Summary
효율적인 보조제를 합리적으로 설계하기 위해 우리는 폴리 락틱 공동 글리콜 산 나노 입자 안정화 피커링 에멀젼 (PNPE)을 개발했습니다. PNPE는 강력한 세포 접촉을 위한 독특한 부드러움과 소수성 인터페이스를 가지고 있으며 고함량 항원 로딩을 제공하여 항원 제시 세포에 대한 전달 시스템의 세포 친화도를 개선하고 항원의 효율적인 내재화를 유도했습니다.
Abstract
마이크로/나노입자의 세포 친화력은 약물 전달 및 면역 반응에 필수적인 세포 인식, 세포 흡수 및 활성화의 전제 조건입니다. 본 연구는 고체 입자의 전하, 크기 및 모양이 세포 친화도에 미치는 영향이 일반적으로 고려된다는 관찰에서 비롯되었지만 세포 친화도에서 부드러움, 동적 구조 조정 현상 및 복잡한 계면 상호 작용의 본질적인 역할을 거의 깨닫지 못합니다. 여기에서 우리는 단단한 형태의 단점을 극복하고 병원균의 유연성과 유동성을 시뮬레이션한 폴리락틱-코-글리콜산(PLGA) 나노입자 안정화 피커링 에멀젼(PNPE)을 개발했습니다. 세포 표면에 대한 PNPE의 친화력을 테스트하고 면역 세포에 의한 후속 내재화에 대해 자세히 설명하는 방법이 설정되었습니다. 골수 수지상 세포(BMDC)를 대체하는 생체 모방 세포외 소포(bEV)에 대한 PNPE의 친화도는 소산 모니터링(QCM-D)이 있는 석영 결정 마이크로 저울을 사용하여 결정되었으며, 이를 통해 세포 에멀젼 접착을 실시간으로 모니터링할 수 있었습니다. 이어서, PNPE를 사용하여 항원 (오발 부민, OVA)을 전달하고 BMDCs에 의한 항원의 흡수를 공초점 레이저 주사 현미경 (CLSM)을 사용하여 관찰했습니다. 대표적인 결과는 PNPE가 bEV와 조우했을 때 즉시 빈도(ΔF)를 감소시켰으며, 이는 BMDC에 대한 PNPE의 빠른 접착력과 높은 친화력을 나타냅니다. PNPE는 PLGA 미세입자(PMP) 및 AddaVax 보조제(계면활성제-안정화 나노에멀젼[SSE]로 표시됨)보다 세포막에 훨씬 더 강한 결합을 보였다. 또한, 동적 곡률 변화 및 측면 확산을 통해 면역 세포에 대한 향상된 세포 친화력으로 인해 항원 흡수가 PMP 및 SSE에 비해 연속적으로 증가했습니다. 이 프로토콜은 높은 세포 친화도와 효율적인 항원 내재화를 가진 새로운 제형을 설계하기 위한 통찰력을 제공하여 효율적인 백신 개발을 위한 플랫폼을 제공합니다.
Introduction
전염병, 만성 및 전염병과 싸우기 위해서는 예방 및 치료 예방 접종을위한 효과적인 보조제를 개발하는 것이 필수적입니다 1,2. 이상적으로, 보조제는 우수한 안전성 및 면역 활성화 3,4,5를 가져야한다. 항원 제시 세포(APC)에 의한 항원의 효과적인 흡수 및 과정은 다운스트림 신호 전달 캐스케이드 및 면역 반응 6,7,8의 시작에서 필수적인 단계로 생각됩니다. 따라서 면역 세포와 항원의 상호 작용 메커니즘을 명확하게 이해하고 내재화를 강화하기 위해 보조제를 설계하는 것은 백신의 효율성을 향상시키는 효율적인 전략입니다.
독특한 특성을 갖는 마이크로-나노입자는 이전에 항원의 세포 흡수 및 병원체-관련 분자 패턴과의 세포 상호작용을 매개하는 항원 전달 시스템으로서 조사되었다 9,10. 세포와 접촉하면 전달 시스템이 세포 외 기질 및 세포막과 상호 작용하기 시작하여 내재화 및 후속 세포 반응11,12이 발생했습니다. 이전의 연구들은 입자의 내재화가 세포막-입자 접착 (13)을 통해 일어나고, 세포막의 유연한 변형 및 표면 막(14, 15)으로의 수용체의 확산이 뒤 따른다는 것을 밝혀 냈다. 이러한 상황에서 전달 시스템의 속성은 APC에 대한 친화도에 따라 달라지며, 이는 이후에 흡수량(16,17)에 영향을 미칩니다.
개선된 면역 반응을 위한 전달 시스템의 설계에 대한 통찰력을 얻기 위해 입자의 특성과 세포 흡수 사이의 관계에 대한 조사에 광범위한 노력이 집중되었습니다. 본 연구는 다양한 전하, 크기 및 모양을 가진 고체 마이크로 / 나노 입자가 종종 이러한 관점에서 연구되는 반면 항원 내재화에서 유동성의 역할은 거의 조사되지 않는다는 관찰에서 비롯되었습니다18,19. 실제로, 접착 동안, 연질 입자는 동적 곡률 변화 및 측면 확산을 입증하여 다가 상호작용을 위한 접촉 면적을 증가시켰으며, 이는 고체 입자(20,21)에 의해 거의 복제될 수 없다. 또한 세포막은 흡수 부위의 인지질 이중층 (스핑 고지 질 또는 콜레스테롤)이며 소수성 물질은 지질의 구조적 엔트로피를 변경하여 세포 흡수에 필요한 에너지의 양을 줄일 수 있습니다22,23. 따라서, 이동성을 증폭시키고 전달 시스템의 소수성을 촉진하는 것은 면역 반응을 향상시키기 위해 항원 내재화를 강화하기 위한 효과적인 전략이 될 수 있다.
두 개의 비혼화성 액체 사이의 계면에서 조립된 고체 입자에 의해 안정화된 피커링 에멀젼은 생물학적 분야에서 널리 사용되어 왔다(24,25). 사실, 오일/물 계면의 응집 입자는 다단계 구조의 공식을 결정하여 다단계 전달 시스템-세포 상호 작용을 촉진하고 약물 전달에서 다기능 물리화학적 특성을 추가로 유도합니다. 이들의 변형성 및 측면 이동성 때문에, 피커링 에멀젼은 면역세포와의 다가 세포 상호작용에 들어가 막 단백질26에 의해 인식될 것으로 예상되었다. 또한 피커링 에멀젼의 유성 미셀 코어는 고체 입자로 완전히 덮여 있지 않기 때문에 피커링 에멀젼은 오일/물 계면의 입자 사이에 크기가 다른 간격을 가지고 있어 더 높은 소수성을 유발합니다. 따라서 APC에 대한 피커링 에멀젼의 친화력을 탐구하고 효율적인 보조제를 개발하기 위해 후속 내재화에 대해 자세히 설명하는 것이 중요합니다.
이러한 고려 사항을 바탕으로 우리는 PLGA 나노입자 안정화 피커링 에멀젼(PNPE)을 유동성 백신 전달 시스템으로 설계하여 BMDC에 대한 PNPE의 친화력 및 세포 내재화에 대한 귀중한 통찰력을 얻는 데 도움이 되었습니다. PNPE에 대한 생체모방 세포외 소포(bEV, BMDC의 대체)의 실시간 접착은 소산 모니터링(QCM-D)이 있는 석영 결정 마이크로저울을 사용하는 무표지 방법을 통해 모니터링되었습니다. BMDC에 대한 PNPE의 친화도를 특성화한 후 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM)을 사용하여 항원 흡수를 결정했습니다. 결과는 BMDC에 대한 PNPE의 더 높은 친화도 및 항원의 효율적인 내재화를 나타내었다. 우리는 PNPE가 APC에 더 높은 친화력을 나타낼 것으로 예상했으며, 이는 면역 반응을 향상시키기 위해 항원의 내재화를 더 잘 자극할 수 있습니다.
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Protocol
이 프로토콜에 설명 된 모든 방법은 중국 과학원의 공정 공학 연구소의 승인을 받았습니다. 모든 동물 실험은 실험 동물의 관리 및 사용에 관한 규정 및 동물의 윤리적 검토 지침 (중국, GB / T35892-2018)에 따라 엄격하게 수행되었습니다.
1. PLGA 나노입자의 제조 및 특성화
- PLGA 나노입자(PNP)의 제조
- 90°C에서 탈이온수 120mL에 폴리비닐알코올(PVA) 0.5g을 첨가하고 완전히 용해될 때까지 교반하여 PVA 용액을 제조하였다. 실온으로 냉각한 후 용액을 냉장고(4°C)에 보관한다.
- 100mg의 PLGA를 10mL의 아세톤과 에탄올 혼합물(4:1의 비율)에 첨가하여 오일상 역할을 합니다.
- 흄 후드 아래에 PVA 수용액 20mL를 놓고 400rpm/min으로 자석으로 저어줍니다. 5mL의 오일 상을 PVA 용액에 주사기 펌프를 사용하여 한 방울씩 추가합니다. 그런 다음 유기 용매가 완전히 증발 할 때까지 흄 후드에서 혼합물을 저어줍니다.
참고 : 오일 상태의 입자 농도가 증가함에 따라 수상 용액은 점차 투명하고 투명한 밝은 청백색 또는 유백색으로 변합니다. - 유기 용매를 휘발시킨 후(2-3시간), 혼합물을 15,000 x g에서 원심분리한다. 최종 세척수가 깨끗하고 투명해질 때까지 세 번 이상 씻으십시오.
참고: 이 단계의 목적은 주로 입자 표면의 잔류 PVA를 씻어내어 피커링 에멀젼 준비에 영향을 미치지 않도록 하는 것입니다. - 세척된 PNP를 2mL의 탈이온수에 재현탁시키고, 혼합물을 -80°C에서 24시간 동안 동결시켰다. 이어서 입자를 동결건조기에서 48-72시간 동안 동결건조시킨다. 준비된 PNP는 흰색 무리입니다.
- PNP의 특성화
- PNP의 크기와 제타 전위를 특성화하려면 1mL의 탈이온수에 10μL의 PNP를 추가하여 희석제 용액을 얻고 희석제 용액을 DTS1070 셀로 옮깁니다. 컴퓨터와 동적 광산란 분석기(DLS)를 켠 다음 DTS1070 셀을 DLS 시스템에 놓습니다.
- Zeta Size 소프트웨어를 클릭하고 새 측정 파일을 생성하여 측정 절차를 설정합니다. 그런 다음 입자 크기와 제타 전위 분포를 얻기 위해 결정 절차를 시작합니다.
- PNPs 형태를 관찰하려면 0.1cm x 40cm 주석 호일 시트에 5mL PNP 용액(5배 희석)을 고르게 펴고 통풍이 잘 되는 흄 후드에서 밤새 물이 자연 증발하도록 합니다.
- 주석 호일의 작은 부분을 잘라내어 전도성 테이프로 샘플 테이블에 고정합니다. 120 초 동안 10mA의 전류로 금을 분무하십시오. 이어서 주사전자현미경(SEM)을 이용하여 시료의 표면 형태를 관찰하였다.
2. PNPE의 제조 및 특성 분석
- PNPE를 준비하려면 동결 건조 PNP를 4mg/mL(수성상) 농도의 탈이온수에 추가한 다음 스쿠알렌을 오일 상으로 추가합니다. 수조 초음파 처리기에서 100W에서 5분 동안 원스텝 초음파 처리를 통해 PNPE를 준비합니다. 오일-물 위상 비율은 1:9입니다.
- 준비된 PNPE의 특성화
- Mastersizer 2000 소프트웨어와 레이저를 순서대로 엽니다. 측정을 클릭하여 사전 설정된 프로그램을 열고 샘플 이름을 설정합니다. 시작을 클릭하여 샘플의 배경 측정을 시작한 다음 스포이드를 사용하여 레이저 입자 크기 분석기의 샘플 탱크에 1mL의 PNPE를 추가하여 에멀젼의 입자 크기를 3 회 동시에 측정합니다.
- 1mL의 탈이온수에 20μL의 PNPE를 희석합니다. 20 μL의 에멀젼을 슬라이드에 떨어뜨립니다. 40x 배율에서 광학 현미경을 사용하여 에멀젼의 형태와 균질성을 관찰하고 사진을 얻습니다.
- 항원 로딩 효율
- 200μg의 오브알부민(OVA)을 500mL의 탈이온수에 녹입니다. 그런 다음 준비된 PNPE 500mL와 혼합하고 실온에서 1시간 동안 흔듭니다. 5000 x g 에서 20분 동안 원심분리하여 유체 항원을 제거한다.
- 비신코닌산(BCA) 분석27을 사용하여 유체 항원 농도를 결정합니다. 항원 로딩 효율을 계산하는 공식은 다음과 같습니다.
항원 로딩 효율 =
대조군으로 사용되는 SSE의 항원 로딩 효율을 결정하기 위해 동일한 방법을 사용하십시오.
- PNPE의 안정성
- 제조된 PNPE 6mL를 6등분분으로 나누어 각각 4°C와 25°C에서 3인분을 보관한다. 20, 1, 50일에 보관된 PNPE 0μL를 탈이온수 1mL(3:6)로 희석합니다. 그런 다음 다른 온도에서 유지되는 PNPE 스톡 용액의 크기와 제타 전위를 측정합니다.
알림: PNPE의 안정성에 대한 다양한 온도의 영향을 비교하기 위해 다른 보관 온도가 설정되어 높은 안정성과 긴 보관 수명을 위해 보관 조건을 최적화할 수 있습니다.
- 제조된 PNPE 6mL를 6등분분으로 나누어 각각 4°C와 25°C에서 3인분을 보관한다. 20, 1, 50일에 보관된 PNPE 0μL를 탈이온수 1mL(3:6)로 희석합니다. 그런 다음 다른 온도에서 유지되는 PNPE 스톡 용액의 크기와 제타 전위를 측정합니다.
- PLGA 미세입자(PMP)의 제조
- 500mg의 PLGA를 오일상으로서 5mL의 디클로로메탄에 녹인 다음, 1.5% PVA를 함유하는 50mL의 외부 수성상에 부어 오일/물 혼합물을 수득한다. 균질화를 사용하여 혼합물을 3000rpm에서 1분 동안 균질화하여 거친 에멀젼을 얻었다.
- 막 유화에 의한 마이크로스피어(거친 에멀젼에 의해 결정됨)의 PLGA 입자 크기의 균일성을 유지합니다. 멤브레인 튜브에 5.2μm 멤브레인을 설치합니다. 압력을 800kPa로 조정하고 안정적으로 유지하십시오.
- 배기 밸브와 공급 밸브를 열고 거친 에멀젼을 샘플 탱크에 추가 한 후 배기 밸브와 공급 밸브를 닫고 배출 밸브와 입구 밸브를 열고 200mL 비커에 포스트 필름 에멀젼을 넣습니다. 이 과정을 세 번 반복하여 프리 더블 에멀젼을 얻습니다.
- 프리더블 에멀젼을 교반하여 실온에서 디클로로메탄을 증발시켜 마이크로스피어를 경화시킵니다. 미세구를 7741 x g 의 탈이온수를 사용하여 3분 동안 5회 세척합니다. 냉동고에서 -80°C로 미리 동결하고 최종적으로 동결건조하여 건조된 마이크로스피어를 얻는다.
- PMP의 특성화
- Mastersizer 2000 소프트웨어와 레이저를 순서대로 엽니다. 측정을 클릭하여 사전 설정된 프로그램을 열고 샘플 이름을 설정합니다. 시작을 클릭하여 샘플의 배경 측정을 시작합니다. 그런 다음 점 적기로 레이저 입도 분석기의 시료 첨가 탱크에 PMP 1mL를 넣고 미립자의 입자 크기를 3회 병렬로 측정합니다.
- 부드러움 분석
참고: PNPE는 부드러움을 측정하기 위해SiO2 센서에 코팅되었습니다.- SiO2 석영 센서 칩을 UV-오존 처리로 10분 동안 청소하고 에탄올 5mL(75% v/v)로 두 번 헹구고N2로 건조시킵니다. 빈SiO2 석영 센서 칩을 플로우 셀에 설치합니다.
- 컴퓨터를 켜고 소프트웨어 오른쪽 하단의 온도 조절기를 활성화하여 설정 온도가 실온보다 약 1 ° C 낮은지 확인하십시오.
- 도구 모음에서 획득 버튼을 클릭하고 측정 설정을 선택하여 사용된 채널에서 칩의 1, 3, 5, 7, 9 및 11 옥타브를 검색합니다. 도구 모음에서 수집 버튼을 클릭하고 측정 시작을 선택합니다.
- 공기로 베이스라인을 수정하고 베이스라인이 균형을 이루면 중지(Stop)를 선택하고 파일을 공백으로 저장합니다.
- 칩을 청소하고 칩에 10μg/mL의 PNPE를 스핀 코팅합니다. 간단히 스핀 코터를 켜고 작동 매개 변수를 설정하십시오. N2 파이프를 스핀 코터에 연결하고 가스 실린더의 분획을 0.4kPa로 조정 한 다음 깨끗한 칩을 스핀 코터의 흡입 컵에 놓습니다. SiO2 센서 중앙에 PNPE 100μL를 적가하고 스핀 코터의 상단 커버를 닫아 코팅을 완료합니다.
- PNPE 코팅 칩을 플로우 셀에 설치합니다. 2.7.3-2.7.4단계를 반복하고 파일을 PNPE로 저장합니다. 빈 파일과 PNPE 파일을 모두 열고 스티치 버튼을 클릭하여 관련 소산 데이터(ΔD)를 얻습니다.
3. BMDC 분리 및 배양 28
참고: 모든 시약과 샘플은 세포 활동에 긍정적인 영향을 미치므로 얼음 위에 놓아야 합니다. 멸균 상태를 유지하려면 멸균기구를 사용하여 매우 깨끗한 벤치에서 모든 단계를 수행하십시오.
- CO2 흡입을 통해 C57BL/6(암컷, 6-8주령) 마우스를 안락사시키고 간단한 살균을 위해 에탄올 70%(v/v)에 담근다.
- 3-5 분 동안 담근 후 마우스를 슈퍼 클린 벤치로 옮깁니다. 스테인리스 스틸 가위로 다리 근육을 제거하여 대퇴골과 경골을 노출시킨 다음 대퇴골과 경골을 분리합니다.
- 페트리 접시에 70 % (v / v) 에탄올을 채우고 깨끗한 뼈를 5-10 초 동안 담가 외부 살균을 완료합니다. 모든 뼈를 청소하고 얼음이 묻은 멸균 튜브에 넣으십시오.
- 가위를 사용하여 관절에 가까운 대퇴골과 경골을 다듬습니다. 주사기 바늘을 뼈 내로 삽입하여 골수를 미리 냉각된 RPMI 배지를 사용하여 원심분리 튜브 내로 플러시한다(1640).
- 뼈가 완전히 흰색이 될 때까지 두세 번 헹굽니다. 골수를 여러 번 피펫팅하여 모든 덩어리를 분리하십시오. 40 μm 직경의 체를 사용하여 세포를 15mL 원심분리 튜브에 여과합니다.
- 4 °C 및 500 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 버리고 2mL의 적혈구 용해물을 침전물에 4분 동안 추가합니다.
- 2-3회 세척한 후 세포를 2mL의 완전 배지(1% 페니실린-스트렙토마이신, 10% 소 태아 혈청, 20ng/mL의 IL-4 및 10ng/mL의 GM-CSF)에 재현탁합니다. 그런 다음 10μL의 세포를 1mL의 PBS로 희석하고 휴대용 자동 세포 계수기의 칩을 세포 계수를 위해 세포 희석액에 삽입합니다. 마지막으로, 1 x 106 cells/mL의 밀도로 시드 세포를 완전한 배지가 있는 10mm 배양 접시에 넣습니다.
- 세포를 37°C에서 5%CO2 로 세포 배양기에서 배양하였다. 2 일마다 매체를 교체하십시오. 7일째에 세포를 50mL 튜브로 옮기고 450 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 수집합니다.
4. 생체모방성 세포밖 소포(bEV)의 제조
- 제조업체의 지침에 따라 미니 압출기를 순서대로 조립하십시오. 사용하기 전에 주사기 하우징에 금이 가지 않았는지 확인하십시오. 모든 실험 전에 모든 O-링이 양호한 상태인지 확인하고 마모되거나 손상된 O-링을 즉시 교체하십시오. 마모되거나 손상된 O-링은 압출기를 작동할 때 갑작스러운 압력 방출을 유발할 수 있습니다.
- BMDC를 반복적으로 흡입하여 원심 분리기 튜브로 옮깁니다. 세포를 4°C에서 5분 동안 450 x g 에서 원심분리하여 수확한다. 세포 현탁액을 10 μm, 5 μm, 및 1 μm 폴리카보네이트 멤브레인을 통해 30회 통과 미니 압출기(29)를 사용하여 가압한다.
참고: bEV 크기 균일성을 가능하게 하기 위해 BMDC 현탁액을 10μm, 5μm 및 1μm 폴리카보네이트 멤브레인을 통해 30회 통과했습니다. 또한 작동 중에는 힘을 고르게 가하고 주사기 축을 따라 힘의 방향을 유지하십시오. - 풀링된 상청액을 1000 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 제거하였다. 상청액을 수집하고 이를 4°C에서 5분 동안 3000 x g 에서 원심분리하여 나머지 세포 및 세포 파편을 제거한다.
- 상청액을 수집하고 이를 100,000 x g 에서 4°C에서 90분 동안 원심분리한다. 상청액을 버리고 2mL의 HEPES 완충 식염수(HBS)에 bEV를 재현탁합니다. 0.45μm 멤브레인을 통한 여과를 통해 bEV를 정제하고 정제된 bEV를 -80°C에서 보관합니다.
5. bEV는 PNPE를 준수합니다.
알림:SiO2 센서는 스핀 코팅 방법을 통해 수정되었습니다.
- 폴리 -L- 라이신 (PLL)으로 변형 된 SiO2 센서.
- UV-오존 처리를 사용하여 SiO2 석영 센서 칩을 10분 동안 세척하고 에탄올로 2회 헹구고N2로 건조시킵니다.
- 전원 버튼을 눌러 스핀 코터를 켜고 제어 버튼을 누르고 코팅 시간과 속도를 설정합니다. 초기 회전 속도는 400rpm이며 꾸준히 5000rpm으로 증가합니다.
- N2 파이프를 스핀 코터에 연결하고 가스 실린더의 분획을 0.4kPa로 조정하십시오. 깨끗한 칩을 스핀 코터의 흡입 컵에 놓습니다. SiO2 센서의 중앙에 100μL의 PLL을 적가하고 스핀 코터의 상단 커버를 닫습니다.
- 시작 버튼을 눌러 샘플 코팅을 시작하고 완료되면 기계를 중지합니다. 진공 펌프를 끄고 전원 및 제어 버튼을 끄고 PLL 수정 SiO2 센서를 제거합니다.
알림: 시작을 누르기 전에 코팅 시간과 속도가 설정되어 있는지 확인하십시오. 또한 SiO2 센서가 흡입 컵의 중앙에 있는지 확인하십시오. 사고를 방지하기 위해 프로세스를 실행하기 전에 뚜껑이 닫혀 있는지 확인하십시오.
- PNPE에 대한 bEV의 접착력 측정
- 컴퓨터, 전자 장치, 연동 펌프를 켜고 소프트웨어의 오른쪽 하단에 있는 온도 제어 장치를 활성화하여 설정 온도가 실온보다 약 1°C 낮도록 합니다.
- 작동 지침에 따라 PLL 수정SiO2 센서를 플로우 셀에 놓고 플로우 셀과 플로우 펌프 사이에 측정 라인을 연결합니다. 플로우 모듈 시스템 내부에 플로우 셀을 놓고 실험을 시작하기 전에 초순수로 헹굽니다.
- 획득 도구 모음을 클릭하고 측정 설정을 선택하여 사용된 채널에서 칩의 1, 3, 5, 7, 9 및 11 옥타브를 검색합니다. 기준선을 수정하려면 측정 시작을 클릭하여 공기 기준선이 부드러워질 때까지 공기가 흐름 모듈로 들어갈 수 있도록 합니다. 이어서, 10-15분 동안 탈이온수를 흘려보내 용액 기준선 평형을 다시 가능하게 한다.
- 준비된 PNPE 용액을 50μL/min의 유량으로 유량 모듈에 펌핑하여SiO2 센서에서 평형 흡착을 달성합니다.
알림: PNPE가 유량 모듈로 다시 펌핑될 때 ΔF가 더 이상 변경되지 않으며, 이는SiO2 센서의 표면이 PNPE로 완전히 덮여 있음을 나타냅니다. - 준비된 bEV 용액을 50μL/min의 유속으로 유량 모듈에 펌핑하여 PNPE 표면에 대한 bEV 접착 과정을 추적합니다.
6. 항원 흡수의 CLSM 분석
- BMDC와 공동 배양 PNPE-OVA
- BMDC를 1640개의 완전한 배지(1% 페니실린-스트렙토마이신, 10% 태아 소 혈청, 20ng/mL의 IL-4 및 10ng/mL의 GM-CSF)로 7일 동안 배양한 다음 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 밤새 우물당 1 x 106의 작은 공초점 레이저 접시에 시드합니다.
- 0.5mL의 Cy5 표지 OVA(400μg/mL)와 0.5mL의 PNPE를 1시간 동안 혼합하고 5000 x g 에서 20분 동안 원심분리하여 유체 항원을 제거하여 백신 제형을 개발합니다. 200μL의 탈이온수로 재현탁한 후, 10μL의 제형(10μg/mL OVA)을 슈퍼 클린 벤치 아래의 작은 공초점 레이저 접시에 넣고 BMDC와 6시간 동안 공동 배양합니다.
- 액틴 세포 골격 염색
- 세포에서 배양액을 제거하고 예열된 인산염 완충 식염수(PBS; pH 7.4)로 두 번 세척합니다.
- 실온에서 10분 동안 PBS의 4% 포름알데히드 용액으로 세포를 고정합니다. 고정하는 동안 액틴을 파괴 할 수있는 메탄올을 함유 한 정착액을 피하십시오.
- 세포를 PBS로 실온에서 각각 10분 동안 2-3회 세척한다. 실온에서 5분 동안 0.5% 트리톤 X-100 용액 100μL로 세포를 투과화합니다. 세포를 PBS로 실온에서 2-3회 다시 10분 동안 세척한다.
- 작은 공초점 레이저 접시의 유리 바닥 접시에 있는 세포를 200μL의 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 접합 팔로이딘 작업 용액으로 덮고 어두운 곳에서 실온에서 30분 동안 배양합니다. 배경 신호를 줄이려면 FITC 접합 팔로이딘 작업 용액에 1% 소 혈청 알부민을 추가합니다. 또한 배양 중에 작은 공초점 레이저 접시의 뚜껑을 덮어 용액의 증발을 방지하십시오.
- PBS로 세포를 각각 5분 동안 씻어냅니다. 약 30초 동안 200μL의 DAPI 용액(농도: 100nM)으로 핵을 다시 염색합니다.
- 이미지 분석
- 레이저, 공초점, 현미경 및 컴퓨터를 포함한 컨포칼 현미경 하드웨어를 순서대로 켭니다. NIS-Elements AR 5.20.00 소프트웨어를 클릭하고 Nikon Confocal 을 선택하여 테스트 시스템으로 들어갑니다.
- 컨포칼 현미경 시스템에서 다양한 장치를 표시된 순서대로 켭니다. 먼저 FITC, DAPI 및 Cy5 채널을 설정하고 해당 HV 및 오프셋을 조정합니다. 그런 다음 100x 오일 렌즈를 선택하고 그 위에 삼나무 오일 한 방울을 놓습니다. 염색된 BMDC가 들어 있는 작은 컨포칼 레이저 접시를 현미경 스테이지에 놓습니다.
- 스캔 버튼을 클릭합니다. 형광 현미경에서 X축, Y축 및 Z축을 움직여 관심 있는 세포를 찾습니다. 레이저 강도, 이미지 크기 및 기타 파라미터를 조정하여 고품질 컨포칼 이미지를 스캔할 수 있습니다. 마지막으로 캡처 버튼을 누르고 이미지를 저장합니다.
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Representative Results
PNPE를 얻기 위해 간단한 1단계 초음파 화를 사용했습니다. 먼저, 고체 안정제로 사용하기 위해 균일 한 PNP를 준비했습니다 (그림 1A). PNP의 형태는 SEM을 통해 관찰되었으며, 이는 대부분 균일하고 구형임을 보여줍니다(그림 1B). 제형의 유체역학적 크기 및 제타 전위는 DLS 를 통해 검출되었다. PNP의 직경은 187.7 ± 3.5 nm이고 제타 전위는 -16.4 ± 0.4 mV였습니다 (그림 1C 및 보충 표 1). PNPE를 준비하기 위해 PNP 용액 (0.4 %, w / v)과 스쿠알렌의 혼합물을 100w에서 5 분 동안 간단히 초음파 처리했습니다 (그림 1D). 연속상의 최적화 후, 수득 된 PNPE는 내부적으로 스쿠알렌으로 구성되고 외부적으로 PNP로 흡착되었다 (보충 그림 1). 광학 현미경을 사용하여 에멀젼 방울을 관찰하고 Mastersizer 입자 크기 분석기를 사용하여 크기 분포를 결정했습니다. PNPE는 에멀젼의 유착을 방지하는 입자가 적지 않고 더 큰 응집체를 유발하는 연속 단계에서 더 이상 입자가 과잉되지 않음을 나타냈습니다(그림 1E). 그림 1F 및 보충 표 1에 나타낸 바와 같이, 에멀젼 크기는 2100 ± 300 nm이고 제타 전위는 -27.1 ± 0.5 mV였으며, 이는 입자가 오일/물 계면 상에 응집되었음을 나타낸다. 항원의 세포 흡수를 관찰하기 위해, Cy5-labled OVA를 PNPE에 흡착시켰다. 우선, 500 μL의 PNPE를 실온에서 1 시간 동안 500 μL Cy5 표지 된 OVA와 혼합했습니다. 제형 상의 항원의 흡수를 BCA 분석을 사용하여 시험하였다. 높은 비표면적과 소수성으로 인해 유체 항원의 70.6% 이상이 1시간 이내에 PNPE에 흡착되어 단시간에 많은 양의 항원을 로딩할 수 있는 상당한 가능성을 나타냅니다. 대조군으로서, PMP 및 SSE도 특성화되었다. PMP는 PNPE와 크기 (1987 ± 310 nm)가 비슷했습니다. SSE를 147.2 ± 0.5 nm의 직경 크기를 갖는 음전하를 띤 에멀젼 (-15.9 ± 0.8 mV)이었다. 또한, PMP 및 SSE의 로딩 효율은 항원에 의한 제한된 흡착으로 인해 각각 25.6 % ± 0.6 % 및 23.4 % ± 0.2 %에 불과했다 (보충 표 1). 추가적으로, PNPE의 안정성을 평가하기 위해, 제조된 PNPE를 각각 4°C 및 25°C에서 보관하였다. 원액의 크기 및 제타 전위는 0-6일(1:50 희석)에 결정하였다. 보충 그림 2에 나타낸 바와 같이, 액적은 4°C 및 25°C에서 보관하는 동안 크기 및 제타 전위가 유사하게 유지되어 항원 전달을 위한 PNPE의 더 높은 안정성을 시사했습니다. 그런 다음 QCM-D를 사용하여 PNPE의 유연성을 측정했습니다. 그림 1G에서 볼 수 있듯이 견고한 구조의 결과로 PMP는 더 낮은 손실 (ΔD)을 나타 냈습니다. 동시에 PNPE는 ΔD가 상당히 높아 우수한 점탄성과 유연성을 보여 세포 부착 및 흡수가 개선 된 이유 중 하나 일 수 있습니다.
BMDC 멤브레인에 대한 PNPE의 친화도를 검증하기 위해 bEV는 정확한 QCM-D 검출을 위한 적절한 크기 때문에 손상되지 않은 세포를 대체하는 데 사용되었습니다. 이 과정에서 성숙한 BMDC를 수확하고 10, 5 및 1 μm 공극 크기를 포함하는 폴리 카보네이트 멤브레인 필터를 통해 연속 압출하여 나노 크기의 소포를 제조했습니다. 수득된 bEV를 수집하고, 초원심분리 를 통해 정제하고, HEPES 완충 식염수에 재현탁시켰다(도 2A). 그런 다음 음성 염색된 bEV의 형태를 투과 전자 현미경(TEM)을 사용하여 조사했습니다. 나노 입자 추적 분석 (NTA)을 사용하여 bEV의 크기를 테스트했습니다. 결과는 bEV가 폐쇄 지질-이중층 소포 형태이고 분포가 균질하다는 것을 보여주었습니다(그림 2B). NTA는 정제된 bEV의 피크 직경을 갖는 bEV의 크기 분포가 131nm임을 보여주었다(그림 2C). 따라서 우리는 bEV가 균일한 분포를 가진 전형적인 막 구조이며, 이는 BMDC의 대체품으로서 QCM-D 분석에서 더 높은 정확도를 허용한다는 결론을 내렸습니다.
다음으로, PNPE에 대한 bEV의 접착력을 QCM-D를 사용하여 추적하였다. 먼저, QCM-DSiO2 센서를 PLL로 수정하여 양전하를 부여하여 표면에 PNPE를 고정하고 생체 간기 공정을 시뮬레이션했습니다. 즉시 bEV 용액을 챔버에 추가하여 PNPE와 bEV 간의 상호 작용을 설명했습니다(그림 3A). 그림 3B에서 볼 수 있듯이 빈도(ΔF)의 즉각적인 감소는 만남 후 PNPE에 대한 bEV의 빠른 접착을 나타냅니다. 또한, ΔF는 농도 의존적 효과를 반영하여 bEV 농도가 증가함에 따라 감소했습니다. PNPE는 착륙 지점을 지지하기 위해 조밀하게 채워진 표면을 가지고 있습니다. 또한, 강력한 세포 접촉을 위해 동적 곡률 변화와 측면 확산을 나타내어 BMDC에 대한 높은 친화력을 나타냈다. 대조적으로, PMP와 SSE는 고농도 (80 μg / mL)에서도 bEV에 약하게 결합되었는데, 이는 아마도 면역 세포와의 접촉 부위가 부족하여 발생했을 것입니다 (그림 3C).
BMDCs에 대한 접착 과정을 확인한 후, PNPE를 사용하여 BMDCs에 항원을 전달하였다. 시험관 내에서 항원 내재화 프로파일을 직접 시각화하기 위해 Cy5-표지된 OVA를 PMP, SSE 및 PNPE와 혼합하여 각각 BMDC로 치료했습니다. 처리 후 6시간 후, BMDC에서 Cy5-표지된 OVA의 세포 흡수를 분석하기 위해 CLSM을 수행하였다. 도 4A에 나타낸 바와 같이, Cy5-OVA 형광 신호는 세포에 내재화된 항원의 총량이 PMP 및 SSE-처리군에 비해 PNPE-처리된 군에서 유의하게 더 높다는 것을 나타내었다. 세포 흡수의 정량적 분석이 추가로 수행되어 PMP 및 SSE로 처리된 BMDC보다 PNPE로 처리된 BMDC에서 형광의 상대적 강도가 유의하게 더 높음을 보여주었으며(p < 0.001), 이는 위의 관찰을 뒷받침했습니다(그림 4B). 얻어진 결과는 PNPE가 항원 내재화를 촉진하고 항원을 세포 내로 효과적으로 전달한다는 것을 입증했습니다. 결과적으로, 항원의 흡수 효율은 표적 세포에 대한 전달 시스템 친화도와 양의 연관이 있었고, PNPE는 세포막과의 다단계 접촉 을 통해 항원 세포 흡수를 효과적으로 증가시켰다.
그림 1: PLGA 나노입자 안정화 피커링 에멀젼의 특성화. (A) PLGA 나노입자(PNP)의 제조에 사용된 실험 절차의 개략도. (B) PNP의 주사 전자 현미경 (SEM) 이미지. 스케일 바 = 200 nm. (C) PNP의 크기 분포. (D) 나노 입자 안정화 피커링 에멀젼 (PNPE)의 제조에 사용 된 실험 절차의 개략도. (E) PNPE의 광학 현미경 사진. 스케일 바 = 20 μm. (F) PNPE의 크기 분포. (G) 방산 검출(ΔD)을 통한 PNPE, PLGA 미세입자(PMP) 및 계면활성제 안정화 에멀젼(SSE)의 부드러움에 대한 방산 모니터링(QCM-D) 분석을 통한 석영 결정 마이크로 저울. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 생체모방 세포외 소포의 특성화. (A) 생체모방 세포밖 소포(bEV)의 제조에 사용된 실험 절차의 개략도. (B) bEV의 투과 전자 현미경 (TEM) 이미지. 스케일 바 = 200nm. (C) 나노 입자 추적 분석 (NTA)을 사용하여 측정 한 bEV의 크기 분포 (n = 3). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: QCM-D를 사용하여 분석한 bEV에 대한 PNPE의 친화도 . (A) PNPE 코팅을 통한 PLL 표면 개질의 개략도. (B) 다른 농도의 bEV와 조우 한 후 PNPE의 빈도 (ΔF) 변화. (C) PLGA 마이크로입자(PMP), 계면활성제-안정화 에멀젼(SSE) 및 PNPE에서 ΔF의 변화 비교. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 항원 흡수. (A) 항원의 세포 흡수의 대표 다이어그램. 스케일 바 = 20 μm. (B) 항원의 세포 흡수의 상대적 강도 형광. 그래프는 세 가지 독립적인 실험의 평균 ± SEM을 표시합니다. 관찰된 차이의 유의성을 분석하기 위해 일원 분산 분석을 사용하였다. p < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 연속 위상의 최적화. (A) 서로 다른 연속 위상으로 구성된 PNPE의 광학 현미경 사진. 스케일 바 = 20 μm. (B) 제조 후 에멀젼의 크기를 검출하였다. 결과는 평균± SEM으로 나타내었다(n=3). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2: PNPE의 안정성. PNPE의 크기 (A) 및 제타 전위 (B)는 표시된 온도에서 0, 3 및 6 일 보관 후입니다. 데이터는 평균± SEM으로 입증되었다(n=3). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 1: 제형의 특성화. PNP, PNPE 및 SSE는 지시된 프로토콜에 따라 제조하였다. 크기 분포 및 제타 전위는 동적 광산란 분석기(DLS) 또는 Mastersizer 입자 크기 분석기에 의해 결정되었습니다. 로딩 효율을 BCA 분석을 사용하여 평가하였다. 데이터는 평균± SEM으로 입증되었다(n=3). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리는 향상된 항원 내재화를 위한 전달 시스템으로 PLGA 나노입자 안정화 오일/물 에멀젼을 개발했습니다. 준비된 PNPE는 착륙 지점을 지원하기 위해 조밀하게 채워진 표면과 면역 세포막과의 강력한 세포 접촉을 위한 독특한 부드러움과 유동성을 가지고 있습니다. 또한 오일/물 계면은 고함량 항원 로딩을 제공했으며 양친매성 PLGA는 항원을 면역 세포로 운반하기 위한 높은 안정성을 PNPE에 부여했습니다. PNPE는 세포 표면에 빠르게 부착 될 수 있으며, 이는 PLGA 나노 입자 안정화 에멀젼이 세포 흡수를 위해 세포막에 강한 친화력을 가짐을 나타냅니다. 또한 PNPE는 스쿠알렌과 PLGA가 모두 식품의 약국 (FDA) 승인 성분30이기 때문에 높은 안전성 프로파일을 가졌으며, 이는 임상 내로의 안전한 이전을 활용할 것으로 예상됩니다.
PLGA의 분자량과 연속 및 분산상의 유형은 안정성 및 소수성을 포함한 PNPE 특성에 영향을 미쳤습니다. 이 연구에서는 17kDa 분자량의 PLGA 나노 입자를 안정제로, 스쿠알렌을 분산상으로 선택하여 안정성을 증가 시켰습니다. 추가적으로, 탈이온수는 연속상으로서 제형의 조성을 단순화시켰다. 이 조건에서 PNPE는 항원의 효율적인 조립을 허용하고 면역 세포로의 항원 전달을 촉진했습니다. 또한, 1 단계 초음파 처리 방법을 사용하여 PNPE를 준비하여 지루한 공정을 제거하고 오염 가능성을 피했습니다. PNP와 스쿠알렌으로 구성된 전달 시스템은 균일 한 힘이어야하며, 그렇지 않으면 에멀젼이 형성되지 않거나 준비된 PNPE의 크기가 균일하지 않습니다.
세포에 대한 전달 시스템의 친화력을 연구하는 것은 생체 내에서 수행되는 특별한 도전이었지만 in vitro 연구는 세포 접착 및 내재화와 관련된 과정을 설명하는 데 도움이 될 수 있습니다. 최근이 문제는 생물 의학 분야에서 많은 관심을 받고 있습니다. 유세포 분석 및 CLSM 분석31,32를 사용하여 세포에 대한 입자의 친화도를 밝히기 위해 상당한 노력이 이루어졌습니다. 이러한 방법은 세포 수준에서 평균 판독값을 제공하지만 세포와 전달 시스템 간의 특정 동적 결합 프로세스는 쉽게 모니터링되지 않습니다. 대조적으로, QCM은 주로 ΔF가 질량에 따라 변하는 민감한 압전 결정에 의존합니다. 미세한 질량 변화를 감지하는 기능을 통해 QCM-D는 표적화된 분자 상호 작용을 모니터링할 수 있습니다. 이 기술은 실시간 이벤트를 모니터링하는데 사용될 수 있어서, 상이한 조건들 하에서 BMDC들과 PNPE의 친화도의 연구를 가능하게 한다(33).
PNPE에 대한 접착력은 손상되지 않은 세포 대신 bEV를 사용하여 조사되었습니다. 잘 제어된 단순 APC로서, bEV는 부모 세포의 대부분의 특성을 상속하는 것으로 여겨진다. 일반적으로 입자 크기가 작고 균일한 세포외 소포는 접착 분석에서 더 잘 수행됩니다. 따라서, bEV는 10, 5 및 1 μm 공극 크기34의 폴리카보네이트 필터를 통한 압출을 통해 제조되었다. bEV의 직경과 수율은 압출 수와 폴리카보네이트 멤브레인의 기공 크기를 조절하여 제어할 수 있습니다. 폴리 카보네이트 멤브레인을 30 번 통과하는 것이 좋습니다. 그러나, 이 방법은 또한 막의 일부가 반전될 수 있고, DC 표면 상의 단백질이 bEVs에 캡슐화되게 할 수 있고, 이는 에멀젼에 대한 친화도를 약간 감소시킬 수 있다는 한 가지 한계를 가졌다.
양전하를 띤 단백질을 사용하는SiO2 센서 표면의 변형이 후속 PNPE 코팅에 적합하다는 것이 밝혀졌다. SiO2 센서 표면과 PNPE 사이의 중간층으로서 PLL(폴리양이온 폴리펩타이드)의 설명된 구현은 고속 코팅 방법에 대한 개선임이 입증되었습니다. 임의의 이벤트, 예를 들어,SiO2 센서 상의 용액의 흐름으로부터의 임의의 성분의 비특이적 흡착에 의해 야기된 질량의 변화는 실험 결과(35)의 정확도에 영향을 미칠 수 있다. 따라서 스핀 코팅 후 PLL이 칩에서 일관된 품질을 유지하고 비특이적 흡착으로 인한 측정 오류를 피하기 위해 표면이 PNPE로 완전히 덮일 수 있도록 해야 했습니다. 동시에, PNPE-함유 이동상과의 접촉 동안ΔF 가 더 이상 변하지 않을 때, 칩 표면은 완전히 덮인 것으로 간주되었다. 이를 통해 검출된 신호가 bEV가 PNPE에 부착되어 생성되도록 했습니다. 우리는 QCM-D가 APC에 대한 PNPE의 높은 친화력을 반영하여 실시간으로 PNPE에 대한 bEV의 접착력을 보여주는 좋은 방법임을 입증했습니다. 불행하게도, 이 방법은 개별 세포와 전달 시스템 사이의 상호작용을 반영할 수 없었다. 따라서보다 정확한 결정을 위해서는 프로토콜의 추가 설계와 측정 절차의 최적화가 필요합니다.
bEV에 대한 PNPE의 높은 친화도를 분석한 후 향상된 내재화가 추가로 검증되었습니다. 우리는 항원의 강력한 세포 흡수가 PNPE의 높은 친화력과 상관 관계가 있음을 입증했습니다. PNPE는 항원의 효과적인 로딩을 위한 다단계 구조와 전달을 향상시키기 위해 세포막과의 다단계 접촉을 위한 유연성을 보유했습니다. 따라서 합리적으로 설계된 피커링 에멀젼은 세포막과의 강력한 상호 작용을 통해 세포 내재화 및 세포 내 경로를 자극했습니다. 이러한 장점을 입증한 PNPE는 백신 강화를 위한 새롭고 안전하며 효율적인 항원 전달 시스템의 개발에 빛을 비출 수 있습니다.
이 프로토콜은 면역 세포의 인지질 이중층에 대한 PNPE의 높은 친화력과 시험관 내에서 면역 세포로의 항원의 세포 내 전달을 성공적으로 입증했습니다. 따라서, 상이한 병원체로부터의 다양한 유형의 항원이 감염성 질환에 대한 보호를 부여하기 위해 제안된 프로토콜을 사용하여 전달되고 특성화될 수 있다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작업은 중국 국가 핵심 연구 개발 프로그램 (2021YFE020527, 2021YFC2302605, 2021YFC2300142)이 지원하는 프로젝트, 0에서 1까지 중국 과학원 기초 프론티어 과학 연구 프로그램 (ZDBS-LY-SLH040), 중국 국립 자연 과학 재단 혁신 연구 그룹 재단 (보조금 번호 21821005).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AddVax | InvivoGen | Vac-adx-10 | |
| Cell Strainer | Biosharp | BS-70-CS | 70 μm |
| Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) | Nikon | A1 | |
| Cy3 NHS Ester | YEASEN | 40777ES03 | |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1005 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| FITC Phalloidin | Solarbio | CA1620 | |
| Mastersizer 2000 Particle Size Analyzer | Malvern | ||
| Micro BCA protein Assay Kit | Thermo Science | 23235 | |
| Membrane emulsification equipment | Zhongke Senhui Microsphere Technology | FM0201/500M | |
| Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| NANO ZS | Malvern | JSM-6700F | |
| Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| Poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) | Sigma-Aldrich | 26780-50-7 | Mw 7,000-17,000 |
| Poly-L-lysine Solution | Solarbio | P2100 | |
| Poly (vinyl alcohol) (PVA) | Sigma-Aldrich | 9002-89-5 | |
| QSense Silicon dioxide sensor | Biolin Scientific | QSX 303 | Surface roughness < 1 nm RMS |
| Quartz Crystal Microbalance | Biosharp | Q-SENSE E4 | |
| RPMI Medium 1640 basic | Gibco | C22400500BT | L-Glutamine, 25 mM HEPES |
| Scanning Electron Microscopy (SEM) | JEOL | JSM-6700F | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | 111-02-4 |
References
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