Summary
Denna metod beskriver provberedning från odlade celler och djurvävnader, extraktion och derivatisering av coenzym A i proverna, följt av vätskekromatografi med högt tryck för rening och kvantifiering av det derivatiserade coenzym A genom absorbans eller fluorescensdetektion.
Abstract
Framväxande forskning har visat att den cellulära coenzym A (CoA) utbudet kan bli begränsande med en skadlig inverkan på tillväxt, metabolism och överlevnad. Mätning av cellulära CoA är en utmaning på grund av dess relativt låga överflöd och den dynamiska omvandlingen av fri CoA till CoA thioesters att i sin tur delta i många metabola reaktioner. En metod beskrivs som navigerar genom potentiella fallgropar under provberedning för att ge en analys med ett brett linjärt detektionsområde som lämpar sig för användning i många biomedicinska laboratorier.
Introduction
Coenzym A (CoA) är en viktig kofaktor i alla levande organismer och syntetiseras från pantotensyra, även kallad pantothenate (salt av pantotensyra) eller vitamin B5. CoA är den största intracellulära bärare av organiska syror, inklusive korta kedjor syror såsom acetat och succinat, gren-Chain syror såsom propionat och metylmalonat, långkedjiga fettsyror såsom palmitat och oleat, mycket långkedjiga fettsyror som fleromättade fettsyror, och xenobiotika såsom valproinsyra. Den organiska syran bildar en Thioester sammanlänkning enzymatiskt med COA för att möjliggöra dess bruk som ett substrat i över 100 reaktioner i intermediär ämnesomsättning1. COA thioesters är också Alloster regulatorer och transkriptionella aktivatorer. Det är nu uppskattat2 att den cellulära totala COA utbudet regleras3,4; Således, CoA tillgänglighet kan vara begränsande, och att CoA brister kan vara katastrofala, som exemplifieras av ärftliga genetiska sjukdomar som påverkar CoA biosyntes5. Pantothenate Kinas katalyserar det första steget i COA biosyntes (figur 1) och pantothenate Kinas associerade neurodegeneration, kallas pkan, orsakas av mutationer i PANK2 genen6. CoA syntas, kodade av coasyn genen, katalyserar de två sista stegen i COA biosyntes (figur 1) och Coasy protein-associerad neurodegeneration, kallas Copan, orsakas av en mutation i coasyn genen7. Både pkan och Copan ärvs neurodegenerativa sjukdomar förknippade med järnansamling i hjärnan och COA brister un sjukdomens patologier.
Cellulära nivåer av totala CoA varierar mellan vävnader8 och totala COA kan öka eller minska under en mängd olika fysiologiska, patologiska och farmakologiska tillstånd. Lever CoA ökar under bränsle växling från Fed till fastande tillstånd9, och lever COA nivåer är onormalt hög hos leptin-bristfällig feta möss10. Lever CoA minskar som svar på kronisk etanol intag11. Hjärnan CoA nivåer i Pank2 knockout musmodellen är deprimerad under den perinatal perioden, men senare i vuxen stadiet hjärnan COA innehåll motsvarar Wild-typ nivåer, vilket indikerar en adaptiv COA svar under utveckling12. Manipulation av vävnad COA innehåll genom transgenes eller gen leveransmetoder påverkar metabola och neurala funktioner13,14,15. Preklinisk utveckling av potentiella terapier för pkan eller Copan inkluderar cell-eller vävnads COA-mätningar som indikatorer på effekt16,17,18,19,20 . Utvärdering av alla dessa villkor och deras metabola eller funktionella konsekvenser kräver en kvantitativ metod för mätning av total CoA.
En noggrann, tillförlitlig analys för att mäta CoA i biologiska prover är en teknisk utmaning i många laboratorier. Tyvärr, det finns inga sonder tillgängliga för att utvärdera eller kvantifiera CoA eller CoA thioesters i intakt celler, även om analoger av naturliga CoA thioesters har använts i stor utsträckning som mekanistiska sonder i studier av CoA Ester utnyttja enzymer21. Omvandlingen av CoA, med en fri sulfhydryl (-SH) del, till en CoA Thioester (eller vice versa) är snabb i celler eller djurvävnader under överföring till en annan miljö och under cell lysis. Många Acyl-CoA-syntetar och Acyl-CoA-tioesteraser i celler förmedlar interkonverteringarna inom CoA-poolen, och ytterligare enzymer som utnyttjar CoA-tioestrar som substrat förblir aktiva i biologiska prover tills de släckts av kemisk eller fysikalisk Innebär. Den off-loading av Acyl-grupper från CoA till karnitin av Acyl-transferases är ett exempel inom nätverket av reaktioner som kan förändra CoA/CoA Thioester distribution. Radioaktiva spårämnen kan användas för att mäta frekvenser av COA-syntes i celler. Nuvarande metoder för mätning av CoA-och CoA-derivat i biologiska prover har setts över22 och omfattar sammansatta enzymatiska spektrofotometriska analyser, högtrycks vätskekromatografi och masspektrometribaserade procedurer. Emellertid, dessa metoder är ofta inriktade på särskilda CoA molekylära arter och är blinda för variation av den totala CoA pool. De kopplade enzymatiska analyserna kräver i allmänhet större mängder inmatnings material på grund av låg detektionskänslighet och har ett begränsat utbud av linearitet.
Vårt laboratorium har utvecklat ett tillförlitligt förfarande för kvantifiering av total CoA i odlade celler och djurvävnader. Strategin omfattar hydrolys av alla CoA thioesters att ge endast gratis CoA under provberedning, snarare än att göra ansträngningar för att underhålla och analysera hela spektrumet av CoA arter. Förfarandet är en sammanställning av enskilda publicerade metoder för provberedning, CoA-derivatisering, rening och identifiering efter högtrycks vätskekromatografi (HPLC), och kvantifiering av det derivatiserade äkthetsbeviset genom absorbans eller fluorescensdetektion23,24,25. CoA bestämningar erhålls med hjälp av detta förfarande har möjliggjort vår förståelse av CoA reglering och utveckling av en terapeutisk metod för behandling av CoA brister.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Det djur förfarande som avses i detta protokoll utfördes i enlighet med protokollen 323 och 556 och godkändes särskilt av St. Jude Children ' s Research Hospital institutions djuromsorg och användnings utskott.
1. beredning av lösningar
Obs: Använd ultrarent vatten för alla lösningar och när det anges i procedurer.
- Bered 1 mM kaliumhydroxid (KOH) i vatten.
- Förbered 0,25 M KOH i vatten.
- Bered 1 M Trizma-HCl i vatten och justera till pH 8,0.
- Förbered 100 mM monobromobimane (mBBr) i acetonitril (Optima grade). Stocklösningar av mBBr är stabila vid-20 ° c under många månader förutsatt att de hålls i mörker som exponering för ljus kan photolyze den monobromobimane till bimane26.
- Förbered tvättbuffert för fast fas extraktion (SPE) kolumn: 50% metanol (Optima grade) + 2% ättiksyra.
- Förbered Elueringbuffert för SPE-kolonn: 95% etanol (HPLC-kvalitet) som innehåller 50 mM ammoniumformat.
2. beredning av CoA-bimane standard
- Köpa en hög kvalitet CoA standard från en ansedd källa (t. ex., Avanti Polar lipids, Inc.).
- Bered en hög koncentration lagerlösning av CoA i 20 mM Tris, pH 8. Mängden CoA i det höga koncentrations beståndet bestäms eller bekräftas genom spektrofotometrisk absorbans vid λ 260 Nm (ɛ = 16 800 M-1∙ cm-1). Tillsätt 4-faldig molar överskott av mBBr; Vortex på hög för 10 s. Till exempel, för 10 mM CoA i buffert, tillsätt 40 mM mBBr. MBBr tillsätts i överskott för att säkerställa att alla äkthetsbeviset är derivatized.
- Inkubera i rumstemperatur för 4 h i mörker utan att skaka för att derivatize äkthetsbeviset med mBBr. mBBr reagerar med tiolgruppen av äkthetsbeviset, och det är pH och temperaturberoende27. Tillsats av mBBr omvandlar CoA till en vattenlöslig fluorescerande (eller ultraviolett absorbant) CoA-bimane (CoA-bimane; Figur 2).
- Tillsätt 100 μL ättiksyra och Vortex på hög för 10 s för att stoppa reaktionen.
- Centrifugera vid 2 000 x g i 15 minuter för att avlägsna eventuella fällmedel.
- Städa upp supernatanten med hjälp av en SPE-kolonn för att ta bort den oreagerade mBBr (beskrivs nedan). Filtrering och centrifugering av eluatet behövs inte efter sanering av SPE-kolonnen (avsnitt 5,8).
- Samla upp eluatet från SPE-kolonnen som innehåller CoA-bimane i ett förvägt rör, torka under kvävgas, väg och konstruera en standard kalibreringskurva med kända kvantiteter av CoA-bimane.
- Kontrollera CoA-bimane-standarden för renhet med HPLC (se nedan) med absorbansdetektion vid både λ 260 (adenindel) och λ 393 (bimane-del) och sammanträffande av båda topparna i kromatogrammet.
- Bekräfta kvantiteten av CoA-bimane-standarden i det höga koncentrations beståndet med λ 260 Nm (ɛ = 16 800 M-1∙ cm-1).
- Registrera HPLC retentionstiden för identifiering av CoA-bimane i experimentella prover med hjälp av CoA-bimane standard.
- Förvara alikvoter av det höga koncentrations lagret av CoA-bimane-standarden som skyddas från ljus och förvaras vid-20 ° c i upp till 2 år. Undvik upprepad upptinning och åter frysning.
3. extraktion och derivatisering av CoA i odlade celler
- Skörda anhängare celler i kulturen när man närmar sig sena subconfluent tätheter. Till exempel, mänskliga HepG2/C3A celler odlas till en densitet av 6-8 x 106, eller hek 293T celler odlas till en densitet av ~ 1,3 x 107 per 100 mm skålen.
- Använd duplicerade eller tre exemplar kulturer rutinmässigt för COA bestämningar. Inkubera separata kultur rätter parallellt med prov cellkulturerna för att bestämma livskraftigt cell nummer. Beräkna mängden CoA per 106-107 celler efter HPLC rening.
- Aspirera kultur medium från skålen. Snabbt tvätta celler på skålen med iskall fosfat-buffrad saltlösning (PBS) för att ta bort alla kvarvarande medium och aspirera PBS från skålen. Snabbt tvätta celler med iskallt vatten för att ta bort resterande PBS och aspirera vattnet från skålen snabbt. Undvik att störa de adherenta cellerna när du lägger till PBS eller vatten.
- Tillsätt 1 mL iskallt vatten till kultur skålen. Skrapa celler i det kalla vattnet i skålen och överföra cellsuspensionen till ett glas provrör som innehåller 400 μL av 0,25 M KOH och 1,5 mL vatten.
- Blanda fjädringen kraftigt med Vortex på hög för 10 s. Täck sedan tätt med paraffin film och inkubera vid 55 ° c i 1 h utan att skaka i ett vattenbad. PH-värdet i provet bör vara ≥ 12. Det höga pH är viktigt att hydrolysera äkthetsbeviset thioesters och kan justeras med ytterligare alikvoter av KOH om det behövs.
- Skörd odlade celler som växer i suspension genom centrifugering vid låg hastighet: 136 x g för 6 min vid 4 ° c. Tvätta en gång med iskallt PBS, sedan kort tvätta igen med kallt vatten, och slutligen Omsuspendera i 2,5 mL kallt vatten plus 400 μL 0,25 M KOH. Blanda kraftigt och inkubera vid 55 ° c enligt beskrivningen ovan.
- Tillsätt 160 μL av 1 M Trizma-HCl och 10 μL 100 mM mBBr och blanda med Vortex på hög för 10 s. Detta ger pH till cirka 8 för att stödja mBBr reaktionen med gratis CoA. Täck över och inkubera proverna i rumstemperatur i 2 timmar i mörker för att mBBr ska reagera med tiolen av äkthetsbeviset.
- Tillsätt 100 μL ättiksyra och blanda med Vortex på hög för 10 s för att stoppa reaktionen
- Centrifugera vid 2 000 x g i 15 minuter för att avlägsna utfälld cellfragment.
- Ta bort och spara supernatanten i ett glas provrör för den SPE kolumn sanering som beskrivs nedan.
4. extraktion och derivatisering av CoA i vävnader
- Dissekera djurvävnad bitar, ca 0,5 cm diameter eller mindre, och blot kort (1-2 s) på absorberande papper och sedan blinka frysa i flytande kväve och förvara vid-80 ° c tills bearbetningen. CoA i vävnader hydrolyseras eller konverteras till en Thioester om inte blinkar fryst. Detta steg är viktigt att få maximal avkastning av CoA i vävnader.
- Väga frysta Vävnadsdelar (5 – 60 mg) snabbt innan analysen påbörjas och anteckna vikten för varje prov. Denna våtvikt bestämning används för beräkning av CoA-halten efter HPLC-rening. Undvik fullständig Tina av vävnaden bitar.
- Tillsätt 2 mL 1 mM KOH till ett glas provrör (t. ex. 13 mm x 100 mm engångsinstrument) avsett för införande av en sond och vävnads störning med en rotor-stator homogenisator. Håll röret på is tills det används. Detta görs för att säkerställa att proverna är homogeniserade vid en kall temperatur och CoA inte förstörs på grund av den värme som genereras under homogenisering.
- Överför och homogenisera vävnad (30 – 40 mg) i glaset provrör (som innehåller kallt 1 mM KOH) för 30 s. Undvik fullständig upptinning av vävnaden.
- Tillsätt 500 μL av 0,25 M KOH; Vortex på hög för 10 s och hålla på is tills alla prover är homogeniserade. Detta kommer att föra pH i provet över 12 att hydrolysera CoA thioesters att ge totalt CoA (fri CoA + hydrolyserad CoA thioesters).
- Inkubera proverna vid 55 ° c i 2 timmar i ett vattenbad utan att skaka för att stödja hydrolys.
- Tillsätt 150 μL av 1 M Trizma-HCl och 10 μL 100 mM mBBr. Vortex på hög i 10 sekunder. Detta ger pH till ca 8 för att stödja mBBr reaktionen med gratis CoA.
- Inkubera proverna i rumstemperatur i 2 timmar i mörker för att säkerställa att alla äkthetsbevis är derivatiserade med mBBr.
- Tillsätt 100 μL ättiksyra och Vortex på hög för 10 s för att stoppa reaktionen.
- Centrifugera vid 2 000 x g i 15 min till pellets utfälld cell skräp.
- Ta bort och spara supernatanten i ett glas provrör för den SPE kolumn sanering (beskrivs nedan).
5. prov sanering med solid Phase extraktion (SPE) kolumn
- Vid rumstemperatur, jämvikt varje disponibel 2-(2-klassen)-etylkiselgel kolonn (1 ml storlek) med 1 ml tvättbuffert för att säkerställa att den klassen funktionella gruppen är protonerade och kommer att fungera som en anjonbytare. 2-(2-pyridyl)-etylkiselgel är en svag anjonbytare som är idealisk för CoA-bimane vid ett basiskt pH. 2-(2-pyridyl)-etylkiselgel har en pKa på 6 och elueringen är klar pH ≥ 7.
- Lägg provet supernatanten (steg 4,11) till kolumnen och samla eluate.
- Tvätta kolonnen två gånger med 1 mL tvättbuffert för att avlägsna alla obehållna arter.
- Tvätta kolonnen en gång med 1 mL vatten.
- Tvätta kolonnen två gånger med 1 mL Elueringbuffert i ett separat glas prov rör (12 mm x 75 mm) för att samla in CoA-bimane.
- Torrt CoA-bimane prov i röret under kvävgas till torrhet. Det torkade provet är stabilt vid rumstemperatur tills det används ytterligare. Försegla och helt täcka röret och förvara.
- När du är redo för HPLC-analys, Omsuspendera provet i 300 μL vatten och blanda kraftigt med Vortex på hög för 10 s.
- Överför återsuspenderat prov till ett centrifugrör filter (0,22 μm cellulosaacetat, 2 mL storlek) och centrifugera vid 5 000 x g i 10 minuter för att avlägsna eventuella fällmedel.
- Överför filtrerat prov till en injektionsflaska av glas lämplig för HPLC-injektion.
6. HPLC rening och mätning av CoA-bimane
- Förbered buffertar. Buffert A: 50 mM KH2Po4, pH 4,6; Buffert B: acetonitril (Optima-klass).
- Slå på HPLC-systemet.
Anmärkning: HPLC-systemet i vårt laboratorium är en Waters e2695 Separeringsmodul utrustad med en 2489 ultraviolett-synlig (UV-VIS) absorbansdetektor och en 2475 fluorescensdetektor kontrollerad med Empower 3 programvara. Systemet har också en automatiserad prov spridare. - Injicera varje prov (t. ex. 20 μL) för separation på en Gemini C18, 3 μm 100 Å, 4,6 mm x 150 mm kolumn med hjälp av programmet i tabell 1 med en flödeshastighet på 0,5 ml/min. Kolonntemperaturen är 25 ° c. Mät den UV/synliga detektorns absorbans vid λ 393 nm och fluorescerande detektion vid λex = 393 nm, λem = 470 nm. Retentionstiden bestäms genom att köra en CoA-bimane standardkurva före varje uppsättning av prover.
- Spela in området under CoA-bimane-toppen för varje prov och jämför med standardkurvan för att beräkna pmol av CoA-bimane som injiceras på HPLC-kolonnen. COA-bimane absorbans standardkurva används för vävnadsprover, och COA-bimane fluorescens standard Curve används för vävnads odlingsprov.
- Eftersom CoA-bimane-värdena motsvarar det totala äkthetsbeviset för varje prov, normaliseras antalet livskraftiga celler för kulturprover, eller mg våtvikt för vävnadsprover (figur 6). Alternativt beräkna den totala CoA värden efter normalisering till DNA eller proteinhalt för varje prov. DNA eller proteinhalt kan bestämmas separat med hjälp av prov alikvoter som tas bort under provberedning före KOH tillägg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En relativt snabb och tillförlitlig metod för detektion av total CoA i odlade celler och vävnader har utvecklats genom derivatizing den thiol av CoA till en fluorescerande medel med hjälp av mBBr, och sedan rena derivatized CoA-bimane med omvänd fas HPLC. En standardkurva genereras först, där kända och ökande mängder av CoA-bimane-standarden injiceras individuellt och områdena under topparna i CoA-bimane-kromatogrammen ritas som en funktion av ingången CoA-bimane (figur 4). CoA-bimane har en maximal absorbans vid λ 393 nM och en representativ HPLC-profil visar retentionstiden för CoA-bimane-standarden på en C18 HPLC-kolonn (figur 3) med hjälp av elueringprogrammet i tabell 1. Representativa standardkurvor av CoA-bimane, detekterade genom mätabsorbans eller fluorescensenheter, visas i figur 4A respektive figur 4B. Standardkurvan i figur 4A återspeglar omfattningen av absorbans av COA-bimane vid λ 393 nm och figur 4B representerar fluorescensen hos coa-bimane (λex = 393 nm och λem = 470 nm) som är plottade kontra ingångs mängden för CoA-bimane. CoA-bimane-standarden kan detekteras från 0,01 till 12 000 pmol och täcker ett 106-faldigt intervall när detektering med både absorbans och fluorescens kombineras. Den undre detektionsgränsen för standarden är 0,01 pmol, men den undre gränsen för kvantifiering av CoA-bimane i experimentella prover är 0,2 pmol som är ungefär 5 gånger större än baslinjen eller bakgrundfluorescensen i kromatogrammet. Valet av detektion genom absorbans eller fluorescens av CoA-bimane beror på mängden äkthetsbevis som normalt finns i vävnader eller celler, tillsammans med det praktiska i att arbeta med större eller mindre urvalsstorlekar. Absorbans är i allmänhet användbart för vävnadsprover eftersom hantering av 40-50 mg utgångsmaterial ger bättre återhämtning än 5 mg vävnadsprover, medan fluorescens i allmänhet är användbart för odlade cellprov som är mindre i storlek och det finns större för interpolering av värden i den nedre änden av fluorescensstandardkurvan. Laboratorier med endast absorbansdetektion kan överväga att öka eller minska start provets storlek, öka injektionsvolymen HPLC eller minska volymen för prov resuspension (avsnitt 5,9 ovan) för mätningar i odlade celler.
Villkoren för hydrolyserande Acyl-COAS från vävnader och odlade celler optimerades genom att justera Koh koncentrationen, och tid och temperatur för efterföljande inkubation (data som inte visas). Det optimala villkoret konstaterades vara 0,25 M vid 55 ° c i 2 timmar. Den thiol gruppen av fria CoA plus någon CoA befriat från thioesters var derivatized vid reaktion med mBBr efter justering av pH. Efterföljande HPLC separation och typiska detektions profiler för mus lever eller mänskliga odlade C3A celler anges i figur 5 som röda toppar, med en retentionstid mellan 11 och 12 minuter med hjälp av elutionsprogrammet som beskrivs i tabell 1. Typiska mängder av biologiskt utgångsmaterial är 30-40 mg murin lever (våt vikt), 6-8 x 106 celler för mänskliga "LEVERLIKNANDE" C3A celler, eller ~ 1,3 x 107 celler för mänskliga HEK293T celler. De C3A cellerna behandlades med en PanK experimentell drog PZ-2891 vid 10 uM som höjer CoA17 (figur 6). CoA-mätningarna i HEK293T celler när PanK-isoformerna är överuttryckta visar CoA-mätningar över ett brett spektrum (431-6925 pmol/μL) (figur 6). De urvalsstorlekar som krävs för denna metod är praktiska för tillämpning i många experimentella sammanhang.
Området under CoA-bimane-toppen beräknades med hjälp av programvaran som tillhandahölls med HPLC. Topp gränserna kan bestämmas automatiskt av HPLC-programvaran i avvaktan på korrekt justering av ingångsvärden för baslinjekorrigering och Peak definition, men vårt laboratorium föredrar att manuellt utse CoA-bimane-toppen i varje kromatogram, särskilt för okända biologiska prover.
| Tid (min) | Flödeshastighet (mL/min) | % A | % B | Kurva |
| 0 | 0,5 | 90 | 10 | 0 |
| 2 | 0,5 | 90 | 10 | 6 |
| 6 | 0,5 | 85 | 15 | 6 |
| 18 | 0,5 | 60 | 40 | 6 |
| 23 | 0,5 | 60 | 40 | 6 |
| 25 | 0,5 | 90 | 10 | 6 |
| 30 | 0,5 | 90 | 10 | 66 |
Tabell 1: HPLC-program för separation av COA-bimane. Buffert A: 50 mM KH2Po4, pH 4,6; Buffert B: acetonitril. Blandningen av buffert A och buffert B följer kurva 6 som är en linjär gradient, med en mellanliggande kurva 8 som är en mellankonkav gradient.
Figur 1. Coenzym en biosyntes väg. Pantothenate Kinas (PanK) katalyserar fosforylering av pantothenate (vitamin B5) till 4 ′-fosfopantothenate i det första steget av COA biosyntes. Bildandet av fosfopantothenate följs av kondensation med cystein katalyseras av 4 ′-fosfopantothenoylcystein syntas och sedan dekarboxylering att bilda 4 ′-fosfopantetheine av 4 ′-fosfopanthenoylcystein decarboxylase. 4 ′-fosfopantetheine omvandlas till coenzym A (CoA) i en tvåstegsprocess katalyseras av CoA syntas. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. mBBr-reaktion med COA. Monobromobimane (mBBr) blandas med CoA-SH (Free CoA) och inkuberas vid rumstemperatur i 2 timmar i mörker. Icke-fluorescerande mBBr blir fluorescerande när bunden till CoA att bilda CoA-bimane. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: absorbans HPLC spår av COA-bimane standard. CoA-bimane separerades på en Gemini C18-kolonn med HPLC-programmet i tabell 1. Normal retentionstid (min) indikeras av aborbans enheter (AU). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: standardkurvor av COA-bimane upptäcks genom absorbans eller fluorescens. Astandardkurvan mätt med absorbansdetekterings enheter för COA-bimane mättes vid λ 393 nm. Vävnadsprover utvärderas vanligen med hjälp av standardkurvan för absorbans. Bstandardkurvan uppmätt med fluorescensdetekterings enheter för COA-bimane vid λex = 393 nm, λem = 470 nm. Odlade celler utvärderas vanligtvis för CoA-innehåll med fluorescensstandardkurvan. Duplicerade standarder (och prover) utvärderas rutinmässigt. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: HPLC-spår av typiska lever-eller odlade cellprov. (A) COA-bimane identifiering och kvantifiering av innehållet i mus lever extrakt. Absorbansenheter (AU) indikeras. BCOA-bimane identifiering och kvantifiering av innehållet i HEPG2/C3A odlade celler. Fluorescensutsläppsenheter (EU) anges. CoA-bimane toppar visas i rött. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. CoA nivåer i mus lever, odlade C3A och HEK293T celler. A) COA-mätning i mus levern från pantothenate Kinas knockout (Pank1-/-) och matchade Wild-Type (WT) djur. Pank1-/- djur har lägre COA i levern jämfört med WT djur på grund av avsaknad av Pank1 uttryck9. Data erhölls med 5 manliga möss per genotyp och representeras som medelvärdet ± SEM. (B) COA-nivåer i HEPG2/C3A-celler som behandlats med antingen dimetylsulfoxid (fordonskontroll) eller PZ-2891, ett experimentellt läkemedel som modulerar pank-aktivitet vid 10 UM 17. den cellulära COA-nivån är förhöjd efter 24-timmarsinkubering med PZ-2891. (C) COA nivåer i HEK293T celler transfekterade med antingen tomma Vector pcdna 3.1, eller cdnas kodning Human pank isoformer: PANK1β, PANK2m vilket är den mogna, bearbetade isoformen av mänskliga PANK2, eller PANK3. CoA-nivåerna höjs genom överuttryck av alla aktiva PANK-isoformer. Uppgifterna i (B) och (C) är från oberoende tre exemplar prover och representeras som medelvärdet ± SEM. Den statistiska analysen utfördes med hjälp av det ej parade t-testet och signifikansen av betydelse visas i rött. Data i panelerna (B) och (C) är anpassade från Sharma et al. 12vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här visar vi ett tillförlitligt steg-för-steg-förfarande för att kvantifiera total CoA i celler och djurvävnader med ett brett spektrum av linjär detektion som är tillgänglig i många laboratorier som har en HPLC med antingen en absorbans eller fluorescens utgång detektor. Alternativt, masspektrometri är en vanlig teknik för att utvärdera CoA och CoA thioesters, men är inte allmänt tillgänglig på grund av kostnaden för instrumenteringen och de specialiserade kunskaper som krävs för utveckling av metodik och tolkning av data. Isotopiskt märkt CoA som är lämplig för användning som en intern standard för kvantifiering av fri CoA i masspektrometri är inte kommersiellt tillgänglig, och gratis CoA inte upptäcks av instrumentet med samma känslighet som CoA thioesters såsom acetyl-CoA. Sålunda, fria CoA nivåer är ofta grovt underskattas av masspektrometri om inte utdata jämförs med en CoA standard kalibreringskurva.
Vi jämförde den metod som beskrivs här med en annan metod som tidigare använts i vårt laboratorium och fann större CoA återhämtning från mus lever, 123,4 ± 7,9 pmol/mg våt vikt, med denna nuvarande metod jämfört med ~ 80 pmol/mg våtvikt med hjälp av en enzymatisk analys som derivatized gratis CoA med en radioaktiv tagg28. Metoden för att mäta total CoA som beskrivs här är betydligt mindre besvärlig, snabbare och enklare att kontrollera jämfört med den metod som tidigare använts i vårt labb28. Tidigare, CoA bestämdes efter hexan extraktion av cellen lysate och utsätts för enzymatisk omvandling till radioaktiva [14C] lauryl-COA medierad av Escherichia coli Acyl-COA-syntetas (fadd). Den syra-lösliga kortkedjade Acyl-äkthetsbevis och syra-olösliga långkedjiga Acyl-äkthetsbevis i cellen lysate hydrolyserades med KOH att ge gratis CoA och sedan utsätts för hexan extraktion före den enzymatiska omvandlingen till fri CoA29. Även om detta tidigare förfarande hade god specificitet och känslighet, krävde uppgiften i praktiken att 2 arbetsdagar skulle slutföras och att den rekombinanta E. coli Acyl-COA-Synthetasen måste beredas, renas och mätas för enzymatisk specifik aktivitet innan CoA-analysen. Det krävdes också instrumentering som kunde detektera och kvantifiera radioaktiva isotoper, vilket är mycket mindre vanligt i biomedicinska laboratorier i nyare historia. Den nuvarande metoden som beskrivs här är mest lämplig för vårt forskningsintresse i pantothenate Kinas (PanK). Pank styr flödet genom COA biosyntetiska-vägen och så den totala COA-nivån är utläsning för pank-aktiviteten i biologiska prover.
Kylning av metaboliska reaktioner i ett biologiskt prov för att upprätthålla en sann mängd CoA kräver vård och snabbhet och är kritisk för denna procedur. Snabb deproteinisering med en syra eller organiskt lösningsmedel, eller blixt nedfrysning av prover är två metoder som har använts under de senaste30,31. I den nuvarande metoden, Ice-Cold ultrarent vatten läggs snabbt till iskalla PBS-tvättade celler från kulturer, och anhängare celler plus vatten skrapas sedan bort kultur skålen innan överföring till Koh. Frysning av den odlade cellsuspensionen i [KOH + vatten] för förvaring vid-80 ° c före provberedning är en godtagbar stopp punkt. Men CoA värden från frysta cellprover bör jämföras med dem från nyberedda prover för att avgöra om det finns betydande förlust av CoA-signalen. Förlust av ≤ 10% CoA har inträffat i våra händer efter cellprov frysning och kan relateras till den förlängda tiden för provet i KOH som måste kontrolleras. Djurvävnad bitar är snabbt frysta på en liten folie "flotte" flyter på LN2 omedelbart efter excision av vävnaden från ett euthanized djur. Urvalsstorlekar från 5 mg till 60 mg fryst vävnad är lämpliga för denna metod med linjär CoA avkastning. När frysta, vävnadsprover lagrade vid-80 ° c är stabila i minst 3 månader, förutsatt att intermittent Tina inte inträffar.
Provberedningen före HPLC-analysen är inte ett högt dataflöde och kräver en hel arbetsdag. Det rekommenderas att operatören hanterar högst 30 prover på en gång, börjar med homogenisering av en uppsättning av 15 prover följt av homogenisering av den andra uppsättningen av 15 prover under 2 h inkubering med KOH för den första uppsättningen. Den KOH inkubationstiden var först optimerad med hjälp av köpta CoA thioesters med inkubationstider som sträcker sig från 30 min till 4 h, och sedan 2 h inkubering valdes för att rymma tiden för fullständig CoA Thioester hydrolys i en mängd olika vävnadsprover, allt från skelettmuskulaturen till lever8. Inkubering för CoA-derivatisering med mBBr är inställd på 2 h vid ungefär pH 8 och ett 20-faldigt överskott av mBBr tillsätts för att helt konvertera äkthetsbeviset i de biologiska proverna. Sulhydryl av proteiner och andra metaboliter än CoA såsom karnitin eller glutation i provet kommer att derivatiseras förutom CoA, och 20-faldigt överskott beräknades på grundval av den förväntade mängden av totala CoA lever som har den högsta nivån bland vävnader. PH-värdet reduceras före inkubering med mBBr eftersom bromobimaner i allmänhet är mindre reaktiva mot andra nukleofiler som aminer och karboxylater i mer neutrala vattenlösningar. Tiden för derivatisering bör inte överstiga 2 h för att undvika eller minska reaktionen med protein tioler26. Man måste använda nonnucleophilic buffertar för att minska och bibehålla pH eftersom förekomsten av buffert anjoner vid höga koncentrationer kan störa MBBR derivatisering av COA.
Prov sanering på SPE-kolonnen görs manuellt i vårt laboratorium och kan utföras med hjälp av ett vakuum grenrör för att förkorta den tid som krävs för detta steg. God återhämtning av derivatized CoA från SPE kolumnen är rutinmässigt uppnåeliga och detta bestämdes separat med hjälp av radioaktiva [13C] COA thioesters som också finns kvar på spe kolumnen. Återhämtning av [13c] acetyl-CoA var 97,6% och återhämtning av [13c] palmitoyl-COA var 96,1%. Avdunstning av SPE-kolonn eluatet utförs vanligtvis under kväve gasen över natten i vårt laboratorium som en fråga om bekvämlighet, men torkning kan slutföras inom 4 timmar under kvävgas eller med hjälp av en speedvac koncentrator. De mest kritiska stegen i metoden är relaterade till pH-justering och kan kontrolleras med pH-papper remsor längs vägen. För KOH hydrolys, pH måste vara ≥ 12 för att uppnå fullständig frisättning av Thioester från CoA. PH-värdet måste vara 7,8 – 8,5 för att stödja Reaktiviteten hos mBBr-derivatisering, och efter derivatisering är klar, pH bör justeras för att bli mycket sura, om pH 1-2, för att CoA-bimane att binda till SPE kolumn. SPE-kolonnen rensar provet för att eliminera överskott av obesvarade mBBr och vissa icke-närstående biologiska substanser.
HPLC-programmet är utformat så att tvättning och återjämning av C18-kolonnen är tillräckligt för att eliminera bakgrunds-och överföring av signaler mellan proverna. Vatten tomma prover sätts in efter varje 5-prov i det experimentella provet som en försiktighetsåtgärd för att övervaka eventuell överföring mellan uppsättningarna och för att säkerställa kolonnens renhet. Ett tillfälligt fel från felaktig prov injektion kan inträffa när du använder en automatiserad prov injektor för HPLC, och detta kan enkelt kontrolleras genom att jämföra de återstående volymerna i provflaskorna efter injektion eller inspektion av de icke-CoA-relaterade topparna i utgående kromatogram. Om CoA-värdena överskrider kalibreringskurvans linjära omfång för fluorescensdetektion, kommer värdena sannolikt att vara inom räckhåll för detektion av ultraviolett absorbans. Om inte, kan spädning av provet med en känd volym vatten minska signalen till det linjära området och beräkningarna bör ta hänsyn till utspädningsfaktorn.
CoA nivåer kommer att variera bland inavlade mus stammar med olika genetiska bakgrunder, även om värdena är reproducerbara när biologiska prover erhålls från samma stam under samma förhållanden. Vi har uppskattat COA i flera olika mus linjer i olika studier10,12,16,17. COA mättes också i flera odlade cellinjer16,17 med antingen primära eller förevigade celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
MWF, CS och SJ skrev papperet, MWF och CS tillhandahöll data och siffror, ReK designade experimenten och granskade manuskriptet kritiskt. SJ och COR är uppfinnare på en pågående patentansökan (PCT/US17/39037) "små molekyl modulatorer av pantothenate kinases" innehas av St Jude Children ' s Research Hospital som täcker PZ-2891 förening som refereras till i denna artikel.
Acknowledgments
Författarna erkänner finansiering för sponsrad forskning som tillhandahålls av CoA Therapeutics, Inc., ett dotterbolag till BridgeBio LLC, National Institutes of Health Grant GM34496, och den amerikanska libanesiska syriska associerade välgörenhetsorganisationer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-(2-pyridyl)-ethyl silica gel SPE column | Millipore-Sigma | 54127-U | |
| coenzyme A | Avanti Polar Lipids | 870700 | |
| Gemini C18 3 μm 100 Å HPLC column | Phenomenex | 00F-4439-E0 | |
| monobromobimane | ThermoFisher Scientific | M-1378 | |
| Omni-Tip probe tissue disrupter | Omni International | 32750H | |
| Parafilm | Fisher | S37440 | |
| PowerGen 125 motorized rotor stator homogenizer | ThermoFisher Scientific | NC0530997 | |
| Spin-X centrifuge tube filter | CoStar | 8161 | |
| Trizma-HCl | Fisher | T395-1 | |
| Waters 2475 fluorescence detector | Waters | 2475 | |
| Waters 2489 UV-Vis detector | Waters | 2489 | |
| Waters e2695 separations module | Waters | e2695 |
References
- Abiko, Y. Metabolic Pathways. Greenburg, D. M. 7, Academic Press, Inc. Ch. 7 1-25 (1975).
- Leonardi, R., Zhang, Y. -M., Rock, C. O., Jackowski, S.
- Jackowski, S., Rock, C. O.
- Robishaw, J. D., Berkich, D. A., Neely, J. R. Rate-limiting step and control of coenzyme A synthesis in cardiac muscle. Journal of Biological Chemistry. 257, 10967-10972 (1982).
- Di Meo, I., Carecchio, M., Tiranti, V. Inborn errors of coenzyme A metabolism and neurodegeneration. Journal of Inherited Metabolic Disease. 42, 49-56 (2019).
- Zhou, B., et al. A novel pantothenate kinase gene (PANK2) is defective in Hallervorden-Spatz syndrome. Nature Genetics. 28, 345-349 (2001).
- Dusi, S., et al. Exome sequence reveals mutations in CoA synthase as a cause of neurodegeneration with brain iron accumulation. American Journal of Human Genetics. 94, 11-22 (2014).
- Dansie, L. E., et al.
- Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state. PLoS ONE. 5, 11107 (2015).
- Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance. Diabetologia. 57, 1466-1475 (2014).
- Israel, B. C., Smith, C. M. Effects of acute and chronic ethanol ingestion on pantothenate and CoA status of rats. The Journal of Nutrition. 117, 443-451 (1987).
- Garcia, M., Leonardi, R., Zhang, Y. M., Rehg, J. E., Jackowski, S. Germline deletion of pantothenate kinases 1 and 2 reveals the key roles for CoA in postnatal metabolism. PLoS One. 7, 40871 (2012).
- Corbin, D. R., et al. Excess coenzyme A reduces skeletal muscle performance and strength in mice overexpressing human PANK2. Molecular Genetics and Metabolism. 120, 350-362 (2017).
- Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver. Journal of Lipid Research. 60, 1005-1019 (2019).
- Shumar, S. A., et al. Induction of neuron-specific degradation of Coenzyme A models pantothenate kinase-associated neurodegeneration by reducing motor coordination in mice. PLoS ONE. 10, 0130013 (2015).
- Zano, S. P., Pate, C., Frank, M., Rock, C. O., Jackowski, S. Correction of a genetic deficiency in pantothenate kinase 1 using phosphopantothenate replacement therapy. Molecular Genetics and Metabolism. 16, 281-288 (2015).
- Sharma, L. K., et al. A therapeutic approach to pantothenate kinase associated neurodegeneration. Nature Communications. 9, 4399 (2018).
- Alvarez-Cordoba, M., et al. Pantothenate Rescues Iron Accumulation in Pantothenate Kinase-Associated Neurodegeneration Depending on the Type of Mutation. Molecular Neurobiology. 56, 3638-3656 (2019).
- Arber, C., et al. iPSC-derived neuronal models of PANK2-associated neurodegeneration reveal mitochondrial dysfunction contributing to early disease. PLoS One. 12, 0184104 (2017).
- Di Meo, I., et al. Acetyl-4'-phosphopantetheine is stable in serum and prevents phenotypes induced by pantothenate kinase deficiency. Scientific Reports. 7, 11260 (2017).
- Nishikawa, T., Edelstein, D., Brownlee, M. The missing link: a single unifying mechanism for diabetic complications. Kidney International Supplements. 77, 26-30 (2000).
- Tsuchiya, Y., Pham, U., Gout, I. Methods for measuring CoA and CoA derivatives in biological samples. Biochemical Society Transactions. 42, 1107-1111 (2014).
- Demoz, A., Netteland, B., Svardal, A., Mansoor, M. A., Berge, R. K. Separation and Detection of Tissue Coash and Long-Chain Acyl-Coa by Reversed-Phase High-Performance Liquid-Chromatography after Precolumn Derivatization with Monobromobimane. Journal of Chromatography. 635, 251-256 (1993).
- Shimada, K., Mitamura, K.
- Minkler, P. E., Kerner, J., Ingalls, S. T., Hoppel, C. L. Novel isolation procedure for short-, medium-, and long-chain acyl-coenzyme A esters from tissue. Analytical Biochemistry. 376, 275-276 (2008).
- Newton, G. L., Fahey, R. C. Determination of biothiols by bromobimane labeling and high-performance liquid chromatography. Methods in Enzymology. 251, 148-166 (1995).
- Radkowsky, A. E., Kosower, E. M. Bimanes .17. (Haloalkyl)-1,5-Diazabicyclo[3.3.0]Octadienediones (Halo-9,10-Dioxabimanes) - Reactivity toward the Tripeptide Thiol, Glutathione. Journal of the American Chemical Society. 108, 4527-4531 (1986).
- Zhang, Y. M., et al. Chemical knockout of pantothenate kinase reveals the metabolic and genetic program responsible for hepatic coenzyme A homeostasis. Chemistry & Biology. 14, 291-302 (2007).
- Tokutake, Y., Onizawa, N., Katoh, H. Toyoda A,Chohnan S. Coenzyme A and its thioester pools in fasted and fed rat tissues. Biochemical and Biophysical Research Communications. 402, 158-162 (2010).
- Shibata, K., Nakai, T., Fukuwatari, T. Simultaneous high-performance liquid chromatography determination of coenzyme A, dephospho-coenzyme A, and acetyl-coenzyme A in normal and pantothenic acid-deficient rats. Analytical Biochemistry. 430, 151-155 (2012).
- Chohnan, S., Takamura, Y. A simple micromethod for measurement of CoASH and its use in measuring the intracellular levles of CoASH and short chain acyl-CoAs in Escherichia coli K12 cells. Agricultural and Biological Chemistry. 55, 87-94 (1991).
