Denne metoden beskriver prøven forberedelse fra kultivert celler og animalsk vev, ekstraksjon og derivatization av koenzym A i prøvene, etterfulgt av høytrykks væske kromatografi for rensing og kvantifisering av derivatized koenzym A ved absorbansen eller fluorescens deteksjon.
Emerging forskning har avdekket at mobilnettet koenzym A (CoA) forsyning kan bli begrensende med en ødeleggende innvirkning på vekst, metabolisme og overlevelse. Måler av Cellular CoA er en angripe på grunn av dens relativt lav overflod og det drivkraft omdanne av ledig CoA å CoA thioesters det, etter tur, delta inne tallrik metabolic reaksjonene. En metode er beskrevet som navigerer gjennom potensielle fallgruver under prøven forberedelse til å gi en analyse med et bredt lineær utvalg av deteksjon som er egnet for bruk i mange biomedisinsk laboratorier.
Koenzym A (CoA) er en essensiell kofaktor i alle levende organismer og er syntetisert fra Pantotensyre syre, også kalt pantothenate (salt av Pantotensyre syre) eller vitamin B5. CoA er den store intracellulære bærer av organiske syrer, inkludert kort-kjeden syrer som acetate og succinate, gren-kjeden syrer som propionate og methylmalonate, lang-kjeden fettsyrer som askorbylpalmitat og oleat, veldig lang kjede fettsyrer som flerumettede fettsyrer, og xenobiotics som Valproic syre. Den organiske syre danner en thioester sammenheng enzymatisk med CoA å muliggjøre bruken som et substrat i over 100 reaksjoner i mellomledd metabolisme1. CoA thioesters er også nukleosid regulatorer og transcriptional aktivator. Det er nå verdsatt2 at mobilnettet totale COA Supply er regulert3,4; Derfor kan CoA-tilgjengelighet begrenses, og at CoA-mangler kan være katastrofale, som et eksempel på arvet genetiske lidelser som påvirker CoA-biosyntesen5. Pantothenate kinase katalyserer det første trinnet i CoA-biosyntesen (figur 1) og pantothenate kinase Associated neurodegeneration, kalt PKAN, er forårsaket av mutasjoner i PANK2 Gene6. CoA-syntase, som er kodet av COASYN -genet, katalyserer de to siste trinnene i COA-biosyntesen (figur 1) og COASY-assosiert neurodegeneration, kalt CoPAN, forårsakes av en mutasjon i COASYN -genet7. Både PKAN og CoPAN er arvet nevrodegenerative sykdommer forbundet med jern akkumulering i hjernen og CoA mangler underliggende sykdommen patologi.
Cellulære nivåer av total CoA varierer mellom vev8 og total COA kan øke eller redusere under en rekke fysiologiske, patologiske og farmakologiske tilstander. Leveren CoA øker under drivstoff skifter fra matet til fastende stat9, og leveren COA nivåer er unormalt høy i leptin-mangelfull overvektige mus10. Liver CoA avtar som følge av kronisk etanol inntak11. Brain CoA nivåer i Pank2 knockout muse modellen er deprimert i løpet av Perinatal perioden, men senere i den voksne scenen hjernen COA innhold tilsvarer Wild-type nivåer, noe som indikerer en adaptiv COA respons under utbygging12. Manipulering av vev COA innhold ved transgenesis eller gen leveringsmetoder virkninger metabolske og nevrale funksjoner13,14,15. Prekliniske utvikling av potensielle terapi for PKAN eller CoPAN inkluderer celle eller vev COA målinger som indikatorer for effekt16,17,18,19,20 . Evaluering av alle disse forholdene og deres metabolske eller funksjonelle konsekvenser krever en kvantitativ metode for måling av total CoA.
En nøyaktig, pålitelig analysen for måling av CoA i biologiske prøver er en teknisk utfordring i mange laboratorier. Beklageligvis, der er nei sonder anvendelig å vurdere eller kvantifisere CoA eller CoA thioesters inne Behold celler, til tross for analogs av naturlig CoA thioesters ha blitt vidt anvendt idet mekanistisk sonder inne studier av CoA Ester bruker enzym21. Konverteringen av CoA, med en gratis sulfhydrylgruppen (-SH) moiety, til en CoA thioester (eller vice versa) er rask i celler eller animalsk vev under overføring til et annet miljø og under cellelyse. Tallrike acyl-CoA-synthetases og acyl-CoA-thioesterases i cellene megle i interconversions i ekthetsgarantien, og ytterligere enzymer som utnytter CoA-thioesters som underlag, forblir aktive i biologiske prøver til slukket av kjemiske eller fysiske Betyr. Off-lasting av acyl-grupper fra CoA til carnitine av acyl-transferases er ett eksempel innenfor nettverket av reaksjoner som kan endre CoA/CoA thioester fordelingen. Radioaktive Bevegelsesuskarphet kan brukes til å måle frekvensen av CoA syntese i celler. Gjeldende metoder for måling av CoA-og CoA-derivater i biologiske prøver har gjennomgått22 og inkluderer sammenkoblede enzymatisk Spektrofotometriske analyser, høytrykks væske kromatografi og masse massespektrometri prosedyrer. Men disse metodene er ofte fokusert på bestemte CoA molekyl arter og er blinde for variasjon av det totale CoA bassenget. De sammenkoblede enzymatisk analysene krever vanligvis større mengder inngangs materiale på grunn av lav deteksjons følsomhet og har et begrenset utvalg av linearitet.
Vårt laboratorium har utviklet en pålitelig prosedyre for kvantifisering av total CoA i kulturperler celler og animalsk vev. Strategien omfatter hydrolyse av alle CoA-thioesters for å gi bare gratis CoA under prøve forberedelser, i stedet for å gjøre arbeidet med å vedlikeholde og analysere hele spekteret av CoA-arter. Fremgangsmåten er en samling av individuelle, publiserte metoder for prøveklargjøring, CoA-derivatization, rensing og identifisering etter høytrykks kromatografi (HPLC), og kvantifisering av derivatized CoA ved absorbansen eller fluorescens Detection23,24,25. The CoA bestemmelser innhentet ved hjelp av denne prosedyren har aktivert vår forståelse av CoA regulering og utvikling av en terapeutisk tilnærming for behandling av CoA mangler.
Her viser vi en pålitelig, trinnvis fremgangsmåte for kvantifisere totale CoA i celler og animalsk vev med et bredt spekter av lineær deteksjon som er tilgjengelig i mange laboratorier som har en HPLC med enten en absorbansen eller fluorescens output detektor. Alternativt, masse massespektrometri er en vanlig teknikk for å evaluere CoA og CoA thioesters, men er ikke allment tilgjengelig på grunn av kostnaden av instrumentering og den spesialiserte kunnskapen som kreves for utvikling av metodikk og tolkning av data. …
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne erkjenner finansiering for sponset forskning levert av CoA legemiddel selskap, Inc., et datterselskap av BridgeBio LLC, National Institutes of Health Grant GM34496, og den amerikanske libanesiske syriske Associated velferdsorganisasjoner.
2-(2-pyridyl)-ethyl silica gel SPE column | Millipore-Sigma | 54127-U | |
coenzyme A | Avanti Polar Lipids | 870700 | |
Gemini C18 3 μm 100 Å HPLC column | Phenomenex | 00F-4439-E0 | |
monobromobimane | ThermoFisher Scientific | M-1378 | |
Omni-Tip probe tissue disrupter | Omni International | 32750H | |
Parafilm | Fisher | S37440 | |
PowerGen 125 motorized rotor stator homogenizer | ThermoFisher Scientific | NC0530997 | |
Spin-X centrifuge tube filter | CoStar | 8161 | |
Trizma-HCl | Fisher | T395-1 | |
Waters 2475 fluorescence detector | Waters | 2475 | |
Waters 2489 UV-Vis detector | Waters | 2489 | |
Waters e2695 separations module | Waters | e2695 |