Summary
För att rationellt utforma effektiva adjuvanser utvecklade vi poly-mjölksyra-co-glykolsyra nanopartikelstabiliserad Pickering-emulsion (PNPE). PNPE hade unik mjukhet och ett hydrofobt gränssnitt för potent cellulär kontakt och erbjöd antigenbelastning med högt innehåll, vilket förbättrade leveranssystemets cellulära affinitet till antigenpresenterande celler och inducerade effektiv internalisering av antigener.
Abstract
Den cellulära affiniteten hos mikro-/nanopartiklar är förutsättningen för cellulär igenkänning, cellulärt upptag och aktivering, vilket är avgörande för läkemedelsleverans och immunsvar. Den aktuella studien härrörde från observationen att effekterna av laddning, storlek och form av fasta partiklar på cellaffinitet vanligtvis beaktas, men vi inser sällan den väsentliga rollen av mjukhet, dynamiskt omstruktureringsfenomen och komplex gränssnittsinteraktion i cellulär affinitet. Här utvecklade vi poly-mjölksyra-co-glykolsyra (PLGA) nanopartikelstabiliserad Pickering-emulsion (PNPE) som övervann bristerna i styva former och simulerade patogenernas flexibilitet och fluiditet. En metod inrättades för att testa affiniteten hos PNPE till cellytor och utarbeta den efterföljande internaliseringen av immunceller. Affiniteten hos PNPE till biomimetiska extracellulära vesiklar (bEV) - ersättningen för benmärgsdendritiska celler (BMDC) - bestämdes med hjälp av en kvartskristallmikrobalans med avledningsövervakning (QCM-D), vilket möjliggjorde realtidsövervakning av cellemulsionsadhesion. Därefter användes PNPE för att leverera antigenet (ovalbumin, OVA) och upptag av antigenerna av BMDC observerades med hjälp av konfokalt laserskanningsmikroskop (CLSM). Representativa resultat visade att PNPE omedelbart minskade frekvensen (ΔF) när den stötte på bEV: erna, vilket indikerar snabb vidhäftning och hög affinitet hos PNPE till BMDC: erna. PNPE visade signifikant starkare bindning till cellmembranet än PLGA-mikropartiklar (PMP) och AddaVax-adjuvans (betecknat som ytaktivt stabiliserad nanoemulsion [SSE]). På grund av den förbättrade cellulära affiniteten till immunocyterna genom dynamiska krökningsförändringar och laterala diffusioner ökade dessutom antigenupptaget därefter jämfört med PMP och SSE. Detta protokoll ger insikter för att designa nya formuleringar med hög cellaffinitet och effektiv antigeninternalisering, vilket ger en plattform för utveckling av effektiva vacciner.
Introduction
För att bekämpa epidemiska, kroniska och infektionssjukdomar är det absolut nödvändigt att utveckla effektiva adjuvanser för profylaktiska och terapeutiska vaccinationer 1,2. Helst bör adjuvanserna ha utmärkt säkerhet och immunaktivering 3,4,5. Effektivt upptag och process av antigener av antigenpresenterande celler (APC) tros vara ett viktigt steg i nedströms signalkaskaderna och initiering av immunsvaret 6,7,8. Att få en tydlig förståelse för mekanismen för interaktion mellan immunceller och antigener och utforma adjuvanser för att förbättra internaliseringen är därför effektiva strategier för att förbättra vaccinernas effektivitet.
Mikro-/nanopartiklar med unika egenskaper har tidigare undersökts som antigenleveranssystem för att förmedla det cellulära upptaget av antigener och den cellulära interaktionen med patogenassocierade molekylära mönster 9,10. Vid kontakt med celler börjar leveranssystem interagera med den extracellulära matrisen och cellmembranet, vilket ledde till internalisering och efterföljande cellulära svar11,12. Tidigare studier har visat att internaliseringen av partiklar sker genom cellmembran-partikeladhesion13, följt av flexibel deformation av cellmembranet och diffusion av receptorn till ytmembranet14,15. Under dessa omständigheter beror leveranssystemets egenskaper på affiniteten till APC: er, vilket därefter påverkar upptagningsmängden16,17.
För att få insikter i utformningen av leveranssystemet för förbättrat immunsvar har omfattande ansträngningar fokuserats på att undersöka sambandet mellan partiklarnas egenskaper och cellulärt upptag. Den aktuella studien härrörde från observationen att fasta mikro-/nanopartiklar med olika laddningar, storlekar och former ofta studeras i detta ljus, medan fluiditetens roll i antigeninternalisering sällan undersöks18,19. Faktum är att under vidhäftning visade de mjuka partiklarna dynamiska krökningsförändringar och laterala diffusioner för att öka kontaktytan för multivalenta interaktioner, som knappast kan replikeras av de fasta partiklarna20,21. Dessutom är cellmembran fosfolipid-dubbelskikt (sfingolipider eller kolesterol) vid upptagsstället, och hydrofoba ämnen kan förändra konformationsentropin hos lipider, vilket minskar mängden energi som krävs för cellulärt upptag22,23. Således kan förstärkning av rörlighet och främjande av hydrofobicitet i leveranssystemet vara en effektiv strategi för att stärka antigeninternalisering för att förbättra immunsvaret.
Pickeringemulsion, stabiliserad av fasta partiklar monterade i gränssnittet mellan två oblandbara vätskor, har använts i stor utsträckning inom det biologiska fältet24,25. Faktum är att de aggregerande partiklarna på olje-/vattengränssnittet bestämmer formuleringen av flernivåstrukturer, som främjar flernivåleveranssystem-cellulära interaktioner och ytterligare inducerar multifunktionella fysiokemiska egenskaper vid läkemedelsleverans. På grund av deras deformerbarhet och laterala rörlighet förväntades Pickering-emulsioner komma in i multivalent cellulär interaktion med immunocyterna och kännas igen av membranproteinerna26. Dessutom, eftersom oljiga micellkärnor i Pickering-emulsioner inte är helt täckta med fasta partiklar, har Pickering-emulsioner luckor av olika storlekar mellan partiklar på olje-vattengränssnittet, vilket orsakar högre hydrofobicitet. Således är det viktigt att utforska affiniteten hos Pickering-emulsioner till APC: er och utarbeta den efterföljande internaliseringen för att utveckla effektiva adjuvanser.
Baserat på dessa överväganden konstruerade vi en PLGA-nanopartikelstabiliserad Pickering-emulsion (PNPE) som ett fluiditetsvaccinleveranssystem som också hjälpte till att få värdefulla insikter i PNPE: s affinitet till BMDC och cellulär internalisering. Realtidsadhesionen av biomimetiska extracellulära vesiklar (bEVs; en ersättning av BMDC) till PNPE övervakades via en etikettfri metod med hjälp av en kvartskristallmikrobalans med avledningsövervakning (QCM-D). Efter karakterisering av affiniteten mellan PNPE och BMDC användes konfokal laserskanningsmikroskopi (CLSM) för att bestämma antigenupptaget. Resultatet indikerade den högre affiniteten mellan PNPE och BMDC och den effektiva internaliseringen av antigenet. Vi förväntade oss att PNPE skulle uppvisa högre affinitet till APC: er, vilket bättre kan stimulera internaliseringen av antigener för att förbättra immunsvaren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som beskrivs i detta protokoll har godkänts av Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences. Alla djurförsök utfördes i strikt överensstämmelse med reglerna för vård och användning av försöksdjur och riktlinje för etisk granskning av djur (Kina, GB / T35892-2018).
1. Beredning och karakterisering av PLGA-nanopartiklar
- Beredning av PLGA-nanopartiklar (PNP)
- Tillsätt 0,5 g polyvinylalkohol (PVA) till 120 ml avjoniserat vatten vid 90 °C och rör om tills det är helt upplöst för att bereda PVA-lösningen. Förvara lösningen i kylskåp (4 °C) efter kylning till rumstemperatur.
- Tillsätt 100 mg PLGA till 10 ml aceton och etanolblandning (förhållandet 4:1) för att fungera som oljefas.
- Placera 20 ml PVA-vattenlösning under dragskåpet och rör om magnetiskt vid 400 rpm/min. Tillsätt 5 ml av oljefasen i PVA-lösningen droppe för droppe med en sprutpump. Rör sedan om blandningen i dragskåpet tills de organiska lösningsmedlen avdunstar helt.
OBS: Med ökningen av koncentrationen av partiklarna i oljefasen förvandlas vattenfaslösningen gradvis till en klar och transparent ljus blåvit eller mjölkvit. - Efter förångning av organiska lösningsmedel (2-3 h), centrifugera blandningen vid 15 000 x g. Tvätta tre eller flera gånger tills det slutliga tvättvattnet är klart och transparent.
OBS: Syftet med detta steg är huvudsakligen att tvätta bort den återstående PVA på partikelytan för att förhindra att den påverkar Pickering-emulsionspreparatet. - Suspenderade de tvättade PNP:erna på nytt i 2 ml avjoniserat vatten och frys blandningen vid -80 °C i 24 timmar. Därefter frystorka partiklarna i en lyofilisator i 48-72 timmar. De beredda PNP: erna är vita flockiga.
- Karakterisering av PNP
- För att karakterisera storleken och zetapotentialen hos PNP: er, tillsätt 10 μL PNP i 1 ml avjoniserat vatten för att erhålla utspädningslösning och överför utspädningslösningen till en DTS1070-cell. Slå på datorn och DLS (Dynamic Light Scattering Analyzer) och placera sedan DTS1070-cellen i DLS-systemet.
- Klicka på Zeta Size Software och skapa en ny mätfil för att ställa in bestämningsproceduren. Starta sedan bestämningsproceduren för att erhålla partikelstorlek och zetapotentialfördelning.
- För att observera PNPs morfologi, fördela 0,1 ml PNP-lösningen jämnt (utspädd 40 gånger) på ett 5 cm x 5 cm tennfolieark och låt vattnet avdunsta naturligt i en väl ventilerad dragskåp över natten.
- Skär ut en liten del av tennfolien och säkra den på provbordet med ledande tejp. Spraya det med guld vid en ström på 10 mA i 120 s. Observera därefter provets ytmorfologi med hjälp av svepelektronmikroskopi (SEM).
2. Beredning och karakterisering av PNPE
- För att bereda PNPE, tillsätt frystorkade PNP till avjoniserat vatten i en koncentration av 4 mg / ml (vattenfasen) och tillsätt sedan skvalen som oljefas. Förbered PNPE via enstegs ultraljudsbehandling för 5 min vid 100 W i en vattenbad sonicator. Olje-vattenfasförhållandet är 1:9.
- Karakterisering av den beredda PNPE
- Öppna Mastersizer 2000-programvaran och lasern i följd. Klicka på Mått för att öppna det förinställda programmet och ställa in provnamnet. Klicka på Start för att börja mäta provets bakgrund och tillsätt sedan 1 ml PNPE till provtanken på laserpartikelstorleksanalysatorn med hjälp av en droppare för att mäta emulsionens partikelstorlek tre gånger parallellt.
- Späd 20 μl PNPE i 1 ml avjoniserat vatten. Släpp 20 μL av emulsionen på bilden. Observera emulsionens morfologi och homogenitet med optisk mikroskopi vid 40x förstoring och få fotografier.
- Antigen laddning effektivitet
- Lös upp 200 μg ovalbumin (OVA) i 500 ml avjoniserat vatten. Blanda sedan med 500 ml beredd PNPE och skaka i 1 timme vid rumstemperatur. Ta bort det fluidiska antigenet genom centrifugering vid 5000 x g i 20 minuter.
- Bestäm de fluidiska antigenkoncentrationerna med hjälp av bicinchoninic acid (BCA) analyser27. Formeln för beräkning av antigenbelastningseffektiviteten är följande:
Antigenbelastningseffektivitet =
Använd samma metod för att bestämma antigenbelastningseffektiviteten hos SSE som används som kontrollgrupp.
- PNPE: s stabilitet
- Dela upp 6 ml av den beredda PNPE i sex lika stora delar och förvara tre delar vardera vid 4 °C respektive 25 °C. Späd 20 μl lagrad PNPE i 1 ml avjoniserat vatten (1:50) dag 0, 3 och 6. Mät sedan storleken och zetapotentialen hos PNPE-lagerlösningarna som hålls vid olika temperaturer.
OBS: De olika lagringstemperaturerna är inställda för att jämföra effekten av olika temperaturer på PNPE: s stabilitet, vilket kan optimera lagringsförhållandet för hög stabilitet och lång hållbarhet.
- Dela upp 6 ml av den beredda PNPE i sex lika stora delar och förvara tre delar vardera vid 4 °C respektive 25 °C. Späd 20 μl lagrad PNPE i 1 ml avjoniserat vatten (1:50) dag 0, 3 och 6. Mät sedan storleken och zetapotentialen hos PNPE-lagerlösningarna som hålls vid olika temperaturer.
- Beredning av PLGA-mikropartiklar (PMP)
- Lös upp 500 mg PLGA i 5 ml diklormetan som oljefas och häll sedan i 50 ml extern vattenfas innehållande 1,5% PVA för att erhålla olja/vattenblandningen. Homogenisera blandningen vid 3000 rpm i 1 min med användning av en homogenisator för att erhålla grovemulsioner.
- Bibehålla enhetligheten hos PLGA-partikelstorleken hos mikrosfärer (bestämd av grovemulsioner) genom membranemulgering. Installera ett 5,2 μm membran i membranröret. Justera trycket till 800 kPa och håll dig stadig.
- Öppna avgasventilen och matningsventilen, och efter att ha tillsatt grovemulsionerna till provtanken, stäng avgasventilen och matningsventilen, öppna utloppsventilen och inloppsventilen och ta efterfilmemulsionen i en 200 ml bägare. Upprepa processen tre gånger för att erhålla pre-dubbla emulsioner.
- Rör om de pre-dubbla emulsionerna för att avdunsta diklormetan vid rumstemperatur för att härda mikrosfärerna. Tvätta mikrosfärerna med avjoniserat vatten vid 7741 x g i 3 min fem gånger. Förfrys i en frys vid -80 °C och frys slutligen för att få torkade mikrosfärer.
- Karakterisering av PMP
- Öppna Mastersizer 2000-programvaran och lasern i följd. Klicka på Mått för att öppna det förinställda programmet och ställa in provnamnet. Klicka på Start för att börja mäta bakgrunden till provet. Tillsätt sedan 1 ml PMP till provtillförseltanken i laserpartikelstorleksanalysatorn med en droppare och mät mikropartiklarnas partikelstorlek tre gånger parallellt.
- Mjukhetsanalys
OBS: PNPE belades på SiO2-sensorn för att mäta mjukheten.- Rengör SiO 2-kvartssensorchipet genom UV-ozonbehandling i 10 minuter, skölj två gånger med 5 ml etanol (75% v/v) och torka med N2. Installera det tomma SiO 2-kvartssensorchipet i flödescellen.
- Slå på datorn och aktivera temperaturkontrollen längst ned till höger i programvaran för att säkerställa att den inställda temperaturen är cirka 1 °C under rumstemperatur.
- Klicka på knappen Förvärv i verktygsfältet och välj Inställningsmätning för att söka efter 1, 3, 5, 7, 9 och 11 oktaver av chipet i den använda kanalen. Klicka på knappen Förvärv i verktygsfältet och välj Starta mätning.
- Korrigera baslinjen med luft och när baslinjen är balanserad väljer du Stoppa och sparar filen som tom.
- Rengör chipet och snurra 10 μg/ml PNPE på chipet. Kortfattat, slå på spinnbeläggningen och ställ in driftsparametern. Anslut N2-röret till spinnbeläggningen, justera fraktioneringen av gascylindern till 0,4 kPa och placera det rena chipet på sugkoppen på spinnbeläggningen. Tillsätt 100 μL PNPE droppvis i mitten av SiO 2-sensorn och stäng topplocket på spinnbeläggningen för att slutföra beläggningen.
- Installera det PNPE-belagda chipet i flödescellen. Upprepa steg 2.7.3-2.7.4 och spara filen som PNPE. Öppna både de tomma filerna och PNPE-filerna och klicka på Stitch-knappen för att få relaterade data för avledning (ΔD).
3. Isolera och odla BMDC 28
OBS: Se till att alla reagenser och prover placeras på is, eftersom detta har en positiv effekt på cellaktiviteten. För att upprätthålla sterilitet, utför alla steg på en ultraren bänk med sterila redskap.
- Avliva C57BL/6 (hona, 6-8 veckor gamla) möss via CO2 inandning och blötlägg dem i etanol 70% (v/v) för en kort sterilisering.
- Efter blötläggning i 3-5 minuter, överför mössen till en superren bänk. Ta bort benmusklerna med sax i rostfritt stål för att exponera lårbenet och skenbenet och separera sedan lårbenet och skenbenet.
- Fyll en petriskål med 70% (v / v) etanol och blötlägg de rena benen i den i 5-10 s för att slutföra extern sterilisering. Rengör alla ben och placera dem i ett sterilt rör med is runt dem.
- Trimma lårbenet och skenbenet nära fogen med sax. För in sprutnålen i benet för att spola ut benmärgen i ett centrifugrör med förkylt RPMI-medium (1640).
- Skölj två eller tre gånger tills benet är helt vitt. Pipettera benmärgen flera gånger för att separera alla klumpar. Filtrera cellerna i ett 15 ml centrifugrör med en sikt med en diameter på 40 μm.
- Centrifugera vid 4 °C och 500 x g i 5 minuter. Kassera supernatanten och tillsätt 2 ml erytrocytlysat till sedimentet i 4 minuter.
- Efter tvättning två eller tre gånger, suspendera cellerna igen i 2 ml komplett medium (1 % penicillin-streptomycin, 10 % fetalt bovint serum, 20 ng/ml IL-4 och 10 ng/ml GM-CSF). Späd sedan 10 μl celler i 1 ml PBS och sätt in chipet på den handhållna automatiserade cellräknaren i cellutspädningen för cellräkning. Slutligen fröceller med en densitet av 1 x 106 celler/ml i en 10 mm odlingsskål med ett komplett medium.
- Odla cellerna i en cellinkubator med 5%CO2 vid 37 °C. Byt medium var 2: e dag. På dag 7, överför cellerna till 50 ml rör och centrifugera vid 450 x g i 5 minuter för att samla cellerna.
4. Beredning av biomimetiska extracellulära vesiklar (bEV)
- Montera mini-extrudern i följd enligt tillverkarens instruktioner. Se till att spruthuset inte är sprucket innan du använder det. Se till att alla O-ringar är i gott skick före varje experiment och byt ut slitna eller skadade omedelbart. Slitna eller skadade O-ringar kan orsaka plötslig tryckavlastning vid användning av extrudern.
- Aspirera BMDC: erna upprepade gånger och överför dem till ett centrifugrör. Skörda cellerna genom centrifugering vid 450 x g i 5 minuter vid 4 °C. Tryck cellsuspensionerna genom 10 μm, 5 μm och 1 μm polykarbonatmembran i 30 pass med mini-extruder29.
OBS: För att möjliggöra likformighet i bEV-storlek pressades BMDC-suspensionerna genom 10 μm, 5 μm och 1 μm polykarbonatmembran i 30 pass. Dessutom, under drift, se till att applicera kraft jämnt och bibehålla kraftriktningen längs sprutans axel. - Centrifugera de poolade supernatanterna i 5 minuter vid 1000 x g och 4 °C för att avlägsna cellerna. Samla upp supernatanten och centrifugera den vid 3000 x g i 5 minuter vid 4 °C för att avlägsna återstående celler och cellrester.
- Samla supernatanten och centrifugera den vid 100 000 x g i 90 minuter vid 4 °C. Kassera supernatant och stäng av bEVs igen i 2 ml HEPES-buffrad saltlösning (HBS). Rena bEVs via filtrering genom ett 0,45 μm membran och förvara de renade bEVs vid −80 °C.
5. bEVs följer PNPE
OBS: SiO2-sensorn modifierades via spinnbeläggningsmetod.
- SiO2-sensor modifierad med poly-L-lysin (PLL).
- Rengör SiO 2 kvartssensorchipet med UV-ozonbehandling i 10 minuter, skölj två gånger med etanol och torka med N2.
- Slå på spinnbeläggningen genom att trycka på strömbrytaren , tryck på kontrollknappen och ställ in beläggningstid och hastighet. Den ursprungliga rotationshastigheten är 400 rpm, vilket stadigt ökas till 5000 rpm.
- Anslut N2-röret till spinnbeläggningen och justera fraktioneringen av gascylindern till 0,4 kPa. Placera det rena chipet på sugkoppen på spinnbeläggningen. Tillsätt 100 μL PLL droppvis till mitten av SiO 2-sensorn och stäng topplocket på spinnbeläggningen.
- Tryck på Start-knappen för att börja belägga provet och stoppa maskinen när den är klar. Stäng av vakuumpumpen, stäng av ström - och kontrollknapparna och ta bort den PLL-modifierade SiO2-sensorn .
OBS: Innan du trycker på Start, se till att beläggningstiden och hastigheten har ställts in. Se också till att SiO2-sensorn är placerad i mitten av sugkoppen. Se till att locket är stängt innan du kör processen för att förhindra olyckor.
- Bestämning av vidhäftning av bEV till PNPE
- Slå på datorn, den elektroniska enheten, den peristaltiska pumpen och aktivera temperaturkontrollen längst ner till höger i programvaran för att säkerställa att den inställda temperaturen är cirka 1 °C under rumstemperatur.
- Placera de PLL-modifierade SiO2-sensorerna i flödescellen enligt bruksanvisningen och anslut mätlinjen mellan flödescellen och flödespumpen. Placera flödescellen inuti flödesmodulsystemet och skölj dem med ultrarent vatten innan experimenten påbörjas.
- Klicka på verktygsfältet Förvärv och välj Inställningsmätning för att söka efter 1, 3, 5, 7, 9 och 11 oktaver av chipet i den använda kanalen. För att korrigera baslinjen, klicka på Starta mätning för att låta luft komma in i flödesmodulen tills luftbaslinjen är jämn. Därefter flöda avjoniserat vatten i 10-15 minuter för att möjliggöra lösningens baslinjejämvikt igen.
- Pumpa in den förberedda PNPE-lösningen i flödesmodulen med en flödeshastighet på 50 μl/min för att uppnå jämviktsadsorption på SiO2-sensorn .
OBS: ΔF ändras inte längre när PNPE pumpas in i flödesmodulen igen, vilket indikerar att ytan på SiO 2-sensorerna har täckts helt med PNPE. - Pumpa den förberedda bEVs-lösningen i flödesmodulen med en flödeshastighet på 50 μl/min för att spåra processen med bEV-vidhäftning till PNPE-ytan.
6. CLSM-analys av antigenupptag
- Samkultur PNPE-OVA med BMDC
- Inkubera BMDC med 1640 kompletta medier (1% penicillin-streptomycin, 10% fetalt bovint serum, 20 ng / ml IL-4 och 10 ng / ml GM-CSF) i 7 dagar och frö dem sedan i små konfokala laserrätter vid 1 x 106 per brunn över natten vid 37 ° C i en 5% CO 2-inkubator.
- Blanda 0,5 ml Cy5-märkt OVA (400 μg/ml) med 0,5 ml PNPE i 1 timme och avlägsna det fluidiska antigenet genom centrifugering vid 5000 x g i 20 minuter för att utveckla vaccinformuleringen. Efter återsuspension med 200 μl avjoniserat vatten, tillsätt 10 μl av formuleringen (10 μg/ml OVA) i de små konfokala laserdiskarna under en superren bänk och samkultur med BMDC i 6 timmar.
- Aktin cytoskelett fläck
- Ta bort odlingsvätskan från cellerna och tvätta dem två gånger med förvärmd fosfatbuffrad saltlösning (PBS; pH 7,4).
- Fixera cellerna med 4% formaldehydlösning i PBS i 10 min vid rumstemperatur. Under fixering, undvik fixeringsmedel som innehåller metanol, vilket kan förstöra aktin.
- Tvätta cellerna med PBS två eller tre gånger vid rumstemperatur i 10 minuter vardera. Permeabilisera cellerna med 100 μL 0,5% Triton X-100 lösning i 5 min vid rumstemperatur. Tvätta cellerna med PBS två eller tre gånger vid rumstemperatur i 10 minuter vardera igen.
- Täck cellerna på den glasbottnade skålen i de små konfokala laserskålarna med 200 μL fluoresceinisotiocyanat (FITC)-konjugerad falloidinarbetslösning och inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur i mörkret. För att minska bakgrundssignalen, tillsätt 1% bovint serumalbumin till den FITC-konjugerade falloidinarbetslösningen. Täck dessutom locket på de små konfokala laserskålarna under inkubation för att förhindra avdunstning av lösningen.
- Tvätta cellerna med PBS tre gånger i 5 min vardera. Färga kärnorna igen med 200 μL DAPI-lösning (koncentration: 100 nM) i cirka 30 s.
- Bildanalys
- Slå på konfokalmikroskophårdvaran i följd, inklusive laser, konfokal, mikroskop och dator. Klicka på NIS-Elements AR 5.20.00-programvaran och välj Nikon Confocal för att komma in i testsystemet.
- I det konfokala mikroskopsystemet, slå på de olika enheterna i den ordning som noteras. Ställ först in FITC-, DAPI- och Cy5-kanalerna och justera motsvarande HV och förskjutning. Välj sedan 100x oljelinsen och lägg en droppe cederolja på toppen. Placera de små konfokala laserdiskarna som innehåller färgade BMDC på mikroskopsteget.
- Klicka på knappen Skanna . Under ett fluorescensmikroskop, lokalisera celler av intresse genom att flytta X-axeln, Y-axeln och Z-axeln. Ställ in laserintensiteten, bildstorleken och andra parametrar för att möjliggöra skanning av konfokala bilder av hög kvalitet. Klicka slutligen på Capture-knappen och spara bilderna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En enkel sonifiering i ett steg användes för att erhålla PNPE. Först förberedde vi enhetliga PNP för användning som fast stabilisator (figur 1A). PNP: s morfologi observerades genom SEM, vilket visar att de mestadels är enhetliga och sfäriska (figur 1B). Formuleringarnas hydrodynamiska storlek och zetapotential detekterades via DLS. PNP: s diameter var 187,7 ± 3,5 nm och zetapotentialen var -16,4 ± 0,4 mV (figur 1C och tilläggstabell 1). För att förbereda PNPE var blandningen av PNP-lösning (0,4%, w / v) och skvalen helt enkelt sonikerad vid 100 w i 5 min (Figur 1D). Efter optimering av den kontinuerliga fasen bestod den erhållna PNPE internt av skvalen och adsorberades externt med PNP (kompletterande figur 1). Ett optiskt mikroskop användes för att observera emulsionsdropparna, och Mastersizer-partikelstorleksanalysatorn användes för att bestämma storleksfördelningen. PNPE uppvisade inte mindre partiklar för att förhindra emulsionernas koalescens och inga fler partiklar att överskottera i den kontinuerliga fasen som orsakar de större aggregaten (figur 1E). Som visas i figur 1F och tilläggstabell 1 var emulsionsstorleken 2100 ± 300 nm och zetapotentialen var -27,1 ± 0,5 mV, vilket indikerar att partiklarna aggregerades på gränssnittet mellan olja och vatten. För att observera det cellulära upptaget av antigen adsorberades den Cy5-lablade OVA på PNPE. Till att börja med blandades 500 μL PNPE med 500 μL Cy5-märkt OVA vid rumstemperatur i 1 h. Absorptionen av antigener på formuleringarna testades med användning av BCA-analys. På grund av dess höga specifika ytarea och hydrofobicitet adsorberades mer än 70,6% av de fluidiska antigenerna på PNPE inom 1 h, vilket indikerar betydande potential för att ladda stora mängder antigener på kort tid. Som kontrollgrupp karakteriserades också PMP och SSE. PMP:erna var av samma storlek (1987 ± 310 nm) som PNPE. SSE var negativt laddad emulsion (-15,9 ± 0,8 mV) med en diameterstorlek på 147,2 ± 0,5 nm. Dessutom var belastningseffektiviteten för PMP och SSE endast 25,6 % ± 0,6 % respektive 23,4 % ± 0,2 % på grund av den begränsade adsorptionen med antigener (tilläggstabell 1). För att utvärdera stabiliteten hos PNPE lagrades dessutom den beredda PNPE vid 4 °C respektive 25 °C. Stamlösningens storlek och zetapotential bestämdes på dagarna 0-6 (1:50 utspädning). Som framgår av kompletterande figur 2 förblev dropparna lika stora och zetapotentialen under lagring vid 4 °C och 25 °C tydde på högre stabilitet hos PNPE för tillförsel av antigener. Sedan användes QCM-D för att mäta flexibiliteten hos PNPE. Som visas i figur 1G uppvisade PMP: erna som ett resultat av sin styva struktur lägre avledning (ΔD). Samtidigt hade PNPE en signifikant högre ΔD, vilket visar dess utmärkta viskoelasticitet och flexibilitet, vilket kan vara en av anledningarna till förbättrad cellbindning och upptag.
För att validera affiniteten mellan PNPE och BMDC-membranet användes bEV: erna för att ersätta de intakta cellerna på grund av deras passande storlek för exakt QCM-D-detektering. I denna process skördades de mogna BMDC: erna och extruderades seriellt genom polykarbonatmembranfilter som innehöll 10, 5 och 1 μm porstorlekar till beredda vesiklar i nanostorlek. De erhållna bEVs samlades upp och renades via ultracentrifugering och suspenderades på nytt i HEPES-buffrad saltlösning (figur 2A). Morfologin hos de negativt färgade bEVs undersöktes sedan med hjälp av transmissionselektronmikroskopi (TEM). En nanopartikelspårningsanalys (NTA) användes för att testa storleken på bEVs. Resultaten avslöjade att bEVs var slutna lipid-dubbelskiktade vesikulära former och fördelningen var homogen (figur 2B). NTA visade att storleksfördelningen för bEVs med toppdiameter på de renade bEVs var 131 nm (Figur 2C). Vi drog därför slutsatsen att bEV: erna var en typisk membranstruktur med enhetlig fördelning, vilket möjliggjorde mer noggrannhet i QCM-D-analysen som ersättning för BMDC.
Därefter spårades vidhäftningen av bEVs till PNPE med QCM-D. Först modifierades QCM-D SiO2-sensorn med PLL för att ge en positiv laddning för att därefter fixera PNPE på ytan och simulera bio-interfasprocessen. Det följdes omedelbart av att lägga till bEV-lösningen i kammaren för att belysa interaktionen mellan PNPE och bEV (figur 3A). Som visas i figur 3B indikerade den omedelbara minskningen av frekvensen (ΔF) en snabb vidhäftning av bEV till PNPE efter möte. Dessutom minskade ΔF med ökande bEV-koncentration, vilket återspeglar en koncentrationsberoende effekt. PNPE har en tätt packad yta för att stödja landningsplatsen; Dessutom uppvisade den dynamiska krökningsförändringar och lateral diffusion för potent cellulär kontakt, vilket resulterade i hög affinitet till BMDC. Däremot var PMP och SSE svagt bundna till bEV, även vid hög koncentration (80 μg / ml), vilket troligen berodde på brist på kontaktställen med immuncellerna (figur 3C).
Efter att ha bekräftat processen för vidhäftning till BMDC användes PNPE för att leverera antigen till BMDC: erna. För att direkt visualisera antigeninternaliseringsprofilerna in vitro blandades Cy5-märkt OVA med PMP, SSE och PNPE för att behandla med BMDC. Efter 6 timmars efterbehandling utfördes CLSM för att analysera det cellulära upptaget av Cy5-märkt OVA i BMDC. Som visas i figur 4A indikerade Cy5-OVA-fluorescenssignalen att den totala mängden antigen internaliserat i celler är signifikant högre i den PNPE-behandlade gruppen jämfört med den i PMP: erna och SSE-behandlade gruppen. Den kvantitativa analysen av cellulärt upptag utfördes vidare och visade en signifikant högre relativ intensitet av fluorescens i BMDC behandlade med PNPE än hos dem som behandlades med PMP och SSE (p < 0,001), vilket bekräftade observationen ovan (figur 4B). De erhållna resultaten visade att PNPE främjade antigeninternaliseringen och effektivt levererade antigenet intracellulärt. Följaktligen var upptagseffektiviteten hos antigener positivt associerad med leveranssystemets affinitet till riktade celler, och PNPE ökade effektivt antigencellupptaget via flernivåkontakt med cellmembranet.
Figur 1: Karakterisering av PLGA nanopartikelstabiliserad Pickering-emulsion. (A) Schematisk beskrivning av det experimentella förfarande som används för framställning av PLGA-nanopartiklar (PNP). (B) Svepelektronmikroskopi (SEM) bilder av PNP: er. Skalstreck = 200 nm. (C) Storleksfördelning av PNP. (D) Schematisk över det experimentella förfarande som används för framställning av nanopartikelstabiliserad pickeringemulsion (PNPE). (E) Optiska mikrografer av PNPE. Skalstreck = 20 μm. (F) Storleksfördelning av PNPE. (G) Kvartskristallmikrobalans med avledningsövervakning (QCM-D) analys av mjukheten hos PNPE, PLGA-mikropartiklar (PMP) och ytaktivt stabiliserad emulsion (SSE) genom detektion av avledning (ΔD). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Karakterisering av biomimetiska extracellulära vesiklar. (A) Schematisk beskrivning av det experimentella förfarande som används för framställning av biomimetiska extracellulära vesiklar (bEV). (B) Transmissionselektronmikroskopibilder (TEM) av bEV. Skalstreck = 200 nm. (C) Storleksfördelning av bEVs uppmätt med hjälp av nanopartikelspårningsanalys (NTA) (n = 3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Affinitet mellan PNPE och bEVs analyserade med QCM-D . (A) Schematisk för modifieringen av PLL-ytan genom PNPE-beläggning. (B) Förändringar i frekvens (ΔF) för PNPE efter påträffande av olika koncentrationer av bEV. (C) Jämförelse av förändringar i ΔF i PLGA-mikropartiklar (PMP), ytaktivt stabiliserad emulsion (SSE) och PNPE. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Upptaget av antigener. (A) Representativt diagram över det cellulära upptaget av antigener. Skalstreck = 20 μm. (B) Relativ intensitet fluorescens av cellulärt upptag av antigener. Grafen visar medelvärdet ± SEM från tre oberoende experiment. Envägs ANOVA användes för att analysera betydelsen av de observerade skillnaderna. p < 0,001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1: Optimering av kontinuerlig fas. (A) Optiska mikrografer av PNPE konstruerade av olika kontinuerliga faser. Skalstreck = 20 μm. (B) Emulsionernas storlek detekterades efter beredningen. Resultaten uttrycktes som medelvärde ± SEM (n = 3). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 2: PNPE:s stabilitet. Storlek (A) och zetapotential (B) för PNPE efter 0, 3 och 6 dagars lagring vid de angivna temperaturerna. Data visades som medelvärde ± SEM (n = 3). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande tabell 1: Karakteriseringar av formuleringarna. PNP, PNPE och SSE framställdes enligt det angivna protokollet. Storleksfördelningarna och zetapotentialen bestämdes av dynamisk ljusspridningsanalysator (DLS) eller Mastersizer partikelstorleksanalysator. Lastningseffektiviteten utvärderades med hjälp av BCA-analysen. Data visades som medelvärde ± SEM (n = 3). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi utvecklade PLGA nanopartikelstabiliserad olja/vattenemulsion som ett leveranssystem för förbättrad antigeninternalisering. Den förberedda PNPE hade en tätt packad yta för att stödja landningsplatsen och unik mjukhet och fluiditet för potent cellkontakt med immuncellmembranet. Dessutom erbjöd gränssnittet mellan olja och vatten antigenbelastning med högt innehåll, och amfifil PLGA gav PNPE hög stabilitet för transport av antigener till immunceller. PNPE kan snabbt fästa vid cellernas yta, vilket indikerar att PLGA-nanopartikelstabiliserad emulsion har en stark affinitet till cellmembranet för cellulärt upptag. Dessutom hade PNPE en hög säkerhetsprofil eftersom både skvalen och PLGA är Food and Drug Administration (FDA) godkända ingredienser30, vilket förväntas utnyttja säker överföring till kliniken.
PLGA: s molekylvikt och typen av kontinuerliga och dispergerade faser påverkade PNPE-egenskaperna, inklusive stabilitet och hydrofobicitet. I denna forskning valdes 17 kDa molekylvikt PLGA nanopartiklar som stabilisator och skvalen som spridningsfas, vilket resulterade i ökad stabilitet. Dessutom förenklade avjoniserat vatten som en kontinuerlig fas formuleringens sammansättning. Under detta tillstånd möjliggjorde PNPE effektiv montering av antigener och främjade leverans av antigener till immunceller. Dessutom användes metoden för ultraljudsbehandling i ett steg för att förbereda PNPE, vilket eliminerade den tråkiga processen och undvek risken för kontaminering. Det är viktigt att notera att leveranssystemet som består av PNP och skvalen måste vara en enhetlig kraft, annars bildas ingen emulsion eller den beredda PNPE är inte enhetlig i storlek.
Även om det var en extraordinär utmaning att studera affiniteten hos leveranssystemet till celler som utfördes in vivo, kan in vitro-studier hjälpa till att belysa processen som är involverad i cellulär vidhäftning och internalisering. Nyligen har detta problem fått mycket uppmärksamhet inom det biomedicinska området. Betydande ansträngningar har gjorts för att belysa partiklarnas affinitet till celler med hjälp av flödescytometri och CLSM-analys31,32. Även om dessa metoder ger en genomsnittlig avläsning på cellnivå, är de specifika dynamiska bindningsprocesserna mellan celler och leveranssystem inte lätt övervakade. Däremot beror QCM främst på en känslig piezoelektrisk kristall som ΔF förändras med massa. Förmågan att upptäcka små massförändringar gör det möjligt för QCM-D att övervaka de riktade molekylära interaktionerna. Tekniken kan användas för att övervaka realtidshändelser, vilket möjliggör studier av affinitet mellan PNPE och BMDC under olika förhållanden33.
Vidhäftningen till PNPE undersöktes med hjälp av bEV istället för intakta celler. Som de välkontrollerade enkla APC: erna tros bEV: er ärva de flesta egenskaperna hos modercellerna. I allmänhet fungerar extracellulära vesiklar med små och homogena partikelstorlekar bättre i vidhäftningsanalyser. Således framställdes bEV: erna via extrudering genom polykarbonatfilter med 10, 5 och 1 μm porstorlekar34. Diametern och utbytet av bEV kan kontrolleras genom att reglera antalet profiler och porstorleken på polykarbonatmembran. Det rekommenderas att göra 30 passager genom polykarbonatmembranen. Denna metod hade emellertid också en begränsning i att en del av membranet kan vara inverserat, vilket gör att proteinerna på DC-ytan kapslas in i bEV: erna, vilket något minskade affiniteten till emulsioner.
Det visades att modifieringen av SiO 2-sensorytorna med användning av positivt laddade proteiner var lämplig för den efterföljande PNPE-beläggningen. Den beskrivna implementeringen av PLL (Polycation polypeptide) som mellanskikt mellan SiO2-sensorytor och PNPE visade sig vara en förbättring för snabbbeläggningsmetoden. Förändringar i massa som orsakas av någon händelse, till exempel ospecifika adsorptioner av någon komponent från lösningsflödet på SiO2-sensorn, kan påverka noggrannheten i experimentella resultat35. Därför var det nödvändigt att säkerställa att PLL behöll en jämn kvalitet på chipet efter spinnbeläggning, och deras yta skulle täckas helt av PNPE för att undvika mätfel orsakad av ospecifik adsorption. Samtidigt, när ΔF inte längre förändrades under kontakten med den PNPE-innehållande mobila fasen, ansågs chipytan vara helt täckt. Detta säkerställde att de detekterade signalerna genererades genom vidhäftning av bEV till PNPE. Vi visade att QCM-D var en bra metod för att visa vidhäftningen av bEVs till PNPE i realtid, vilket återspeglar den höga affiniteten mellan PNPE och APC: er. Tyvärr kunde denna metod inte återspegla interaktionen mellan enskilda celler och leveranssystemet. Därför kommer en mer exakt bestämning att kräva ytterligare utformning av protokollet och optimering av mätproceduren.
Efter att ha analyserat den höga affiniteten mellan PNPE och bEV verifierades förbättrad internalisering ytterligare. Vi visade att det potenta cellulära upptaget av antigener korrelerade med PNPE: s höga affinitet. PNPE hade flernivåstrukturen för effektiv laddning av antigener och flexibilitet för kontakt på flera nivåer med cellmembranet för att förbättra leveransen. Därför stimulerade den rationellt utformade Pickering-emulsionen cellulär internalisering och intracellulära vägar genom den robusta interaktionen med cellmembranet. Efter att ha visat dessa fördelar kan PNPE belysa utvecklingen av nya, säkra och effektiva antigenleveranssystem för att förbättra vacciner.
Detta protokoll visade framgångsrikt den höga affiniteten hos PNPE till fosfolipid-dubbelskiktet av immunceller och efterföljande intracellulär leverans av antigenet till immunceller in vitro. Därför kan olika typer av antigener från olika patogener levereras och karakteriseras med hjälp av det föreslagna protokollet för att ge skydd mot infektionssjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av projektet som stöds av Kinas nationella nyckelforsknings- och utvecklingsprogram (2021YFE020527, 2021YFC2302605, 2021YFC2300142), från 0 till 1 Original Innovation Project of Basic Frontier Scientific Research Program of Chinese Academy of Sciences (ZDBS-LY-SLH040), Stiftelsen för innovativa forskargrupper från National Natural Science Foundation of China (bidrag nr 21821005).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AddVax | InvivoGen | Vac-adx-10 | |
| Cell Strainer | Biosharp | BS-70-CS | 70 μm |
| Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) | Nikon | A1 | |
| Cy3 NHS Ester | YEASEN | 40777ES03 | |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1005 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| FITC Phalloidin | Solarbio | CA1620 | |
| Mastersizer 2000 Particle Size Analyzer | Malvern | ||
| Micro BCA protein Assay Kit | Thermo Science | 23235 | |
| Membrane emulsification equipment | Zhongke Senhui Microsphere Technology | FM0201/500M | |
| Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| NANO ZS | Malvern | JSM-6700F | |
| Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| Poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) | Sigma-Aldrich | 26780-50-7 | Mw 7,000-17,000 |
| Poly-L-lysine Solution | Solarbio | P2100 | |
| Poly (vinyl alcohol) (PVA) | Sigma-Aldrich | 9002-89-5 | |
| QSense Silicon dioxide sensor | Biolin Scientific | QSX 303 | Surface roughness < 1 nm RMS |
| Quartz Crystal Microbalance | Biosharp | Q-SENSE E4 | |
| RPMI Medium 1640 basic | Gibco | C22400500BT | L-Glutamine, 25 mM HEPES |
| Scanning Electron Microscopy (SEM) | JEOL | JSM-6700F | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | 111-02-4 |
References
- Ma, G., Gu, Z., Wei, W. Advanced vaccine delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 183, 114170 (2022).
- Sharma, J., Carson, C. S., Douglas, T., Wilson, J. T., Joyce, S. Nano-particulate platforms for vaccine delivery to enhance antigen-specific cd8(+) t-cell response. Methods in Molecular Biology. 2412, 367-398 (2022).
- Nguyen, T. P., et al. Safety and immunogenicity of nanocovax, a sars-cov-2 recombinant spike protein vaccine: interim results of a double-blind, randomised controlled phase 1 and 2 trial. The Lancet Regional Health. Western Pacific. 24, 100474 (2022).
- Coates, E. E., et al. Safety and immunogenicity of a trivalent virus-like particle vaccine against western, eastern, and venezuelan equine encephalitis viruses: a phase 1, open-label, dose-escalation, randomised clinical trial. The Lancet Infectious Diseases. 22 (8), 1210-1220 (2022).
- Wei, L., et al. Efficacy and safety of a nanoparticle therapeutic vaccine in patients with chronic hepatitis b: a randomized clinical trial. Hepatology. 75 (1), 182-195 (2022).
- Krishnan, R., Kim, J. O., Qadiri, S. S. N., Kim, J. O., Oh, M. J. Early viral uptake and host-associated immune response in the tissues of seven-band grouper following a bath challenge with nervous necrosis virus. Fish & Shellfish Immunology. 103, 454-463 (2020).
- Mishra, D., Mishra, P. K., Dubey, V., Dabadghao, S., Jain, N. K. Evaluation of uptake and generation of immune response by murine dendritic cells pulsed with hepatitis b surface antigen-loaded elastic liposomes. Vaccine. 25 (39-40), 6939-6944 (2007).
- Harwood, L. J., Gerber, H., Sobrino, F., Summerfield, A., Mccullough, K. C. Dendritic cell internalization of foot-and-mouth disease virus: influence of heparan sulfate binding on virus uptake and induction of the immune response. Journal of Virology. 82 (13), 6379-6394 (2008).
- Jing, H., et al. Fluorescent artificial antigens revealed extended membrane networks utilized by live dendritic cells for antigen uptake. Nano Letters. 22 (10), 4020-4027 (2022).
- Meena, J., Goswami, D. G., Anish, C., Panda, A. K. Cellular uptake of polylactide particles induces size dependent cytoskeletal remodeling in antigen presenting cells. Biomaterials Science. 9 (23), 7962-7976 (2021).
- Yang, J., et al. Drug delivery via cell membrane fusion using lipopeptide modified liposomes. ACS Central Science. 2 (9), 621-630 (2016).
- Rawle, R., Kasson, P., Boxer, S. Disentangling viral membrane fusion from receptor binding by using synthetic dna-lipid conjugates totether influenza virus to model lipid membranes. Biophysical Journal. 111 (1), 123-131 (2016).
- Ha, H. K., Kim, J. W., Lee, M. R., Jun, W., Lee, W. J. Cellular uptake and cytotoxicity of β-lactoglobulin nanoparticles: the effects of particle size and surface charge. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 28 (3), 420-427 (2015).
- Malara, A., et al. Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function. Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).
- Dankovich, T. M., et al. Extracellular matrix remodeling through endocytosis and resurfacing of tenascin-r. Nature Communications. 12 (1), 7129 (2021).
- Evans, E., Buxbaum, K. Affinity of red-blood-cell membrane for particle surfaces measured by the extent of particle encapsulation. Biophysical Journal. 34 (1), 1-12 (1981).
- Rohner, N. A., Purdue, L. N., Von Recum, H. A. Affinity-based polymers provide long-term immunotherapeutic drug delivery across particle size ranges optimal for macrophage targeting. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (4), 1693-1700 (2021).
- Zhou, X., Liu, Y., Wang, X. F., Li, X. M., Xiao, B. Effect of particle size on the cellular uptake and anti-inflammatory activity of oral nanotherapeutics. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces. 187, 110880 (2020).
- Zhang, D., et al. The morphology and surface charge-dependent cellular uptake efficiency of upconversion nanostructures revealed by single-particle optical microscopy. Chemical Science. 13 (12), 3610 (2022).
- Xi, Y. K., et al. Co2-responsive pickering emulsions stabilized by soft protein particles for interfacial biocatalysis. Chemical Science. 13 (10), 2884-2890 (2022).
- Trivedi, R. P., Klevets, I. I., Senyuk, B., Lee, T., Smalyukh, I. I. Reconfigurable interactions and three-dimensional patterning of colloidal particles and defects in lamellar soft media. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 109 (13), 4744-4749 (2012).
- De Araujo, A. D., Hoang, H. N., Lim, J., Mak, J. Y. W., Fairlie, D. P. Tuning electrostatic and hydrophobic surfaces of aromatic rings to enhance membrane association and cell uptake of peptides. Angewandte Chemie. 61 (29), 03995 (2022).
- Waku, T., et al. Effect of the hydrophilic-hydrophobic balance of antigen-loaded peptide nanofibers on their cellular uptake, cellular toxicity, and immune stimulatory properties. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3781 (2019).
- Meng, X., et al. A soft pickering emulsifier made from chitosan and peptides endows stimuli-responsiveness, bioactivity and biocompatibility to emulsion. Carbohydrate Polymers. 277, 118768 (2022).
- Wang, Z., et al. Fabrication and in vitro/vivo evaluation of drug nanocrystals self-stabilized pickering emulsion for oral delivery of quercetin. Pharmaceutics. 14 (5), 897 (2022).
- Ji, J., et al. Core-shell-structured silica/polyacrylate particles prepared by pickering emulsion: influence of the nucleation model on particle interfacial organization and emulsion stability. Nanoscale Research Letters. 9 (1), 534 (2014).
- Chen, l, et al. Quantitative evaluation of proteins with bicinchoninic acid (bca): resonance raman and surface-enhanced resonance raman scattering-based methods. Analyst. 137 (24), 5834-5838 (2012).
- Colino, J., Shen, Y., Snapper, C. M. Dendritic cells pulsed with intact streptococcus pneumoniae elicit both protein- and polysaccharide-specific immunoglobulin isotype responses in vivo through distinct mechanisms. The Journal of Experimental Medicine. 195 (1), 1-13 (2002).
- Zhang, Y., Wu, J., Zhang, H., Wei, J., Wu, J. Extracellular vesicles-mimetic encapsulation improves oncolytic viro-immunotherapy in tumors with low coxsackie and adenovirus receptor. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 574007 (2020).
- Cappellano, G., Abreu, H., Casale, C., Dianzani, U., Chiocchetti, A. Nano-microparticle platforms in developing next-generation vaccines. Vaccines. 9 (6), 606 (2021).
- McClelland, R. D., Culp, T. N., Marchant, D. J. Imaging flow cytometry and confocal immunofluorescence microscopy of virus-host cell interactions. Frontiers in Cellular Infection Microbiology. 11, 749039 (2021).
- Konry, T., Sarkar, S., Sabhachandani, P., Cohen, N. Innovative tools and technology for analysis of single cells and cell-cell interaction. Annual Reviews of Biomedical Engineering. 18 (1), 259-284 (2016).
- D'Aurelio, R., et al. A comparison of EIS and QCM nanoMIP-based sensors for morphine. Nanomaterials. 11 (12), 3360 (2021).
- Li, Y. J., et al. Artificial exosomes for translational nanomedicine. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 242 (2021).
- Rydell, G. E., Dahlin, A. B., Hook, F., Larson, G. QCM-D studies of human norovirus VLPs binding to glycosphingolipids in supported lipid bilayers reveal strain-specific characteristics. Glycobiology. 19 (11), 1176-1184 (2009).
