Kvantifiering av coenzym A i celler och vävnader
Summary
Denna metod beskriver provberedning från odlade celler och djurvävnader, extraktion och derivatisering av coenzym A i proverna, följt av vätskekromatografi med högt tryck för rening och kvantifiering av det derivatiserade coenzym A genom absorbans eller fluorescensdetektion.
Abstract
Framväxande forskning har visat att den cellulära coenzym A (CoA) utbudet kan bli begränsande med en skadlig inverkan på tillväxt, metabolism och överlevnad. Mätning av cellulära CoA är en utmaning på grund av dess relativt låga överflöd och den dynamiska omvandlingen av fri CoA till CoA thioesters att i sin tur delta i många metabola reaktioner. En metod beskrivs som navigerar genom potentiella fallgropar under provberedning för att ge en analys med ett brett linjärt detektionsområde som lämpar sig för användning i många biomedicinska laboratorier.
Introduction
Coenzym A (CoA) är en viktig kofaktor i alla levande organismer och syntetiseras från pantotensyra, även kallad pantothenate (salt av pantotensyra) eller vitamin B5. CoA är den största intracellulära bärare av organiska syror, inklusive korta kedjor syror såsom acetat och succinat, gren-Chain syror såsom propionat och metylmalonat, långkedjiga fettsyror såsom palmitat och oleat, mycket långkedjiga fettsyror som fleromättade fettsyror, och xenobiotika såsom valproinsyra. Den organiska syran bildar en Thioester sammanlänkning enzymatiskt med COA för att möjliggöra dess bruk som ett substrat i över 100 reaktioner i intermediär ämnesomsättning1. COA thioesters är också Alloster regulatorer och transkriptionella aktivatorer. Det är nu uppskattat2 att den cellulära totala COA utbudet regleras3,4; Således, CoA tillgänglighet kan vara begränsande, och att CoA brister kan vara katastrofala, som exemplifieras av ärftliga genetiska sjukdomar som påverkar CoA biosyntes5. Pantothenate Kinas katalyserar det första steget i COA biosyntes (figur 1) och pantothenate Kinas associerade neurodegeneration, kallas pkan, orsakas av mutationer i PANK2 genen6. CoA syntas, kodade av coasyn genen, katalyserar de två sista stegen i COA biosyntes (figur 1) och Coasy protein-associerad neurodegeneration, kallas Copan, orsakas av en mutation i coasyn genen7. Både pkan och Copan ärvs neurodegenerativa sjukdomar förknippade med järnansamling i hjärnan och COA brister un sjukdomens patologier.
Cellulära nivåer av totala CoA varierar mellan vävnader8 och totala COA kan öka eller minska under en mängd olika fysiologiska, patologiska och farmakologiska tillstånd. Lever CoA ökar under bränsle växling från Fed till fastande tillstånd9, och lever COA nivåer är onormalt hög hos leptin-bristfällig feta möss10. Lever CoA minskar som svar på kronisk etanol intag11. Hjärnan CoA nivåer i Pank2 knockout musmodellen är deprimerad under den perinatal perioden, men senare i vuxen stadiet hjärnan COA innehåll motsvarar Wild-typ nivåer, vilket indikerar en adaptiv COA svar under utveckling12. Manipulation av vävnad COA innehåll genom transgenes eller gen leveransmetoder påverkar metabola och neurala funktioner13,14,15. Preklinisk utveckling av potentiella terapier för pkan eller Copan inkluderar cell-eller vävnads COA-mätningar som indikatorer på effekt16,17,18,19,20 . Utvärdering av alla dessa villkor och deras metabola eller funktionella konsekvenser kräver en kvantitativ metod för mätning av total CoA.
En noggrann, tillförlitlig analys för att mäta CoA i biologiska prover är en teknisk utmaning i många laboratorier. Tyvärr, det finns inga sonder tillgängliga för att utvärdera eller kvantifiera CoA eller CoA thioesters i intakt celler, även om analoger av naturliga CoA thioesters har använts i stor utsträckning som mekanistiska sonder i studier av CoA Ester utnyttja enzymer21. Omvandlingen av CoA, med en fri sulfhydryl (-SH) del, till en CoA Thioester (eller vice versa) är snabb i celler eller djurvävnader under överföring till en annan miljö och under cell lysis. Många Acyl-CoA-syntetar och Acyl-CoA-tioesteraser i celler förmedlar interkonverteringarna inom CoA-poolen, och ytterligare enzymer som utnyttjar CoA-tioestrar som substrat förblir aktiva i biologiska prover tills de släckts av kemisk eller fysikalisk Innebär. Den off-loading av Acyl-grupper från CoA till karnitin av Acyl-transferases är ett exempel inom nätverket av reaktioner som kan förändra CoA/CoA Thioester distribution. Radioaktiva spårämnen kan användas för att mäta frekvenser av COA-syntes i celler. Nuvarande metoder för mätning av CoA-och CoA-derivat i biologiska prover har setts över22 och omfattar sammansatta enzymatiska spektrofotometriska analyser, högtrycks vätskekromatografi och masspektrometribaserade procedurer. Emellertid, dessa metoder är ofta inriktade på särskilda CoA molekylära arter och är blinda för variation av den totala CoA pool. De kopplade enzymatiska analyserna kräver i allmänhet större mängder inmatnings material på grund av låg detektionskänslighet och har ett begränsat utbud av linearitet.
Vårt laboratorium har utvecklat ett tillförlitligt förfarande för kvantifiering av total CoA i odlade celler och djurvävnader. Strategin omfattar hydrolys av alla CoA thioesters att ge endast gratis CoA under provberedning, snarare än att göra ansträngningar för att underhålla och analysera hela spektrumet av CoA arter. Förfarandet är en sammanställning av enskilda publicerade metoder för provberedning, CoA-derivatisering, rening och identifiering efter högtrycks vätskekromatografi (HPLC), och kvantifiering av det derivatiserade äkthetsbeviset genom absorbans eller fluorescensdetektion23,24,25. CoA bestämningar erhålls med hjälp av detta förfarande har möjliggjort vår förståelse av CoA reglering och utveckling av en terapeutisk metod för behandling av CoA brister.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här visar vi ett tillförlitligt steg-för-steg-förfarande för att kvantifiera total CoA i celler och djurvävnader med ett brett spektrum av linjär detektion som är tillgänglig i många laboratorier som har en HPLC med antingen en absorbans eller fluorescens utgång detektor. Alternativt, masspektrometri är en vanlig teknik för att utvärdera CoA och CoA thioesters, men är inte allmänt tillgänglig på grund av kostnaden för instrumenteringen och de specialiserade kunskaper som krävs för utveckling av metod…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner finansiering för sponsrad forskning som tillhandahålls av CoA Therapeutics, Inc., ett dotterbolag till BridgeBio LLC, National Institutes of Health Grant GM34496, och den amerikanska libanesiska syriska associerade välgörenhetsorganisationer.
Materials
| 2-(2-pyridyl)-ethyl silica gel SPE column | Millipore-Sigma | 54127-U | |
| coenzyme A | Avanti Polar Lipids | 870700 | |
| Gemini C18 3 μm 100 Å HPLC column | Phenomenex | 00F-4439-E0 | |
| monobromobimane | ThermoFisher Scientific | M-1378 | |
| Omni-Tip probe tissue disrupter | Omni International | 32750H | |
| Parafilm | Fisher | S37440 | |
| PowerGen 125 motorized rotor stator homogenizer | ThermoFisher Scientific | NC0530997 | |
| Spin-X centrifuge tube filter | CoStar | 8161 | |
| Trizma-HCl | Fisher | T395-1 | |
| Waters 2475 fluorescence detector | Waters | 2475 | |
| Waters 2489 UV-Vis detector | Waters | 2489 | |
| Waters e2695 separations module | Waters | e2695 |
References
- Abiko, Y., Greenburg, D. M. . Metabolic Pathways. 7, 1-25 (1975).
- Leonardi, R., Zhang, Y. -. M., Rock, C. O., Jackowski, S. Coenzyme A: Back in action. Progress in Lipid Research. 44, 125-153 (2005).
- Jackowski, S., Rock, C. O. Regulation of coenzyme A biosynthesis. Journal of Bacteriology. 148, 926-932 (1981).
- Robishaw, J. D., Berkich, D. A., Neely, J. R. Rate-limiting step and control of coenzyme A synthesis in cardiac muscle. Journal of Biological Chemistry. 257, 10967-10972 (1982).
- Di Meo, I., Carecchio, M., Tiranti, V. Inborn errors of coenzyme A metabolism and neurodegeneration. Journal of Inherited Metabolic Disease. 42, 49-56 (2019).
- Zhou, B., et al. A novel pantothenate kinase gene (PANK2) is defective in Hallervorden-Spatz syndrome. Nature Genetics. 28, 345-349 (2001).
- Dusi, S., et al. Exome sequence reveals mutations in CoA synthase as a cause of neurodegeneration with brain iron accumulation. American Journal of Human Genetics. 94, 11-22 (2014).
- Dansie, L. E., et al. Physiological roles of the pantothenate kinases. Biochemical Society Transactions. 42, 1033-1036 (2014).
- Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state. PLoS ONE. 5, 11107 (2015).
- Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance. Diabetologia. 57, 1466-1475 (2014).
- Israel, B. C., Smith, C. M. Effects of acute and chronic ethanol ingestion on pantothenate and CoA status of rats. The Journal of Nutrition. 117, 443-451 (1987).
- Garcia, M., Leonardi, R., Zhang, Y. M., Rehg, J. E., Jackowski, S. Germline deletion of pantothenate kinases 1 and 2 reveals the key roles for CoA in postnatal metabolism. PLoS One. 7, 40871 (2012).
- Corbin, D. R., et al. Excess coenzyme A reduces skeletal muscle performance and strength in mice overexpressing human PANK2. Molecular Genetics and Metabolism. 120, 350-362 (2017).
- Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver. Journal of Lipid Research. 60, 1005-1019 (2019).
- Shumar, S. A., et al. Induction of neuron-specific degradation of Coenzyme A models pantothenate kinase-associated neurodegeneration by reducing motor coordination in mice. PLoS ONE. 10, 0130013 (2015).
- Zano, S. P., Pate, C., Frank, M., Rock, C. O., Jackowski, S. Correction of a genetic deficiency in pantothenate kinase 1 using phosphopantothenate replacement therapy. Molecular Genetics and Metabolism. 16, 281-288 (2015).
- Sharma, L. K., et al. A therapeutic approach to pantothenate kinase associated neurodegeneration. Nature Communications. 9, 4399 (2018).
- Alvarez-Cordoba, M., et al. Pantothenate Rescues Iron Accumulation in Pantothenate Kinase-Associated Neurodegeneration Depending on the Type of Mutation. Molecular Neurobiology. 56, 3638-3656 (2019).
- Arber, C., et al. iPSC-derived neuronal models of PANK2-associated neurodegeneration reveal mitochondrial dysfunction contributing to early disease. PLoS One. 12, 0184104 (2017).
- Di Meo, I., et al. Acetyl-4′-phosphopantetheine is stable in serum and prevents phenotypes induced by pantothenate kinase deficiency. Scientific Reports. 7, 11260 (2017).
- Nishikawa, T., Edelstein, D., Brownlee, M. The missing link: a single unifying mechanism for diabetic complications. Kidney International Supplements. 77, 26-30 (2000).
- Tsuchiya, Y., Pham, U., Gout, I. Methods for measuring CoA and CoA derivatives in biological samples. Biochemical Society Transactions. 42, 1107-1111 (2014).
- Demoz, A., Netteland, B., Svardal, A., Mansoor, M. A., Berge, R. K. Separation and Detection of Tissue Coash and Long-Chain Acyl-Coa by Reversed-Phase High-Performance Liquid-Chromatography after Precolumn Derivatization with Monobromobimane. Journal of Chromatography. 635, 251-256 (1993).
- Shimada, K., Mitamura, K. Derivatization of Thiol-Containing Compounds. Journal of Chromatography B. 659, 227-241 (1994).
- Minkler, P. E., Kerner, J., Ingalls, S. T., Hoppel, C. L. Novel isolation procedure for short-, medium-, and long-chain acyl-coenzyme A esters from tissue. Analytical Biochemistry. 376, 275-276 (2008).
- Newton, G. L., Fahey, R. C. Determination of biothiols by bromobimane labeling and high-performance liquid chromatography. Methods in Enzymology. 251, 148-166 (1995).
- Radkowsky, A. E., Kosower, E. M. Bimanes .17. (Haloalkyl)-1,5-Diazabicyclo[3.3.0]Octadienediones (Halo-9,10-Dioxabimanes) – Reactivity toward the Tripeptide Thiol, Glutathione. Journal of the American Chemical Society. 108, 4527-4531 (1986).
- Zhang, Y. M., et al. Chemical knockout of pantothenate kinase reveals the metabolic and genetic program responsible for hepatic coenzyme A homeostasis. Chemistry & Biology. 14, 291-302 (2007).
- Tokutake, Y., Onizawa, N., Katoh, H. Toyoda A,Chohnan S. Coenzyme A and its thioester pools in fasted and fed rat tissues. Biochemical and Biophysical Research Communications. 402, 158-162 (2010).
- Shibata, K., Nakai, T., Fukuwatari, T. Simultaneous high-performance liquid chromatography determination of coenzyme A, dephospho-coenzyme A, and acetyl-coenzyme A in normal and pantothenic acid-deficient rats. Analytical Biochemistry. 430, 151-155 (2012).
- Chohnan, S., Takamura, Y. A simple micromethod for measurement of CoASH and its use in measuring the intracellular levles of CoASH and short chain acyl-CoAs in Escherichia coli K12 cells. Agricultural and Biological Chemistry. 55, 87-94 (1991).
