De voorbereiding van Drosophila Embryo's voor Live-Imaging Met behulp van de Opknoping Drop Protocol

Summary

Een eenvoudige, goedkope en effectieve methode voor de bereiding Drosophila embryo's voor live-imaging analyse wordt gepresenteerd. Onze-protocol zorgt voor vochtigheid en gas uit te wisselen en comprimeert niet de Drosophila embryo. Deze methode is geschikt voor het GFP-gebaseerde live beeldvorming van Drosophila embryo's met behulp van een stereomicroscoop of rechtop samengestelde microscoop.

Abstract

Groen fluorescerend eiwit (GFP)-gebaseerde timelapse live-imaging is een krachtige techniek voor het bestuderen van de genetische regulatie van dynamische processen zoals weefsel morfogenese, cel-cel adhesie, of celdood. Drosophila embryo's uitdrukken GFP zijn gemakkelijk beeld gebracht met behulp van stereoscopische of confocale microscopie. Een doel van een live-imaging protocol is het minimaliseren van nadelige effecten zoals uitdroging en hypoxie. Eerdere protocollen voor het bereiden van Drosophila embryo's voor live-imaging analyse hebben betrokken plaatsen dechorionated embryo's in halogene olie en daartussen ze tussen een halogene gas-permeabel membraan en een dekglaasje^1-3. De introductie van compressie door de montage van embryo's op deze manier is een ongewenste complicatie voor een biomechanische-gebaseerde analyse van morfogenese. Onze methode, die we de opknoping druppel protocol, resulteert in uitstekende levensvatbaarheid van de embryo's tijdens live beeldvorming en vereist niet dat embryo's worden gecomprimeerd. Kortom, de opknoping druppel protocol heeft betrekking op de plaatsing van embryo's in een daling van de halogene olie die is opgehangen aan een dekglaasje, die op zijn beurt, gefixeerd in positie over een vochtige kamer. Naast het leveren van gas uit te wisselen en het voorkomen van uitdroging, dit arrangement maakt gebruik van het drijfvermogen van de embryo's in halogene olie om te voorkomen dat ze drijven uit positie tijdens timelapse overname. Deze video beschrijft in detail hoe het verzamelen en Drosophila embryo's voor te bereiden op live-imaging met behulp van de opknoping druppel protocol. Dit protocol is geschikt voor de beeldvorming dechorionated embryo's met behulp van stereomicroscopie of rechtop samengestelde fluorescentie microscoop.

Protocol

Voorbereiding Verzamel embryo's op standaard druivensap agarplaten 4. Het is handig om een ​​geautomatiseerde Drosophila Egg Collector (flymax Scientific Equipment BV) te gebruiken. Met behulp van synchrone geënsceneerde embryo collecties zal het aantal dechorionations die moeten worden uitgevoerd om voldoende aantallen embryo's te verkrijgen bij de gewenste ontwikkelingsstadium te verminderen. Bereid een dechorionation dia door het aanbrengen van een stukje dubbelzijdige tap…

Discussion

Beschrijven we een nieuwe methode voor het bereiden Drosophila embryo's voor live-imaging-analyse, die we de opknoping druppel protocol. Helaas is het niet mogelijk om de opknoping druppel protocol te gebruiken bij het werken met een omgekeerde microscoop. In dit geval de daartussen techniek (zoals beschreven in de samenvatting hierboven) moet worden gebruikt en compressie van de embryo's blijft een punt van zorg.

In experimenten waar de cel vorm en grootte worden gemeten om krachten…

Materials

Standard equipment and materials required to prepare embryos for live-imaging using the hanging drop protocol include the following items: microscope slides, coverslips (22 x 40 mm, No. 2), double-sided tape, jeweller’s forceps (Dumont style No. 5), halocarbon oil series 56 and series 700 (Halocarbon Products Corp.), a utility knife or single edge razor blade, tissue paper, scissors, distilled water, general purpose tape, and a pipet suitable for delivering 20-40 μl. The live imaging protocol also requires a custom-made live imaging chamber. This is prepared by cutting a 5 mm think polycarbonate plastic sheet to the dimensions of a standard microscope slide (75 X 25 mm) and using a rotor to create a 3mm deep depression in the slide (20 X 55 mm). Access to a stereomicroscope (dissecting microscope) and a fiber-optic illumination source is also required.