Summary
Denne metoden beskriver prøven forberedelse fra kultivert celler og animalsk vev, ekstraksjon og derivatization av koenzym A i prøvene, etterfulgt av høytrykks væske kromatografi for rensing og kvantifisering av derivatized koenzym A ved absorbansen eller fluorescens deteksjon.
Abstract
Emerging forskning har avdekket at mobilnettet koenzym A (CoA) forsyning kan bli begrensende med en ødeleggende innvirkning på vekst, metabolisme og overlevelse. Måler av Cellular CoA er en angripe på grunn av dens relativt lav overflod og det drivkraft omdanne av ledig CoA å CoA thioesters det, etter tur, delta inne tallrik metabolic reaksjonene. En metode er beskrevet som navigerer gjennom potensielle fallgruver under prøven forberedelse til å gi en analyse med et bredt lineær utvalg av deteksjon som er egnet for bruk i mange biomedisinsk laboratorier.
Introduction
Koenzym A (CoA) er en essensiell kofaktor i alle levende organismer og er syntetisert fra Pantotensyre syre, også kalt pantothenate (salt av Pantotensyre syre) eller vitamin B5. CoA er den store intracellulære bærer av organiske syrer, inkludert kort-kjeden syrer som acetate og succinate, gren-kjeden syrer som propionate og methylmalonate, lang-kjeden fettsyrer som askorbylpalmitat og oleat, veldig lang kjede fettsyrer som flerumettede fettsyrer, og xenobiotics som Valproic syre. Den organiske syre danner en thioester sammenheng enzymatisk med CoA å muliggjøre bruken som et substrat i over 100 reaksjoner i mellomledd metabolisme1. CoA thioesters er også nukleosid regulatorer og transcriptional aktivator. Det er nå verdsatt2 at mobilnettet totale COA Supply er regulert3,4; Derfor kan CoA-tilgjengelighet begrenses, og at CoA-mangler kan være katastrofale, som et eksempel på arvet genetiske lidelser som påvirker CoA-biosyntesen5. Pantothenate kinase katalyserer det første trinnet i CoA-biosyntesen (figur 1) og pantothenate kinase Associated neurodegeneration, kalt PKAN, er forårsaket av mutasjoner i PANK2 Gene6. CoA-syntase, som er kodet av COASYN -genet, katalyserer de to siste trinnene i COA-biosyntesen (figur 1) og COASY-assosiert neurodegeneration, kalt CoPAN, forårsakes av en mutasjon i COASYN -genet7. Både PKAN og CoPAN er arvet nevrodegenerative sykdommer forbundet med jern akkumulering i hjernen og CoA mangler underliggende sykdommen patologi.
Cellulære nivåer av total CoA varierer mellom vev8 og total COA kan øke eller redusere under en rekke fysiologiske, patologiske og farmakologiske tilstander. Leveren CoA øker under drivstoff skifter fra matet til fastende stat9, og leveren COA nivåer er unormalt høy i leptin-mangelfull overvektige mus10. Liver CoA avtar som følge av kronisk etanol inntak11. Brain CoA nivåer i Pank2 knockout muse modellen er deprimert i løpet av Perinatal perioden, men senere i den voksne scenen hjernen COA innhold tilsvarer Wild-type nivåer, noe som indikerer en adaptiv COA respons under utbygging12. Manipulering av vev COA innhold ved transgenesis eller gen leveringsmetoder virkninger metabolske og nevrale funksjoner13,14,15. Prekliniske utvikling av potensielle terapi for PKAN eller CoPAN inkluderer celle eller vev COA målinger som indikatorer for effekt16,17,18,19,20 . Evaluering av alle disse forholdene og deres metabolske eller funksjonelle konsekvenser krever en kvantitativ metode for måling av total CoA.
En nøyaktig, pålitelig analysen for måling av CoA i biologiske prøver er en teknisk utfordring i mange laboratorier. Beklageligvis, der er nei sonder anvendelig å vurdere eller kvantifisere CoA eller CoA thioesters inne Behold celler, til tross for analogs av naturlig CoA thioesters ha blitt vidt anvendt idet mekanistisk sonder inne studier av CoA Ester bruker enzym21. Konverteringen av CoA, med en gratis sulfhydrylgruppen (-SH) moiety, til en CoA thioester (eller vice versa) er rask i celler eller animalsk vev under overføring til et annet miljø og under cellelyse. Tallrike acyl-CoA-synthetases og acyl-CoA-thioesterases i cellene megle i interconversions i ekthetsgarantien, og ytterligere enzymer som utnytter CoA-thioesters som underlag, forblir aktive i biologiske prøver til slukket av kjemiske eller fysiske Betyr. Off-lasting av acyl-grupper fra CoA til carnitine av acyl-transferases er ett eksempel innenfor nettverket av reaksjoner som kan endre CoA/CoA thioester fordelingen. Radioaktive Bevegelsesuskarphet kan brukes til å måle frekvensen av CoA syntese i celler. Gjeldende metoder for måling av CoA-og CoA-derivater i biologiske prøver har gjennomgått22 og inkluderer sammenkoblede enzymatisk Spektrofotometriske analyser, høytrykks væske kromatografi og masse massespektrometri prosedyrer. Men disse metodene er ofte fokusert på bestemte CoA molekyl arter og er blinde for variasjon av det totale CoA bassenget. De sammenkoblede enzymatisk analysene krever vanligvis større mengder inngangs materiale på grunn av lav deteksjons følsomhet og har et begrenset utvalg av linearitet.
Vårt laboratorium har utviklet en pålitelig prosedyre for kvantifisering av total CoA i kulturperler celler og animalsk vev. Strategien omfatter hydrolyse av alle CoA-thioesters for å gi bare gratis CoA under prøve forberedelser, i stedet for å gjøre arbeidet med å vedlikeholde og analysere hele spekteret av CoA-arter. Fremgangsmåten er en samling av individuelle, publiserte metoder for prøveklargjøring, CoA-derivatization, rensing og identifisering etter høytrykks kromatografi (HPLC), og kvantifisering av derivatized CoA ved absorbansen eller fluorescens Detection23,24,25. The CoA bestemmelser innhentet ved hjelp av denne prosedyren har aktivert vår forståelse av CoA regulering og utvikling av en terapeutisk tilnærming for behandling av CoA mangler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyret prosedyren referert til i denne protokollen ble utført i henhold til protokoller 323 og 556 og spesielt godkjent av St. Jude Children ' s Research Hospital institusjonelle Animal Care og use Committee.
1. utarbeidelse av løsninger
Merk: Bruk ultrarent vann for alle løsninger og når det fremgår av prosedyrene.
- Forbered 1 mM kalium (KOH) i vann.
- Forbered 0,25 M KOH i vann.
- Forbered 1 M Trizma-HCl i vann og Juster til pH 8,0.
- Forbered 100 mM monobromobimane (mBBr) i acetonitril (Optima grade). Stock-løsninger av mBBr er stabile ved-20 ° c i mange måneder forutsatt at de holdes i mørket som eksponering for lys kan photolyze monobromobimane til bimane26.
- Forbered vask buffer for solid fase ekstraksjon (SPE) kolonne: 50% metanol (Optima grade) + 2% eddiksyre.
- Forbered eluering buffer for SPE kolonne: 95% etanol (HPLC grade) inneholder 50 mM ammonium formiat.
2. klargjøring av CoA-bimane standard
- Kjøp en CoA-standard av høy kvalitet fra en pålitelig kilde (f.eks. Avanti Polar lipider, Inc.).
- Forbered en høy konsentrasjon lagerløsning av CoA i 20 mM Tris, pH 8. Mengden av CoA i høy konsentrasjon aksjen bestemmes eller bekreftes av Spektrofotometriske absorbansen på λ 260 NM (ɛ = 16 800 M-1∙ cm-1). Legg til 4-fold molar overskudd av mBBr; Vortex på høy i 10 s. For eksempel, for 10 mM CoA i buffer, tilsett 40 mM mBBr. MBBr legges i overkant for å sikre at alle ekthetsgarantien er derivatized.
- Ruge ved romtemperatur i 4 timer i mørket uten risting for å derivatize ekthetsgarantien med mBBr. mBBr reagerer med tiolderivat gruppen av ekthetsgarantien, og det er pH og temperatur avhengig27. Tilsetting av mBBr konverterer ekthetsgarantien til et vannløselig fluorescerende (eller ultrafiolett absorberende) CoA-bimane (CoA-bimane; Figur 2).
- Tilsett 100 μL eddiksyre og Vortex på høy i 10 s for å stoppe reaksjonen.
- Sentrifuger på 2 000 x g i 15 minutter for å fjerne eventuelle overilet.
- Rydd opp i supernatanten ved hjelp av en SPE-kolonne for å fjerne ureagerte mBBr (beskrevet nedenfor). Filtrering og sentrifugering av eluatet er ikke nødvendig etter at SPE-kolonnen er rengjort (seksjon 5,8).
- Samle eluatet fra SPE-kolonnen som inneholder CoA-bimane i en pre-veid slange, tørr under nitrogen gass, veie og konstruere en standard kalibrerings kurve med kjente mengder CoA-bimane.
- Sjekk CoA-bimane standard for renhet av HPLC (se nedenfor) med absorbansen deteksjon på både λ 260 (adenine moiety) og λ 393 (bimane moiety) og tilfeldighet av begge toppene i kromatogram.
- Bekreft antallet CoA-bimane-standarden i det høye konsentrasjons lageret ved hjelp av λ 260 NM (ɛ = 16 800 M-1∙ cm-1).
- Registrer HPLC oppbevaringstid for identifisering av CoA-bimane i eksperimentelle prøver ved hjelp av CoA-bimane-standarden.
- Oppbevar alikvoter av det høye konsentrasjons lageret på CoA-bimane standard beskyttet mot lys og oppbevares ved-20 ° c i opptil 2 år. Unngå gjentatt tine og re-frysing.
3. ekstraksjon og derivatization av CoA i kulturperler celler
- Harvest tilhenger celler i kultur når nærmer seg sent subconfluent tettheten. For eksempel er menneskelige HepG2/C3A celler vokst til en tetthet på 6-8 x 106, eller HEK 293T celler dyrkes til en tetthet på ~ 1,3 x 107 per 100 mm parabolen.
- Bruk dupliserte eller tre eksemplarer kulturer rutinemessig for CoA bestemmelser. Ruge separate kultur retter parallelt med eksempel cellekulturer for å bestemme levedyktig celle nummer. Beregn mengden av CoA per 106-107 celler etter HPLC rensing.
- Aspirer kultur medium av fatet. Vask raskt celler på fatet med iskald fosfat-bufret saltvann (PBS) for å fjerne eventuelle gjenværende medium og aspirer PBS av fatet. Raskt vaske celler med iskaldt vann for å fjerne resterende PBS og aspirer vannet av parabolen raskt. Unngå å forstyrre de tilhenger cellene når du legger til PBS eller vann.
- Tilsett 1 mL iskaldt vann til kultur fatet. Skrap celler i det kalde vannet i fatet og Overfør celle fjæringen til et glass reagensrør som inneholder 400 μL av 0,25 M KOH og 1,5 mL vann.
- Bland suspensjonen kraftig ved Vortex på høy i 10 s. Dekk deretter tett med para fin film og ruge ved 55 ° c i 1 time uten å riste i et vannbad. PH-verdien i prøven bør være ≥ 12. Høy pH er viktig å hydrolyserer ekthetsgarantien thioesters og kan justeres med ytterligere alikvoter av KOH om nødvendig.
- Harvest kultur celler vokser i suspensjon av sentrifugering ved lav hastighet: 136 x g i 6 min ved 4 ° c. Vask en gang med iskald PBS, deretter kort vask igjen med kaldt vann, og til slutt resuspend i 2,5 mL med kaldt vann pluss 400 μL 0,25 M KOH. Bland kraftig og ruge ved 55 ° c som beskrevet ovenfor.
- Tilsett 160 μL av 1 M Trizma-HCl og 10 μL av 100 mM mBBr og bland med Vortex på høy i 10 s. Dette bringer pH til ca 8 for å støtte mBBr reaksjonen med gratis CoA. Dekk-og ruge prøver ved romtemperatur i 2 timer i mørket for at mBBr skal reagere med tiolderivat på ekthetsgarantien.
- Tilsett 100 μL av eddiksyre og bland med Vortex på høy i 10 s for å stoppe reaksjonen
- Sentrifuger på 2 000 x g i 15 min for å fjerne igangsatte celle rusk.
- Fjerne og bevare supernatanten inne en barometer test rør for det SPE søylen feilfri-opp det er beskrevet neden.
4. ekstraksjon og derivatization av CoA i vev
- Analysere dyr tissue stykker, om 0,5 cm diameter eller mindre, og blot kort (1-2 s) opp på absorberende papir og så glimtet fryse inne flytende nitrogen og lager for-80 ° c til bearbeiding. CoA i vev er hydrolysert eller konvertert til en thioester hvis ikke blinke frosset. Dette trinnet er viktig å oppnå maksimal utbytte av CoA i vev.
- Veie frosne vevs brikker (5 – 60 mg) raskt før analysen startes, og registrerer vekten for hver prøve. Dette våt vekt bestemmelse brukes til beregning av CoA innholdet etter HPLC rensing. Unngå fullstendig tine av vevet stykker.
- Tilsett 2 mL 1 mM KOH til et glass reagensrør (f.eks. 13 mm x 100 mm disponibel) for innsetting av en sonde og vevs forstyrrelser med en rotor-stator homogenisator. Hold røret på isen til bruk. Dette gjøres for å sikre at prøvene er homogenisert ved en kald temperatur og CoA er ikke ødelagt på grunn av varmen som genereres under homogenisering.
- Overføring og homogenisere vev (30 – 40 mg) i glass reagens røret (som inneholder kaldt 1 mM KOH) i 30 s. unngå fullstendig tine av vevet.
- Tilsett 500 μL av 0,25 M KOH; Vortex på høy for 10 s og holde på isen til alle prøvene er homogenisert. Dette vil bringe pH i prøven over 12 for å hydrolyserer ekthetsgarantien thioesters å gi total CoA (gratis CoA + hydrolysert CoA thioesters).
- Ruge prøver ved 55 ° c for 2 timer i et vannbad uten risting for å støtte hydrolyse.
- Tilsett 150 μL av 1 M Trizma-HCl og 10 μL av 100 mM mBBr; Vortex på høyt i 10 sekunder. Dette bringer pH til ca 8 for å støtte mBBr reaksjonen med gratis CoA.
- Ruge prøver ved romtemperatur i 2 timer i mørket for å sikre at alle ekthetsgarantien derivatized med mBBr.
- Tilsett 100 μL av eddiksyre og Vortex på høy i 10 s for å stoppe reaksjonen.
- Sentrifuger ved 2 000 x g i 15 min til pellets igangsatte celle rusk.
- Fjern og lagre supernatanten i et glass reagensrør for SPE-kolonnen (beskrevet nedenfor).
5. prøve opprydding med solid fase ekstraksjon (SPE) kolonne
- Ved romtemperatur, likevekt hver disponibel 2-(2-pyridyl)-etanol silica gel kolonne (1 mL størrelse) med 1 mL vaske buffer for å sikre at pyridyl funksjonelle gruppen er protonerte og vil fungere som en anion-veksler. 2-(2-pyridyl)-etanol silica gel er en svak anion veksler som er ideell for CoA-bimane ved en enkel pH. 2-(2-pyridyl)-med silica gel har en pKa på 6 og eluering er gjort pH ≥ 7.
- Legg sample supernatanten (trinn 4,11) til kolonne og samle eluatet.
- Vask kolonne to ganger med 1 mL vaske buffer for å fjerne eventuelle mangler arter.
- Vask kolonnen én gang med 1 mL vann.
- Vask Kol onnen to ganger med 1 mL eluering buffer i et separat glass test rør (12 mm x 75 mm) for å samle inn CoA-bimane.
- Dry CoA-bimane prøve i rør under nitrogen gass til tørrhet. Den tørkede prøven er stabil ved romtemperatur inntil videre bruk. Seal og fullstendig dekke røret og lagre.
- Når du er klar for HPLC-analyse, resuspend prøven i 300 μL av vann og bland kraftig med Vortex på høy i 10 s.
- Overfør resuspendert prøve til et sentrifugerør filter (0,22 μm cellulose acetate, 2 mL størrelse) og sentrifuge ved 5 000 x g i 10 min for å fjerne eventuelle overilet.
- Overfør filtrert prøve til et hetteglass som er egnet for HPLC-injeksjon.
6. HPLC rensing og måling av CoA-bimane
- Klargjør buffere. Buffer A: 50 mM KH2PO4, pH 4,6; Buffer B: Acetonitril (Optima klasse).
- Slå av HPLC-systemet.
Merk: HPLC-systemet i vårt laboratorium er en Waters e2695 separasjoner Module utstyrt med en 2489 ultrafiolett-synlig (UV-Vis) absorbansen detektor og en 2475 fluorescens detektor styrt med styrke 3 programvare. Systemet har også en automatisk prøve injeksjons maskin. - Injiser hver prøve (f.eks. 20 μL) for separasjon på en Gemini C18, 3 μm 100 å, 4,6 mm x 150 mm kolonne ved hjelp av programmet i tabell 1 med en strømningshastighet på 0,5 ml/min. Kol onne temperaturen er 25 ° c. Mål UV/synlig detektor absorbansen ved λ 393 NM, og fluorescerende deteksjon ved λex = 393 NM, λem = 470 NM. Oppbevaringstiden bestemmes ved å kjøre en CoA-bimane standard kurve før hvert sett med prøver.
- Noter området under CoA-bimane topp for hver prøve, og sammenlign med standardkurven for å beregne pmol av CoA-bimane injisert på HPLC-kolonnen. Den CoA-bimane absorbansen standardkurven brukes for vevsprøver, og CoA-bimane fluorescens standardkurven brukes for vevs kultur prøver.
- Som CoA-bimane verdier representerer total CoA for hver prøve, normalisere til antall levedyktige celler for kultur prøver, eller mg våt vekt for vevsprøver (figur 6). Alternativt kan du beregne de totale CoA verdiene etter normalisering til DNA eller proteininnhold for hver prøve. DNA eller proteininnhold kan bestemmes separat ved hjelp av sample alikvoter som er fjernet under prøveforberedelse før KOH tillegg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En relativt rask og pålitelig metode for påvisning av total CoA i kulturperler celler og vev har blitt utviklet av derivatizing tiolderivat av CoA til et fluorescerende middel ved hjelp mBBr, og deretter rense derivatized CoA-bimane bruker reverse fase HPLC. En standard kurve genereres først, der kjente og økende mengder av CoA-bimane-standarden injiseres individuelt, og områdene under toppene i CoA-bimane-kromatogrammene tegnes som en funksjon av inngangen CoA-bimane (Figur 4). CoA-bimane har et absorbansen maksimum på λ 393 nM, og en representativ HPLC-profil viser Oppbevaringstiden for CoA-bimane-standarden på en C18 HPLC-kolonne (Figur 3) ved hjelp av eluering-programmet i tabell 1. Representative standard kurver av CoA-bimane, oppdaget ved å måle absorbansen eller fluorescens enheter, er vist i Figur 4A og Figur 4B, henholdsvis. Standarden kurve i Figur 4A reflekterer omfanget av absorbansen av COA-bimane på λ 393 NM og Figur 4B representerer fluorescens av COA-bimane (λex = 393 NM og λem = 470 NM) plottet versus input mengden CoA-bimane. Det CoA-bimane målestokk kan oppdaget fra 0,01 å 12 000 pmol og dekker en 106-folde omfang når oppdagelsen benytter begge to absorbansen og fluorescens er kombinert. Mens den nedre grensen for påvisning av standarden er 0,01 pmol, er den nedre grensen for CoA-bimane kvantifisering i eksperimentelle prøver 0,2 pmol som er ca 5-fold større enn baseline eller bakgrunnen fluorescens i kromatogram. Valget av påvisning av absorbansen eller fluorescens av CoA-bimane avhenger av mengden av CoA som normalt finnes i vev eller celler, sammen med det praktiske ved å arbeide med større eller mindre utvalgsstørrelser. Absorbansen er generelt nyttig for vevsprøver fordi håndtering 40-50 mg av Start materiale gir bedre utvinning enn 5 mg vevsprøver, mens fluorescens er generelt nyttig for kultivert celleprøver som er mindre i størrelse og det er større tillit til interpolering av verdier i den nedre enden av fluorescens standard kurve. Laboratorier med bare absorbansen deteksjon kan vurdere å øke eller redusere Start utvalgsstørrelsen, øke HPLC injeksjon volum eller redusere volumet for sample blanding (§ 5,9 ovenfor) for målinger i kulturperler celler.
Vilkårene for hydroloserende acyl-Ekthetsgarantier fra vev og kultivert celler ble optimalisert ved å justere KOH konsentrasjon, og tid og temperatur på påfølgende inkubasjons (data ikke vist). Den optimale tilstanden ble funnet å være 0,25 M ved 55 ° c i 2 timer. Det tiolderivat gruppe av ledig CoA addisjonstegn alle CoA frigjort fra thioesters var derivatized av reaksjonen med mBBr fulgte innstilling av det pH. Påfølgende HPLC separasjon og typiske deteksjon profiler for mus lever eller menneskelig kultivert C3A celler er angitt i figur 5 som røde topper, med en oppbevaringstid mellom 11 og 12 minutter ved hjelp av eluering program som er beskrevet i tabell 1. Typiske mengder biologisk Start materiale er 30-40 mg murine lever (våt vekt), 6-8 x 106 celler for Human "Liver-like" C3A celler, eller ~ 1,3 x 107 celler for menneskelig HEK293T celler. C3A-cellene ble behandlet med en PanK eksperimentell legemiddel PZ-2891 ved 10 uM som hever CoA17 (figur 6). Ekthetsgarantien målinger i HEK293T celler når PanK isoformene er overexpressed viser CoA målinger over et bredt spekter (431-6925 pmoles/μL) (figur 6). Utvalgsstørrelsene som kreves for denne metodikken, er praktiske for bruk i mange eksperimentelle kontekster.
Området under CoA-bimane topp ble beregnet ved hjelp av programvare levert med HPLC. Topp grensene kan bestemmes automatisk av HPLC programvare i påvente av riktig justering av input verdier for Baseline korreksjon og Peak definition, men vårt laboratorium foretrekker å manuelt utpeke CoA-bimane topp i hver kromatogram, spesielt for ukjente biologiske prøver.
| Klokkeslett (min) | Strømningshastighet (mL/min) | % A | % B | Kurve |
| 0 | 0,5 | 90 | 10 | 0 |
| 2 | 0,5 | 90 | 10 | 6 |
| 6 | 0,5 | 85 | 15 | 6 |
| 18 | 0,5 | 60 | 40 | 6 |
| 23 | 0,5 | 60 | 40 | 6 |
| 25 | 0,5 | 90 | 10 | 6 |
| 30 | 0,5 | 90 | 10 | 66 |
Tabell 1: HPLC program for COA-Bimane separasjon. Buffer A: 50 mM KH2PO4, pH 4,6; Buffer B: Acetonitril. Blandingen av buffer A og buffer B følger Curve 6 som er en lineær gradient, med en mellomliggende Curve 8 som er en middels konkav gradient.
Figur 1. Koenzym en biosyntesen vei. Pantothenate kinase (PanK) katalyserer fosforylering av pantothenate (vitamin B5) til 4 ′-phosphopantothenate i første trinn av COA biosyntesen. Dannelse av phosphopantothenate etterfølges av kondens med cystein katalysert av 4 ′-phosphopantothenoylcysteine syntase og deretter dekarboksylering å danne 4 ′-phosphopantetheine av 4 ′-phosphopanthenoylcysteine decarboksilaza. 4 ′-Phosphopantetheine er omvendt å koenzym A (CoA) inne en to-steg forarbeide katalysert av CoA syntase. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. MBBr reaksjon med COA. Monobromobimane (mBBr) blandes med CoA-SH (gratis CoA) og inkubert ved romtemperatur i 2 timer i mørket. Non-fluorescerende mBBr blir fluorescerende når bundet til CoA å danne CoA-bimane. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: ABSORBANSEN HPLC spor av COA-Bimane standard. CoA-bimane ble separert i en Gemini C18-kolonne ved hjelp av HPLC-programmet i tabell 1. Vanlig oppbevaringstid (min.) indikeres av aborbance enheter (AU). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: COA-bimane standard kurver som oppdages av absorbansen eller fluorescens. (A) standardkurven målt ved hjelp av absorbansen deteksjons enheter for COA-bimane ble målt ved λ 393 NM. Vevsprøver evalueres vanligvis ved hjelp av absorbansen standard kurve. (B) standardkurven målt ved hjelp av fluorescens deteksjons enheter for COA-bimane ved λex = 393 NM, λem = 470 NM. Kultivert celler er vanligvis evaluert for CoA innhold ved hjelp av fluorescens standard kurve. Dupliserte standarder (og prøver) blir rutinemessig evaluert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: HPLC spor av typiske lever eller kultivert celleprøver. (A) COA-bimane identifisering og kvantifisering av innhold i mus leveren ekstrakt. Absorbansen enheter (AU) er angitt. (B) COA-bimane identifisering og kvantifisering av innhold i HEPG2/C3A kultur celler. Fluorescens utslipps enheter (EU) er indisert. CoA-bimane topper er vist i rødt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. CoA nivåer i mus leveren, kultivert C3A og HEK293T celler. (A) COA måling i mus lever fra pantothenate kinase knockout (Pank1-/-) og matchet Wild-type (WT) dyr. Pank1-/- dyr har lavere COA i leveren sammenlignet med WT dyr på grunn av fravær av Pank1 Expression9. Dataene ble innhentet ved hjelp av 5 mannlige mus per genotype og er representert som gjennomsnittet ± SEM. (B) COA nivåer i HEPG2/C3A celler behandlet med enten dimetylsulfoksid (kjøretøy kontroll) eller PZ-2891, en eksperimentell stoff som modulerer PanK aktivitet på 10 uM 17. det cellular COA plan flate er opphøyet fulgte 24-timen INKUBASJONS med PZ-2891. (C) COA nivåer i HEK293T celler transfekterte med enten tom vektor pcdna 3.1, eller cDNAs koding menneskelige Pank isoformene: PANK1β, PANK2m som er moden, bearbeidet isoformen av menneskelig PANK2, eller PANK3. CoA nivåer er forhøyet ved overuttrykte av alle aktive PANK isoformene. Dataene i (B) og (C) er fra uavhengige tre eksemplarer prøver og er REPRESENTERT som gjennomsnittet ± SEM. Den statistiske analysen ble gjort ved hjelp av de ikke-sammenkoblet t-test og verdiene av betydning er vist i rødt. Dataene i panelene (B) og (C) er tilpasset fra Sharma et al. 12Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her viser vi en pålitelig, trinnvis fremgangsmåte for kvantifisere totale CoA i celler og animalsk vev med et bredt spekter av lineær deteksjon som er tilgjengelig i mange laboratorier som har en HPLC med enten en absorbansen eller fluorescens output detektor. Alternativt, masse massespektrometri er en vanlig teknikk for å evaluere CoA og CoA thioesters, men er ikke allment tilgjengelig på grunn av kostnaden av instrumentering og den spesialiserte kunnskapen som kreves for utvikling av metodikk og tolkning av data. Isotopically benevnt CoA det er egnet til bruk idet en indre målestokk for kvantifisering av ledig CoA inne masse massespektrometri er ikke kommersielt anvendelig, og ledig CoA er ikke oppdaget av instrumentet med det likt følsomheten idet CoA thioesters som acetyl-CoA. Således, ledig CoA høyder er ofte grovt undervurdert av masse massespektrometri hvis ikke det produksjon data er sammenlignet med en CoA målestokk kalibrering kurven.
Vi sammenlignet metoden beskrevet her med en annen metode som tidligere ble brukt i laboratoriet vårt og funnet større CoA utvinning fra mus leveren, 123,4 ± 7,9 pmol/mg våt vekt, med denne aktuelle metoden sammenlignet med ~ 80 pmol/mg våt vekt ved hjelp av en enzymatisk analysen som derivatized gratis CoA med et radioaktivt merke28. Metoden for å måle total CoA som er beskrevet her, er betydelig mindre tungvint, raskere og enklere å kontrollere sammenlignet med metoden som tidligere ble brukt i vår Lab28. Tidligere ble CoA bestemt etter Heksan ekstraksjon av celle lysat og utsatt for enzymatisk konvertering til radioaktivt [14C] Lauryl-COA formidlet av Escherichia coli acyl-COA syntetase (FadD). Den syre løselige kort kjedet acyl-Ekthetsgarantier og den syre-uløselig lange kjeden acyl-Ekthetsgarantier i celle lysat ble hydrolysert med KOH for å gi gratis CoA og deretter utsettes for Heksan ekstraksjon før enzymatisk konvertering til gratis CoA29. Selv om denne forrige prosedyren hadde gode spesifisitet og følsomhet, i praksis oppgaven krevde 2 virkedager å fullføre og rekombinant E. coli Acyl-COA syntetase måtte være forberedt, renset og målt for enzymatisk spesifikk aktivitet før CoA-analysen. Det krevde også instrumentering i stand til å påvise og kvantifisere radioaktive isotoper som er mye mindre vanlig i biomedisinsk laboratorier i nyere historie. Den nåværende metoden som er beskrevet her er mest egnet for vår forskning interesse i pantothenate kinase (PanK). PanK styrer Flux gjennom CoA biosyntetiske veien og så den totale CoA nivå er avlesning for PanK aktivitet i biologiske prøver.
Slukking av metabolske reaksjoner i en biologisk prøve for å opprettholde en ekte CoA-mengde krever pleie og hurtighet, og er avgjørende for denne prosedyren. Rapid deproteinization med en syre eller organisk løsemiddel, eller Flash-frysing av prøvene er to metoder som har blitt brukt i de siste30,31. I denne metoden er iskald ultrarent vann raskt lagt til iskald PBS-vasket celler fra kulturer, og tilhenger celler pluss vann blir deretter skrapet av kultur parabolen før overføring til KOH. Frysing av den kultivert celle suspensjonen i [KOH + vann] for lagring ved-80 ° c før prøve tilberedning er et akseptabelt stoppe punkt. Imidlertid bør CoA verdier fra frosne celleprøver sammenlignes med de fra ferskt tilberedte prøver for å finne ut om det er betydelig tap av CoA-signalet. Tap av ≤ 10% CoA har skjedd i våre hender etter celleprøve frysing og kan være relatert til den utvidede tiden av prøven i KOH som må kontrolleres. Animal tissue brikkene er raskt frosset på en liten folie "flåten" flyter på LN2 umiddelbart etter fjerning av vevet fra et euthanized dyr. Utvalgsstørrelser fra 5 mg til 60 mg frossen vev er egnet for denne metoden med lineær CoA gir. Når frosset, vevsprøver lagret på-80 ° c er stabile i minst 3 måneder, forutsatt at periodisk tine ikke oppstår.
Prøve forberedelsene før HPLC-analysen er ikke høy gjennomstrømning og krever en hel arbeids halv dag. Det anbefales at operatøren håndterer maksimalt 30 prøver på en gang, og starter med homogenisering av et sett med 15 prøver etterfulgt av homogenisering av det andre settet med 15 prøver i løpet av 2 h inkubasjons med KOH for første settet. Den KOH inkubasjonsperioden ble først optimalisert ved hjelp av kjøpt CoA thioesters med inkubasjons ganger fra 30 min til 4 h, og deretter 2 h inkubasjons ble valgt for å imøtekomme tiden for komplett CoA thioester hydrolyse i en rekke vevsprøver, alt fra skjelettmuskulatur til leveren8. Inkubasjons for CoA derivatization med mBBr er satt til 2 t ved ca pH 8 og en 20-fold overkant av mBBr er lagt til fullstendig konvertere CoA i den biologiske prøvene. Sulhydryl andeler av proteiner og metabolitter enn CoA som carnitine eller glutation i prøven vil bli derivatized i tillegg til CoA, og 20-fold overflødig ble beregnet på grunnlag av den forventede mengden av den totale CoA leveren som har det høyeste nivået blant vev. PH er redusert før inkubasjons med mBBr fordi bromobimanes generelt er mindre reaktive mot andre nucleophiles som aminer og carboxylates i mer nøytrale vandige løsninger. Tidspunktet for derivatization bør ikke overstige 2 t for å unngå eller minske reaksjonen med protein tioler26. Man trenger å bruke nonnucleophilic buffere for å redusere og vedlikeholde pH fordi tilstedeværelsen av buffer anioner ved høye konsentrasjoner kan forstyrre mBBr derivatization av CoA.
Eksempel opprydding på SPE-kolonnen gjøres manuelt i laboratoriet vårt og kan utføres ved hjelp av et vakuum manifold å forkorte tiden som kreves for dette trinnet. God utvinning av derivatized CoA fra SPE-kolonnen er rutinemessig oppnåelig, og dette ble bestemt separat ved hjelp av radioaktivt [13C] COA thioesters som også BEHOLDES på spe-kolonnen. Gjenoppretting av [13c] acetyl-coa var 97,6% og gjenvinning av [13c] palmitoyl-COA var 96,1%. Fordampning av SPE-kolonnen eluatet er vanligvis utføres under nitrogen gass over natten i laboratoriet vårt som et spørsmål om bekvemmelighet, men tørking kan gjennomføres innen 4 timer under nitrogen gass eller ved hjelp av en speedvac konsentratoren. De mest kritiske trinnene i metoden er knyttet til pH-justering og kan sjekkes med pH papirstrimler underveis. For KOH-hydrolyse må pH-verdien være ≥ 12 for å oppnå fullstendig frigivelse av thioester fra CoA. PH-verdien må være 7,8 – 8,5 for å støtte reaktivitet av mBBr-derivatization, og etter at derivatization er fullført, skal pH justeres til å bli svært syrlig, om pH 1-2, for at CoA-bimane kan binde til SPE-kolonnen. Den SPE-kolonnen renser opp prøven for å eliminere overflødig ureagerte mBBr og noen urelaterte biologiske stoffer.
Den HPLC programmet er utformet slik at vasking og re-likevekts av C18 kolonnen er tilstrekkelig til å eliminere bakgrunn og carryover signaler mellom prøvene. Vann tomme prøver settes inn etter hvert 5 prøver i det eksperimentelle prøve settet som en forholdsregel for å overvåke mulige carryover mellom settene og for å sikre Kol onne renslighet. En sporadisk feil fra uriktig prøve injeksjon kan forekomme når du bruker en automatisert prøve injeksjonsvæske for HPLC, og dette kan lett kontrolleres ved å sammenligne volumene som gjenstår i prøve hetteglassene etter injeksjon eller inspeksjon av de ikke-CoA-relaterte toppene i utgang kromatogram. Hvis CoA-verdiene overskrider det lineære området for kalibreringskurven for fluorescens deteksjon, vil verdiene mest sannsynlig være innen rekkevidde for ultrafiolett absorbansen deteksjon. Hvis ikke, kan fortynning av prøven med et kjent volum av vann redusere signalet til å være i det lineære området og beregninger bør ta noen fortynning faktor i betraktning.
CoA nivåer vil variere blant innavlet mus stammer med ulik genetisk bakgrunn, selv om verdiene er reproduserbar når biologiske prøver er innhentet fra samme belastning under samme forhold. Vi har estimert COA i flere forskjellige muse linjer i ulike studier10,12,16,17. COA ble også målt i flere kultivert cellelinjer16,17 ved hjelp av enten primær eller udødeliggjort celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
MWF, CS og SJ skrev avisen, MWF og CS gitt data og tall, COR designet eksperimenter og kritisk gjennomgått manuskriptet. SJ og COR er oppfinnere på en ventende patentsøknad (PCT/US17/39037) "små molekyl modulatorer av pantothenate kinaser" holdt av St. Jude Children ' s Research Hospital som dekker PZ-2891 sammensatte referert i denne artikkelen.
Acknowledgments
Forfatterne erkjenner finansiering for sponset forskning levert av CoA legemiddel selskap, Inc., et datterselskap av BridgeBio LLC, National Institutes of Health Grant GM34496, og den amerikanske libanesiske syriske Associated velferdsorganisasjoner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-(2-pyridyl)-ethyl silica gel SPE column | Millipore-Sigma | 54127-U | |
| coenzyme A | Avanti Polar Lipids | 870700 | |
| Gemini C18 3 μm 100 Å HPLC column | Phenomenex | 00F-4439-E0 | |
| monobromobimane | ThermoFisher Scientific | M-1378 | |
| Omni-Tip probe tissue disrupter | Omni International | 32750H | |
| Parafilm | Fisher | S37440 | |
| PowerGen 125 motorized rotor stator homogenizer | ThermoFisher Scientific | NC0530997 | |
| Spin-X centrifuge tube filter | CoStar | 8161 | |
| Trizma-HCl | Fisher | T395-1 | |
| Waters 2475 fluorescence detector | Waters | 2475 | |
| Waters 2489 UV-Vis detector | Waters | 2489 | |
| Waters e2695 separations module | Waters | e2695 |
References
- Abiko, Y. Metabolic Pathways. Greenburg, D. M. 7, Academic Press, Inc. Ch. 7 1-25 (1975).
- Leonardi, R., Zhang, Y. -M., Rock, C. O., Jackowski, S.
- Jackowski, S., Rock, C. O.
- Robishaw, J. D., Berkich, D. A., Neely, J. R. Rate-limiting step and control of coenzyme A synthesis in cardiac muscle. Journal of Biological Chemistry. 257, 10967-10972 (1982).
- Di Meo, I., Carecchio, M., Tiranti, V. Inborn errors of coenzyme A metabolism and neurodegeneration. Journal of Inherited Metabolic Disease. 42, 49-56 (2019).
- Zhou, B., et al. A novel pantothenate kinase gene (PANK2) is defective in Hallervorden-Spatz syndrome. Nature Genetics. 28, 345-349 (2001).
- Dusi, S., et al. Exome sequence reveals mutations in CoA synthase as a cause of neurodegeneration with brain iron accumulation. American Journal of Human Genetics. 94, 11-22 (2014).
- Dansie, L. E., et al.
- Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state. PLoS ONE. 5, 11107 (2015).
- Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance. Diabetologia. 57, 1466-1475 (2014).
- Israel, B. C., Smith, C. M. Effects of acute and chronic ethanol ingestion on pantothenate and CoA status of rats. The Journal of Nutrition. 117, 443-451 (1987).
- Garcia, M., Leonardi, R., Zhang, Y. M., Rehg, J. E., Jackowski, S. Germline deletion of pantothenate kinases 1 and 2 reveals the key roles for CoA in postnatal metabolism. PLoS One. 7, 40871 (2012).
- Corbin, D. R., et al. Excess coenzyme A reduces skeletal muscle performance and strength in mice overexpressing human PANK2. Molecular Genetics and Metabolism. 120, 350-362 (2017).
- Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver. Journal of Lipid Research. 60, 1005-1019 (2019).
- Shumar, S. A., et al. Induction of neuron-specific degradation of Coenzyme A models pantothenate kinase-associated neurodegeneration by reducing motor coordination in mice. PLoS ONE. 10, 0130013 (2015).
- Zano, S. P., Pate, C., Frank, M., Rock, C. O., Jackowski, S. Correction of a genetic deficiency in pantothenate kinase 1 using phosphopantothenate replacement therapy. Molecular Genetics and Metabolism. 16, 281-288 (2015).
- Sharma, L. K., et al. A therapeutic approach to pantothenate kinase associated neurodegeneration. Nature Communications. 9, 4399 (2018).
- Alvarez-Cordoba, M., et al. Pantothenate Rescues Iron Accumulation in Pantothenate Kinase-Associated Neurodegeneration Depending on the Type of Mutation. Molecular Neurobiology. 56, 3638-3656 (2019).
- Arber, C., et al. iPSC-derived neuronal models of PANK2-associated neurodegeneration reveal mitochondrial dysfunction contributing to early disease. PLoS One. 12, 0184104 (2017).
- Di Meo, I., et al. Acetyl-4'-phosphopantetheine is stable in serum and prevents phenotypes induced by pantothenate kinase deficiency. Scientific Reports. 7, 11260 (2017).
- Nishikawa, T., Edelstein, D., Brownlee, M. The missing link: a single unifying mechanism for diabetic complications. Kidney International Supplements. 77, 26-30 (2000).
- Tsuchiya, Y., Pham, U., Gout, I. Methods for measuring CoA and CoA derivatives in biological samples. Biochemical Society Transactions. 42, 1107-1111 (2014).
- Demoz, A., Netteland, B., Svardal, A., Mansoor, M. A., Berge, R. K. Separation and Detection of Tissue Coash and Long-Chain Acyl-Coa by Reversed-Phase High-Performance Liquid-Chromatography after Precolumn Derivatization with Monobromobimane. Journal of Chromatography. 635, 251-256 (1993).
- Shimada, K., Mitamura, K.
- Minkler, P. E., Kerner, J., Ingalls, S. T., Hoppel, C. L. Novel isolation procedure for short-, medium-, and long-chain acyl-coenzyme A esters from tissue. Analytical Biochemistry. 376, 275-276 (2008).
- Newton, G. L., Fahey, R. C. Determination of biothiols by bromobimane labeling and high-performance liquid chromatography. Methods in Enzymology. 251, 148-166 (1995).
- Radkowsky, A. E., Kosower, E. M. Bimanes .17. (Haloalkyl)-1,5-Diazabicyclo[3.3.0]Octadienediones (Halo-9,10-Dioxabimanes) - Reactivity toward the Tripeptide Thiol, Glutathione. Journal of the American Chemical Society. 108, 4527-4531 (1986).
- Zhang, Y. M., et al. Chemical knockout of pantothenate kinase reveals the metabolic and genetic program responsible for hepatic coenzyme A homeostasis. Chemistry & Biology. 14, 291-302 (2007).
- Tokutake, Y., Onizawa, N., Katoh, H. Toyoda A,Chohnan S. Coenzyme A and its thioester pools in fasted and fed rat tissues. Biochemical and Biophysical Research Communications. 402, 158-162 (2010).
- Shibata, K., Nakai, T., Fukuwatari, T. Simultaneous high-performance liquid chromatography determination of coenzyme A, dephospho-coenzyme A, and acetyl-coenzyme A in normal and pantothenic acid-deficient rats. Analytical Biochemistry. 430, 151-155 (2012).
- Chohnan, S., Takamura, Y. A simple micromethod for measurement of CoASH and its use in measuring the intracellular levles of CoASH and short chain acyl-CoAs in Escherichia coli K12 cells. Agricultural and Biological Chemistry. 55, 87-94 (1991).
