracyclin mittels ITC zu charakterisieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
HINWEIS: Abbildung 2 zeigt die Hauptschritte des ITC-Experiments zur Bestimmung der thermodynamischen und kinetischen Assoziation eines DNA-Aptamers und Tetracyclins.
1. Vorbereitung der Proben
HINWEIS: Proben für ITC müssen im selben Puffer für Aptamer und Ligand vorbereitet werden, um eine Wärmefreisetzung durch das Mischen verschiedener Puffer aus der Probenzelle und der Spritze zu vermeiden. Dies wird typischerweise durch Dialyse aller Materialien in denselben Puffer erreicht. Der Puffer wird unter Verwendung eines Protokolls ausgetauscht, das vom Protokoll eines 3 kDa Molekulargewichts-Cutoff-Konzentrators (MWC) mit einigen Modifikationen angepasst ist, wie folgt:
- Aktivieren Sie die Membran der Dialysersäule (3 kDa MWC) mit 1x PBS, pH 7,4, vom Hersteller gekauft, wie folgt: mit 1x Puffer (PBS) füllen, 10 min bei RT ausgleichen und bei 5.000 x g 15 min zentrifugieren.
- Entfernen Sie den Puffer und laden Sie 500 μL Aptamerproben in die Säule, zentrifugieren Sie bei 5.000 x g und wiederholen Sie es 4x, um den ursprünglichen Puffer gegen 1x PBS auszutauschen. Wenn der Puffer durch die Membran geht, gehen alle Moleküle mit einer Masse von weniger als 3 kDa durch die Membran, und das Aptamer bleibt auf der Oberseite der Membran.
- Sammeln Sie das dialysierte DNA-Aptamer mit einer Pipette und übertragen Sie es in die neuen 1,5-ml-Röhrchen.
- Sammeln Sie den letzten Durchflusspuffer, um Tetracyclin aufzulösen. Tetracyclinpulver ist rein und klein, so dass keine Dialyse erforderlich ist. Verwenden Sie jedoch den vorherigen dialysierten DNA-Puffer für das Ziel, um sicherzustellen, dass der Puffer für das Experiment in der Spritze mit dem Puffer in der Referenzzelle übereinstimmt.
- Bestimmen Sie die Aptamerkonzentration erneut mit einem UV-sichtbaren Spektrometer. Verwenden Sie den letzten Austauschpuffer, um die Konzentration auf 40 μM Tetracyclin und 2 μM Aptamer einzustellen.
- Falten Sie das DNA-Aptamer, indem Sie es 10 min lang bei 90 °C erhitzen, 10 min bei 4 °C abkühlen und dann für 20 min auf RT zurückkehren.
- Entgasen Sie das gefaltete Aptamer und das dialysierte Tetracyclin mit einer Entgasungsstation oder Vakuumpumpe, die auf 600 mmHg bei 25 °C eingestellt ist, für 25 Minuten, um gelöste Gase zu entfernen.
2. Waschen des Geräts und Ausführen des Testkits
- Reinigen Sie die Lösungsmittelkanäle, um sicherzustellen, dass der gesamte Probenweg frei ist. Reinigen Sie, indem Sie die Abfalllösung entsorgen und mit reinem Methanol, Wasser und Puffer beladen. Jeder Port enthält mehr als 250 ml, um genügend Reinigungslösung zu gewährleisten.
HINWEIS: Der Reinigungsprozess wird automatisch durch eine vom Benutzer programmierbare ITC-Steuerungssoftware abgeschlossen. - Testen Sie die Sauberkeit der Maschine, indem Sie ITC mit buffer in einen Puffer ausführen (dh 1x PBS in 1x PBS).
HINWEIS: Eine normale Rauschgrundlinie ist zwischen dem winzigen Puffer in Pufferinjektionsspitzen sichtbar. Wenn die Titrationsspritze und die Kanülen ausreichend gereinigt und vollständig trocken sind, ist die Grundlinie stabil; Eine Zunahme oder Abnahme der Baseline spiegelt verschmutzte Instrumente oder Blasen im Inneren des Instruments wider, die korrigiert werden müssen, bevor die eigentlichen Proben ausgeführt werden können. - Testen Sie die Genauigkeit des Geräts mit einem Standardkit, das EDTA und CaCl2 enthält (Abbildung 3), verwenden Sie das Standardprogramm und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers.
3. Ausführen der Probe zur Bestimmung der Bindung zwischen Aptamer und Tetracyclin
- Stellen Sie die Laufparameter ein: eine Rührrate von 200 U/min bei 25 °C, 2 μM Aptamer und 40 μM Tetracyclin, 30 Injektionen à 2,0 μL, eine Verzögerungszeit von 180 s.
- Überprüfen Sie die benötigten Volumes mit einem laufenden Programmrechner. Mit diesem Laufparameter führen Sie eine ITC-Messung mit 230 μL 40 μM Tetracyclin in der ITC-Spritze und 485 μL 2 μM Aptamer in der ITC-Probenzelle unter Verwendung der ITC durch.
- Laden Sie die dialysierten Tetracyclin-Spritzenplatten und das gefaltete Aptamer mit einer Pipette unter Vermeidung von Blasen in die Probenzelle.
- Starten Sie den Betrieb des ITC-Geräts, indem Sie auf die Schaltfläche Start in der Software klicken.
HINWEIS: Der laufende Prozess des ITC-Instruments ist nach dem manuellen Befüllen der Referenzzelle und der Titriermittelprobenplatten vollständig automatisiert.
4. Datenanalyse mit Software
- Öffnen Sie die Datenanalysesoftware durch Doppelklick, um mit der Analyse der Daten zu beginnen.
- Öffnen Sie den Pfad der gespeicherten Rohdaten, um die Tendenz der Bindung zu erfahren.
- Öffnen Sie die Registerkarte Modellierung, und verwenden Sie verschiedene Bindungsmodelle, um die beste Anpassung für die Datenkurve zu finden. Anschließend berechnet die Software automatisch das ITC-Thermogramm und verschiedene thermodynamische Parameter, einschließlich Enthalpie (ΔH), Entropie (ΔS), freie Energie (ΔG), Gleichgewichtsbindungskonstante (Ka) und Stöchiometrie.
- Sammeln Sie die thermodynamischen Parameter, die aus den Daten und Anpassungsmodellinformationen ermittelt werden.
- Erstellen Sie einen Bericht, der Bilder des ITC-Thermogramms und verschiedener thermodynamischer Parameter enthält, wie in Abbildung 4 und Tabelle 1 dargestellt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ITC liefert eine genaue Dissoziationskonstante (Kd), die Bindungsstöchiometrie und die thermodynamischen Parameter von Zwei-Molekül-Wechselwirkungen6. In diesem Beispiel bindet das von Kim et al.9,11 ausgewählte Aptamer an Tetracyclin mit Bindungsaffinitäten von K d 1 = 13 μM, Kd 2 = 53 nM. Interessanterweise wurde diese Bindung mit der Gleichgewichtsfiltrationsmethode und einem berichteten Kd von 63,3 nM bestimmt, was sich nicht wesentlich von der günstigen Bindungsstelle (Stelle 2) unterscheidet. Das Anpassungsmodell und die Stöchiometrie von ITC zeigen, dass das Aptamer über ein Bindungsverhältnis von 2:1 an Tetracyclin mit dem sequentiellen Bindungsmodell bindet (Abbildung 4, Tabelle 1).
Die thermodynamischen Parameter, die durch ITC-Messung für Standort 2 bestimmt wurden (ΔH = -1200 kcal/mol und -TΔS = 99,75 kcal/mol), deuteten darauf hin, dass die Enthalpie, die einen relativ signifikanten entropischen Verlust überwindet, die starke Bindung antreibt. Die enthalpiegetriebene Bindung mit Entropieverlust bezieht sich auf die RNA-Konformationsänderungen, die als Bindungsverhalten zwischen RNA und einem kleinen Molekül berichtet wurden. Beispielsweise berichteten Thoa et al. über ein solches Bindungsverhalten (ΔH = -27 kcal/mol und -TΔS = +17 kcal/mol) zwischen einem RNA-Aptamer und Ru(bpy)312. Außerdem wiesen Horowitz et al. darauf hin, dass entropiegetriebene Bindung mit der Interkalation von Proflavin zu einem Oligonukleotid assoziiert ist (ΔH = -2,6 kcal/mol und -TΔS = -3,3 kcal/mol)13. Basierend auf diesen Vergleichen arbeitet der Aptamer mit Schaltstrukturverhalten bei enthalpiegetriebener Bindung, so dass der Aptamer als Erkennung für die Entwicklung eines einfachen Sensors verwendet werden kann.
Abbildung 1: Bindungsdissoziationskonstante (Kd) und thermodynamisches Profil. (A) ITC identifiziert die Bindungsdissoziationskonstante (Kd) und das thermodynamische Profil, einschließlich der Änderung der Enthalpie (ΔH) und der Änderung der Entropie (ΔS). (B) Das thermodynamische Profil liefert die Stärke und den Mechanismus der Wechselwirkung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Hauptschritte des ITC-Experiments. Das Schema zeigt die wichtigsten Schritte des ITC-Experiments zur Bestimmung der thermodynamischen und kinetischen Assoziation eines DNA-Aptamers und Tetracyclins. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: ITC-Standardtest zwischen EDTA und CaCl2. Die Ca2+-EDTA-Chelatbildung wurde als Standardreaktion zur Validierung von ITC verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: ITC-Thermogramm eines DNA-Aptamers und Tetracyclins. Das Anpassungsmodell der thermodynamischen und kinetischen Assoziation zeigt, dass die Bindung zwei unabhängige Bindungsstellen hat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Sequentielle zwei Standorte | Kd (M) | 1.359 x 10-5 |
| Kd (M) | 5.378 x 10-8 | |
| ΔH (kcal/mol) | 1223 | |
| ΔH (kcal/mol) | -1200 | |
| Ka (Mˉ¹) | 7.358 x 104 | |
| Ka (Mˉ¹) | 1.859 x 107 | |
| ΔS (cal/mol K) | 4.123 x 103 | |
| ΔS (cal/mol K) | -3.992 x 103 |
Tabelle 1: Parameter der Bindung zwischen Aptamer und Tetracyclin. Verschiedene thermodynamische Parameter, einschließlich Enthalpie (ΔH), Entropie (ΔS), freie Energie (ΔG), Gleichgewichtsbindungskonstante (Ka) und Stöchiometrie, können durch den Bindungsmechanismus zweier Moleküle bestimmt werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die hier vorgestellte Methode wurde gemäß den Anweisungen von TA Instruments modifiziert und reicht aus, um die Bindungsaffinität und Thermodynamik vieler ausgewählter Aptamere und Targets in unserem Zentrum zu bestimmen. Zu den entscheidenden Schritten dieses Verfahrens gehören der Austausch des Puffers, um ein Ziel zu haben, das dem Liganden entspricht, das Ausführen von Proben mit geeigneten Parametern und das Finden des geeigneten Bindungsanpassungsmodells zur Analyse der Daten. Die kontinuierliche Aufzeichnung der Wärmefreisetzung erfordert die Beseitigung jeglicher Geräuschwärme, z. B. durch Fehlanpassung des Puffers, Verschmutzung der Zelle und Spritze sowie Blasen in den Proben. Im Pufferaustauschschritt ist es besser, den letzten Dialysepuffer oder Durchflusspuffer in der Dialysemembran oder Spinsäule zu verwenden, um den Liganden aufzulösen, da es teuer ist, kleine Moleküle direkt auszutauschen.
Die meisten anderen Methoden zur Bestimmung der Bindungsaffinität gehen von einem 1:1-Bindungsverhältnis zwischen Aptamer und Ligand aus. Aufgrund des Bindungsverhaltens und der drastisch unterschiedlichen Größe zwischen kleinen Molekülen und Aptameren ist das 1:1-Bindungsmodell jedoch nicht immer genau14,15. In diesem Aspekt kann das ITC Daten über die Bindungsstöchiometrie liefern, um die Anzahl der Bindungsstellen zu kennen und Informationen über das Bindungsverhaltenzu geben 7,15. Diese erweiterte Funktion kann bereitgestellt werden, indem das richtige Bindungsmodell aus der ITC-Analysesoftware verwendet wird, entweder das Ein- oder Zwei-Standort-Bindungsmodell. Ein gesättigter Punkt kann mit einem anderen Bindungsverhältnis von 1:1 (1 Bindungsstelle), 1:2 oder 0,5:1 (zwei Bindungsstellen) analysiert werden. Für das sequentielle Modell gibt es keine eindeutige gesättigte Stelle, sondern nur eine Gesamtzahl gesättigter Standorte. Wenn die Standorte identisch sind, passen die Daten zur sequenziellen Sättigung. Dort hat die erste Bindungsstelle mehr leere Exemplare der gleichen Art zur Auswahl als die zweite Stelle, wie die Abnahme der freigesetzten Wärmeenergie von Standort zu Standort14,15,16 zeigt. Die Bindungsparameter bestimmen die Bindungskonstante K für jede Bindungsstelle. In diesem Fall zeigt es die Bindung mit zwei sequentiellen Bindungsstellen, was die Konformationsänderung im Gesamtmolekül bestätigt. Obwohl ITC viele erweiterte Funktionen bietet, um die Bindung zwischen dem Aptamer und kleinen Molekülen zu charakterisieren, kostet der Optimierungsprozess mit guten Bedingungen Zeit 7,16,17. Außerdem sind ITC-Geräte im Vergleich zu anderen Instrumenten teuer und erfordern die Handhabung durch einen gut ausgebildeten Techniker.
In den meisten Fällen ist es schwierig, die Bindungsaffinität zwischen einem Aptamer und einem niedermolekularen Liganden zu bestimmen. ITC kann als fortschrittliche Methode für diesen Zweck angesehen werden, da ITC hochgenaue Bindungsaffinitäten sowie thermodynamische Informationen liefert. Aus diesen Informationen können wir sein Verhalten vorhersagen, um es für den klinischen Gebrauch oder die Erkennung zu verwenden. Zum Beispiel können wir mit dem ausgewählten Aptamer mit zwei Bindungsstellen es kürzen, um eine Bindungsstelle beizubehalten, wenn eine Stelle für die Bindung nicht günstig ist, oder wir können das Aptamer in zwei Aptamere aufteilen, wenn beide Bindungsstellen das gleiche Verhalten aufweisen. Auch mit dem Konformationsstrukturänderungsverhalten können wir den Aptamer mit einer Abschreckplattform kombinieren, um einen Sensor zu entwickeln.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde durch die Forschungs- und Entwicklungsfinanzierung von Aptagen LLC unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3' |
Integrated DNA Technologies, Inc | The sequence is adopted from Gu's research, which has not identified Kd using ITC (refer references 8 and 9) | |
| Affinity ITC Auto Low Volume (190 µL) System Complete–Gold Cells | TA Instruments | 61000.901 | Isothermal titration calorimetry system |
| CaCl2 | Avantor (VWR) | E506-100ML | Calcium chloride 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | The Eppendorf 5417R is unsurpassed in safety, reliability and ease-of-use. Very easy to maintain with a brushless motor that spins up to 16,400 RPM with maximum RCF up to 25,000 x g. |
| Complete Degassing Station (110/230V) | TA Instruments | 6326 | This degasser provides a self-contained stirring platform, vacuum chamber, vacuum port, temperature control and electronic timer for proper sample preparation. |
| EDTA | TekNova | E0375 | EDTA 500 mM, pH 7.5 |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-ONE-W | UV-Vis Spectrophotometer |
| Nanosep, Nanosep MF and NAB Centrifugal Devices | Pall Laboratory | OD030C34 | 3 kDa molecular weight cutoff concentrator |
| PBS pH 7.4 | IBI Scientific | IB70165 | Buffer containing Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate, and Potassium chloride Ultra-Pure Grade Sterile filtered using 0.2 µm filter. Autoclaved at 121 °C for greater than 20 min. |
| Posi-Click 1.7 mL Large Cap Microcentrifuge Tubes | labForce (a Thomas Scientific Brand) | 1149K01 | |
| Tetracycline, Hydrochoride | EMD Millipore Corperation | CAS64-75-5 |
References
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
- Kim, S. H., Thoa, T. T. T., Gu, M. B. Aptasensors for environmental monitoring of contaminants in water and soil. Current Opinion in Environmental Science & Health. 10, 9-21 (2019).
- Dunn, M. R., Jimenez, R. M., Chaput, J. C. Analysis of aptamer discovery and technology. Nature Reviews Chemistry. 1, 0076 (2017).
- Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. SELEX--A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomolecular Engineering. 24 (4), 381-403 (2007).
- Wang, Y., Wang, G., Moitessier, N., Mittermaier, A. K. Enzyme kinetics by isothermal titration calorimetry: Allostery, inhibition, and dynamics. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 583826 (2020).
- Velazquez-Campoy, A., Freire, E. Isothermal titration calorimetry to determine association constants for high-affinity ligands. Nature Protocols. 1 (1), 186-191 (2006).
- Niazi, J. H., Lee, S. J., Gu, M. B. Single-stranded DNA aptamers specific for antibiotics tetracyclines. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 16 (15), 7245-7253 (2008).
- Kim, Y. J., Kim, Y. S., Niazi, J. H., Gu, M. B. Electrochemical aptasensor for tetracycline detection. Bioprocess and Biosystems Engineering. 33 (1), 31-37 (2010).
- Wang, S., et al. Development of an indirect competitive assay-based aptasensor for highly sensitive detection of tetracycline residue in honey. Biosensors & Bioelectronics. 57, 192-198 (2014).
- Kim, Y. S., et al. A novel colorimetric aptasensor using gold nanoparticle for a highly sensitive and specific detection of oxytetracycline. Biosensors & Bioelectronics. 26 (4), 1644-1649 (2010).
- Thoa, T. T., Minagawa, N., Aigaki, T., Ito, Y., Uzawa, T. Regulation of photosensitisation processes by an RNA aptamer. Scientific Reports. 7, 43272 (2017).
- Horowitz, E. D., Lilavivat, S., Holladay, B. W., Germann, M. W., Hud, N. V. Solution structure and thermodynamics of 2',5' RNA intercalation. Journal of the American Chemical Society. 131 (16), 5831-5838 (2009).
- Sigurskjold, B. W. Exact analysis of competition ligand binding by displacement isothermal titration calorimetry. Analytical Biochemistry. 277 (2), 260-266 (2000).
- Neves, M. A. D., Slavkovic, S., Churcher, Z. R., Johnson, P. E. Salt-mediated two-site ligand binding by the cocaine-binding aptamer. Nucleic Acids Research. 45 (3), 1041-1048 (2017).
- Turnbull, W. B., Daranas, A. H. On the value of c: Can low affinity systems be studied by isothermal titration calorimetry. Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14859-14866 (2003).
- Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).
