دروسوفيلا تكييف المغازلة: طريقة لاختبار التعلم والذاكرة في الذباب

Overview

يصف هذا الفيديو مقايسة تكييف كلاسيكية تختبر التعلم والذاكرة في Drosophila، تسمى تكييف المغازلة. ويستند الفحص على الحد من مغازلة الذكور بعد أن شهدت رفضا من قبل أنثى غير متقبلة premated. يظهر بروتوكول المثال إعداد الإجراء الذي يمكن استخدامه لتقييم الذاكرة قصيرة وطويلة الأجل.

Protocol

هذا البروتوكول هو مقتطف من كومانس وآخرون، تكييف التودد Drosophila كمقياس للتعلم والذاكرة ، J. Vis. Exp. (2017).

ملاحظة: في البروتوكول الموضح أدناه، يتم وصف نسخة متماثلة واحدة من التجميع والتدريب والاختبار. من أجل اختبار استنساخ النتائج، ينبغي تكرار هذه الخطوات بالتوازي، في عدة أيام، ومع مجموعات منفصلة من الذباب(الجدول 1). ويستند البروتوكول على دورة حياة لمدة 10 أيام من البيض إلى الكبار، وهو أمر طبيعي عند تربية الذباب في ظل ظروف ثابتة من 25 درجة مئوية، والرطوبة 70٪، ودورة خفيفة / داكنة 12 ساعة. تفترض كافة جوانب هذا البروتوكول أن الشروط تبقى ثابتة في جميع أنحاء المقايسة بأكملها. يشار إلى الأوقات قبل ساعات من تشغيل الأضواء (BLO) أو بعد تشغيل الأضواء (ALO) في الحاضنة ، حيث يمكن ضبط ذلك بشكل ملائم اعتمادا على الوقت المفضل للباحث في اليوم. استخدام غاز CO₂ فقط لجمع الأولية من الذباب الذكور ساذجة وجمع الإناث premated. يتكون هذا البروتوكول لتكييف المغازلة من الخطوات التالية:

1. إنشاء ثقافات تجميع نسائية مسبقة
2. إنشاء ثقافات لجمع مواد اختبار الذكور
3. إعداد الكتل السكنية
4. إنشاء قنينات التزاوج لإنتاج الإناث premated موحدة
5. مجموعة من مواضيع اختبار الذكور
6. تدريب
7. اختبار
8. تحليل بيانات الفيديو والإحصاءات

1. إنشاء ثقافات تجميع نسائية مسبقة

1. إعداد باورفوود. يغلي 0.8٪ (ث / v) أجار، 8٪ (ث / v) الخميرة، 2٪ (ث / v) استخراج الخميرة، 2٪ (ث / v) بيبتون، 3٪ (ث / v) السكروز، 6٪ (ث / الخامس) الجلوكوز، 0.05٪ (ث / v) MgSO_4،و 0.05٪ (ث / v) CaCl₂ في الماء لمدة 15 دقيقة. السماح للمحلول لتبرد إلى 70 درجة مئوية قبل إضافة 0.05٪ (ث / v) ميثيلبارابين(تحذير: سامة)و 0.5٪ (v/v) حمض البروبيونيك (تحذير: سامة). تخلط جيدا عن طريق اثارة في حين مزيد من التبريد إلى 50 درجة مئوية للحصول على حل متجانس.
2. قبل أن يتماسك الطعام في درجة حرارة الغرفة ، أضف ~ 50 مل من powerfood إلى كل قارورة بلاستيكية سعة 175 مل. السماح للطعام لتبريد أكثر من ذلك. أغلق القارورة بقابس.
   ملاحظة: Powerfood هو خليط غذائي متخصص تم صياغته خصيصا لإنتاج أعداد كبيرة من الذباب ، ويفترض عن طريق تحفيز وضع البيض. لا يستخدم Powerfood لإنتاج الذباب الذكور التي سيتم استخدامها لتحليل السلوك (الخطوة 2) لأن النظام الغذائي غير نمطية والزحام المحتملة قد تؤثر على التنمية.
3. في اليوم -11(الجدول 1)،تبدأ 5-20 ثقافات النمط البري مع ما يقرب من 60-100 الذباب (مزيج من الذكور والإناث) في قوارير باورفوود؛ وسوف تستخدم هذه في الخطوة 4 لإنتاج الإناث premated موحدة. إضافة ورقة تصفية إلى كل قارورة لزيادة المساحة التي يمكن أن اليرقات pupate; وهذا سيزيد من عدد الذباب التي يمكن eclose.
4. كرر بشكل دوري الخطوات 1.1-1.3 طوال التجربة للحصول على ما يكفي من الذباب الناشئ كمدخل ل "إنشاء قنينات التزاوج لإنتاج الإناث المطاهنة الموحدة" (الخطوة 4).

2. إنشاء ثقافات لمجموعة من المواضيع اختبار الذكور

1. إعداد الطعام العادي، مصنوعة من 0.5٪ (ث / v) أجار، 2.75٪ (ث / v) الخميرة، 5.2٪ (ث / الخامس) دقيق الذرة، 11٪ (ث / الخامس) السكر، 0.05٪ (ث / الخامس) ميثيلبارابين، و 0.5٪ (v/v) حمض البروبيونيك في الماء، كما هو موضح في الخطوتين 1.1 و 1.2. أغلق القنينات البلاستيكية التي يبلغ سعة 175 مل مع قابس قارورة ذبابة.
2. في اليوم -10 (الجدول 1)، ضع حوالي 10-20 الذكور مع ما يقرب من 30-75 الإناث العذراء (المواد / جدول المعدات) في كل قارورة 175 مل تحتوي على الطعام العادي. إضافة ورقة تصفية لزيادة مساحة السطح للجراء وتحقيق أقصى قدر من الإنتاجية.
3. إنشاء 3-6 قارورات 175 مل لكل نمط جيني للحصول على العدد المطلوب من الذكور الخاضعين للاختبار.
   ملاحظة: قد تكون هناك حاجة إلى المزيد من القنينات ، اعتمادا على إنتاجية النمط الجيني المطلوب.

3. إعداد الكتل السكنية (الشكل 2أ)

1. تذوب ما يقرب من 50 مل من powerfood لكل كتلة سكنية في الميكروويف، أو إعداده طازجة.
2. إضافة 500 ميكرولتر من powerfood إلى كل بئر من 96 جيدا، كتلة مسطحة القاع باستخدام ماصة متعددة الضغاز.
3. السماح للطعام لترسيخ في درجة حرارة الغرفة.
4. تغطية الكتل مع فيلم لاصق PCR واستخدام إبرة لجعل ما لا يقل عن 4 ثقوب لكل بئر لتوفير الهواء النقي للذباب.
5. من أجل أن تكون قادرة على فتح كل بئر، واستخدام شفرة حلاقة لقطع الفيلم لاصقة بالطول بين كل صف. اترك الفيلم سليما على أحد طرفي الكتلة.
6. يمكن تخزين الكتل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى يومين.
   ملاحظة: السماح للكتل لإعادة التوازن إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.

4. إنشاء قارورة التزاوج لإنتاج الإناث قبل المطاوج الموحدة

1. في اليوم -1، قم بإزالة وتخلص من جميع الذباب البري البالغ من ثقافات جمع الإناث المسبقة في 2-5 ساعة BLO.
2. جمع الذباب باستخدام aspirator (الشكل 2B) من هذه القنينات في فترات 2-إلى 3 ساعة(على سبيل المثال، في 30 دقيقة، 2.5 ساعة، و 5 ساعة ALO) ووضعها في قارورة باورفوود جديدة تكملها كمية صغيرة من عجينة الخميرة وورق التصفية.
3. لتجنب الازدحام وتعزيز جو التزاوج الأمثل، لا تنقل أكثر من 150-200 ذبابة إلى كل قارورة جديدة. ضمان التزاوج بين جميع الإناث من خلال توفير ما لا يقل عن 25٪ من الذكور. تأكد من وجود عدد كاف من الإناث في قنينات التزاوج لاستيعاب حجم التجربة.
   ملاحظة: وبما أن هذه خطوة حاسمة في البروتوكول، تأكد من نقل الذباب الطازج فقط وعدم نقل الذباب القديم أو اليرقات أو الخوادر إلى قارورة التزاوج الجديدة.
4. احتضان هذه "قوارير التزاوج" لمدة أربعة أيام لإتاحة الوقت الكافي لجميع الإناث للتزاوج.

5. مجموعة من المواضيع اختبار الذكور

1. في اليوم الأول(الجدول 1)عند 2-3 ساعة BLO، استخدم CO₂ لإزالة جميع الذباب البالغ من قوارير جمع الذكور (الخطوة 2)، ولكن دع المزيد من الذباب يسيل خلال الساعات القليلة القادمة.
2. على مدى 5-6 ساعة القادمة، وإزالة الذباب eclosed حديثا كل 20-30 دقيقة باستخدام CO₂ ووضع كل ذكر في بئر فردية من كتلة السكن (الخطوة 3) باستخدام الطامح (الشكل 2B).
3. إعادة ختم البئر مع فيلم PCR لاصقة.
   ملاحظة: وهذه خطوة حاسمة في البروتوكول. وينبغي جمع الذكور في كثير من الأحيان. وينبغي عزل الذكور التي تم جمعها في كتلة سكنية قريبة من وقت الانفجار، عندما تظهر تصبغ شاحب ووجود الميكونيوم في البطن شفافة.
   ملاحظة: استخدام لطيف من الطامح يسمح بنقل الذباب. ومع ذلك ، فإن الاستخدام غير المناسب يشدد على الذباب ، مما يسبب تباينا في المقايسة (انظر المناقشة).
4. تهدف إلى جمع ما يصل إلى 48 من الذكور في النمط الجيني. وهذا يوفر فائضا طفيفا عن العدد الأقصى للذكور اللازمين لتحليل الظروف الساذجة والمدربة على حد سواء، مما يسمح ببعض الخسارة خلال خطوات النقل اللاحقة.

6. التدريب

1. إزالة الذباب من قارورة التزاوج (الخطوة 4.2) باستخدام_ثاني أكسيد الكربون وفصل الإناث premated من الذكور.
2. باستخدام الطامح ، أضف أنثى واحدة مخدرة ، تم تخديرها مسبقا إلى كل بئر في صف واحد من كتلة سكنية جديدة.
3. باستخدام الطامح وبدون تخدير ، قم بنقل ذكر ساذج فردي من كتلة الإسكان التي تم إعدادها في الخطوة 5.2 إلى البئر الذي يحتوي على أنثى مسبقة. بعد وضع الذكر في البئر ، قم بإعادة ختمه على الفور مع الفيلم اللاصق . لا تسمح للذكر بالفرار.
   ملاحظة: نقل الذباب الذكور من الطامح إلى كتلة الإسكان عن طريق الاستفادة من سلوكهم الطبيعي "geotaxis السلبية".
4. كرر الخطوات 6.2-6.3 حتى يتم تأسيس عدد كاف من أزواج الذكور والإناث. من الناحية المثالية ، قم بإنشاء 24 زوجا ، صفين كاملين من كتلة سكنية ، لكل نمط جيني. ترك الذكور السذاجة المتبقية في كتلة السكن الأصلي التي أنشئت في الخطوة 5.2.
5. ترك أزواج الذكور والإناث دون عائق خلال فترة التدريب (الجدول 2، الشكل 1باء).
   ملاحظة: وخلال هذه الفترة، سوف يتودد الذكر إلى المحكمة وترفضه الأنثى المعقمة. بالنسبة للتعلم والأمراض المنقولة جنسيا ، فإن فترة التدريب هي ساعة واحدة وبالنسبة ل LTM ، فإن فترة التدريب هي 7-9 ساعة.
6. إنهاء التدريب (الجدول 2، الشكل 1ب) باستخدام الطامح لفصل الذكور بلطف عن الأنثى المعطاة مسبقا ؛ لا تستخدم التخدير. ضع الذكر المنفصل في كتلة سكنية جديدة.
7. استخدام الطامح لنقل جميع الذكور السذاجة بلطف ودون تخدير من كتلة الإسكان التي أنشئت في الخطوة 5.2 إلى كتلة سكنية جديدة.
   ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية ل STM والتعلم ، ولكنها مهمة جدا ل LTM لأن الذباب موجود لمدة 24 ساعة إضافية لاختبار LTM.
8. لSTM وLTM، والسماح للذكور للراحة لمدة 1 ساعة و ~ 24 ساعة، على التوالي (الجدول 2، الشكل 1باء) قبل الاختبار (الخطوة 7).
9. للتعلم، اختبر على الفور الذكور المدربين والسذاجة (الخطوة 7).

7. اختبار

1. جمع الذباب من قوارير التزاوج (الخطوة 4.2) باستخدام_ثاني أكسيد الكربون وفصل الإناث premated من الذكور.
2. دع الإناث يتعافين من التخدير لمدة ساعة واحدة على الأقل في قارورة تحتوي على طعام طبيعي.
3. قم بتركيب مسجلات الفيديو مسبقا(الشكل 2C)،من أجل تجهيز جميع المعدات قبل بدء الاختبار.
4. بدء الاختبار وفقا لجداول زمنية مختلفة للتعلم، STM، وLTM (الجدول 2، الشكل 1B). إجراء الاختبار مباشرة بعد التدريب للتعلم، 1 ساعة بعد التدريب لSTM، و 24 ساعة بعد التدريب لLTM.
5. باستخدام الطامح، نقل بلطف ذكر الفرد من كتلة السكن يستريح أو من كتلة السكن التدريب إذا كان يجري اختبار التعلم (الخطوة 6.7، تدريب؛ الخطوة 6.8، السذاجة) إلى نصف ساحة المغازلة مع المقسم مغلقة(الشكل 2D؛ انظر ملف S1 لخطة بناء).
   ملاحظة: وينبغي أن يكون استخدام السلوك الطبيعي "geotaxis السلبية" كافية لنقل الذباب الذكور من الطامح إلى الساحة المغازلة.
6. بسرعة ولكن بلطف نقل ثقب الدخول إلى الساحة التالية وتكرار الخطوة 7.5 حتى جميع الساحات 18 تحتوي على ذكر واحد.
7. باستخدام aspirator وبدون CO₂، إضافة أنثى واحدة premated (التي تم جمعها في الخطوة 7.2) إلى النصف الآخر من جميع الساحات 18.
8. ضع بعناية غرفة المغازلة تحت الكاميرا ، مع فتح الآبار التي تواجه لأسفل(الشكل 2C).
9. إزالة المقسم من الساحات للسماح التفاعل المباشر بين الذكور والإناث premated.
10. على الفور بدء تسجيل السلوك لمدة 10 دقيقة على الأقل.
    ملاحظة: عند استخدام إعداد الكاميرا اثنين، يمكن أن يتم التسجيل الموازي من اثنين من لوحات المغازلة في أطر زمنية متداخلة لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة.
11. إفراغ ساحات المغازلة باستخدام مكنسة كهربائية يدوية والسماح لغرفة المغازلة بالتهوية قبل إعادة الاستخدام.
12. كرر الخطوة 7.4-7.11 حتى يتم الانتهاء من اختبار جميع الأنماط الجينية والظروف(أي السذاجة والتدريب).

8. تحليل بيانات الفيديو والإحصاءات

1. حساب مؤشر المغازلة (CI)، الذي يعرف بأنه النسبة المئوية للوقت الذي تقوم به المحاكم الذكورية خلال أول 10 دقائق من فترة الاختبار، لكل ذبابة ذكورية فردية.
   ملاحظة: ويمكن القيام بذلك يدويا عن طريق مراقبة سلوك التودد النمطية(الشكل 1أ)أو باستخدام برامج الكمبيوتر للقياس الكمي الآلي لسلوك المغازلة.
   ملاحظة: من المستحسن تحليل 40-60 ذكرا لكل حالة على مدار ثلاثة أيام من أجل تحقيق قوة إحصائية كافية والحكم على اتساق بيانات CI.
2. حساب مؤشر التعلم (LI)، الذي يعرف بأنه انخفاض في المئة في متوسط CI من الذكور المدربين مقارنة بالذكور السذج (LI = (CI_{السذاجة} - CI_{المدربين}) / CI_{السذاجة}). قم بتقييم LI لكل يوم من أيام الاختبار وقارنه بال LI التراكمي المحسوب من جميع أيام الاختبار مجتمعة.
3. إنشاء ملف بيانات علامة جدولة عمودين منفصلة مع "النمط الجيني" و "CI" كرؤوس.
   ملاحظة: هذه العناوين حساسة لحالة الأحرف. يجب أن يتكون اسم النمط الجيني لكل CI من وصف للنمط الجيني متبوعا بتسطير أسفل السطر وحالة التدريب(على سبيل المثال، genotype_N genotype_LTM، وما إلى ذلك، حيث N = السذاجة وLTM = الذاكرة طويلة الأجل؛ انظر الملف التكميلي S2 للحصول على مثال). هذا التعليق التوضيحي ضروري ، حيث أن الدالة analearn ستحدد الذباب المدرب والسذاجة استنادا إلى الأحرف الموجودة بعد تسطير أسفل السطر الأول في عمود "النمط الجيني".
4. استخدم البرنامج النصي analearn R (الملف التكميلي S3) لإجراء اختبار عشوائية للحكم على الأهمية الإحصائية للاختلافات بين قيم LI من الأنماط الجينية المختلفة.
   1. مصدر البرنامج النصي (ملف إضافي S3) إلى R، الذي يعرف دالة تسمى "analearn".
      ملاحظة: تعريف الدالة هو: analearn < - دالة (nboot = 10,000، ساذج = 'N'، refmutation = NA، datname = NA، رأس = TRUE، البذور = NA، writeoutput = TRUE).
   2. بدء تشغيل الدالة عن طريق إدخال "analearn()" في سطر الأوامر R وتحديد ملف البيانات لتحليل (المنتجة في الخطوة 8.3) عبر الإطار المنبثق.
   3. اختر الطفرة المرجعية، التي هي النمط الجيني للتحكم، عن طريق إدخال الرقم المقابل والضغط على الإدخال.
      ملاحظة: بعد تحديد النمط الجيني المرجعي، يستغرق البرنامج النصي عدة ثوان لتنفيذ نسخ متماثلة 10,000 bootstrap.
   4. لاحظ جدول الإخراج (الجدول 3) ، الذي يحتوي على النمط الجيني ، وحالة التعلم(أيالتعلم ، STM ، أو LTM) ، يعني CI السذاجة ، يعني CI المدربين ، LI ، الفرق بين LI للتحكم مقارنة بالحالة التجريبية (LI dif) ، والحد الأدنى (LL) والحد الأعلى (UL) للفاصل الزمني للثقة بنسبة 95٪ من LI dif ، والقيمة pالتي تشير إلى احتمال عدم وجود فرق كبير.
      ملاحظة: سيقوم analearn بتخزين ملف نصي إخراج في الدليل حيث يوجد ملف البيانات. ومع ذلك، يظهر جدول الإخراج أيضا في وحدة تحكم R-Studio. يتم إنشاء الاسم الافتراضي استنادا إلى اسم ملف البيانات المتوفر.
   5. هناك العديد من الوسائط في الدالة analearn التي يمكن استخدامها لتغيير الإعدادات الافتراضية للدالة لضبط معلمات bootstrapping.
      ملاحظة: يعرف "nboot" عدد النسخ المتماثلة ل bootstrap ويتم تعيينه إلى 10,000 بشكل افتراضي. يمكن تغيير هذه القيمة إلى أي عدد صحيح أكبر من الصفر. يجند الجدول 5 عدة وسائط يمكن استخدامها لتغيير الإعدادات الافتراضية للدالة. ومع ذلك، فمن غير المستحسن استخدام البيانات التي يتم إنتاجها مع عدد قليل من bootstrap replicates.

Representative Results

الشكل 1: تحديد مؤشر المغازلة ونظرة عامة تجريبية. (أ)صور تظهر سلوك التودد الذكوري النمطي تجاه ذبابة أنثى. تظهر مراحل مختلفة من سلوك المغازلة: التوجيه (I) ، وبعد (II) ، واهتزاز الجناح (التمديد) والتنصت (III) ، واللعق (IV) ، ومحاولة الجماع (V). (ب)نظرة عامة تخطيطية لأوقات التدريب والاختبار بالنسبة لدورة ضوء الحاضنة، التي تم وضع علامة عليها بالساعات. تتم الإشارة إلى أوقات التدريب مع أشرطة، وفترات الراحة لSTM وLTM يشار مع خط متقطعة، ويشار إلى نقطة بداية الاختبار كسهم. لاحظ أن وقت اختبار LTM هو اليوم التالي للتدريب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: المعدات المستخدمة في اختبار تكييف التودد Drosophila. (أ)كتلة السكن هو شقة، كتلة أسفل مع 500 ميكرولتر من powerfood لكل بئر. مختومة مع فيلم لاصق qPCR مع ما لا يقل عن 4 ثقوب لكل بئر التي تم إنشاؤها باستخدام إبرة حقنة بقطر 0.8 ملم. يتم قطع الصفوف الفردية بالطول إلى شرائح باستخدام شفرة حلاقة للسماح بالفتح والإغلاق. (ب)مطلوب الطامح لنقل لطيف من الذباب الذكور والإناث دون استخدام التخدير. يظهر inset غيض من الطامح، مغلقة مع قطعة من القطن للحفاظ على الذباب داخل الطرف. (ج)إعداد نظام من كاميرتين للتسجيل المتزامن لغرفتي الخطوبة. (د)غرفة مغازلة مع 18 الساحات. وتستخدم ثقوب دخول انزلاق لوضع الذباب في الساحات. يمكن فتح فواصل البيض في وقت واحد لبدء التفاعل بين الذكور والإناث. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: مثال الجدول الزمني لاختبار LTM عبر ثلاث نسخ متماثلة في الأيام الفردية.

	عام	جمع	قطار	اختبر
اليوم -11	بدء ثقافات جمع الإناث مسبقا (الخطوة 1.3)
اليوم -10	بدء الثقافات لجمع مواضيع اختبار الذكور (الخطوة 2.2)
اليوم الأول		النائب 1
اليوم الثاني		النائب 2
اليوم الثالث		النائب 3
اليوم الرابع		النائب 4	النائب 1
اليوم الخامس			النائب 2	النائب 1
اليوم السادس			النائب 3	النائب 2
اليوم السابع			النائب 4	النائب 3
اليوم الثامن				النائب 4
اليوم التاسع	تحليل بيانات الفيديو والإحصاءات (الخطوة 8)
مندوب = تكرار

الجدول 2: مدة التدريب، وأوقات التدريب، وأوقات الاختبار للتعلم، وSTM، وLTM

	التعلم	STM	LTM
وقت التدريب	ساعة واحدة	ساعة واحدة	8 ح.
وقت الراحة	0 ساعة	ساعة واحدة	~ 24 ساعة.
بدء التدريب	0 ح. ALO	0 ح. ALO	4 ح. بلو
التوقف عن التدريب	1 ح. ALO	1 ح. ALO	4 ح. ALO
بدء الاختبار	1 ح. ALO	2 ح. ALO	0 ح. ALO (اليوم التالي)
ALO = بعد تشغيل الأضواء، BLO = قبل تشغيل الأضواء، STM = الذاكرة قصيرة الأجل، LTM = الذاكرة على المدى الطويل

الجدول 3: البيانات الإحصائية الناتجة عن نص أناليرن.
البيانات الإحصائية التي تم إنتاجها من نص analearn. ملف الإخراج من bootstrapping R-النصي الذي يحتوي على النمط الجيني، وحالة التعلم(أي،والتعلم، STM، أو LTM)، يعني CI السذاجة، يعني CI المدربين، LI، الفرق بين LI من السيطرة بالمقارنة مع حالة تجريبية (LI dif)، والحد الأدنى (LL) والحد الأعلى (UL) من الفاصل الزمني الثقة 95٪ من LI dif، وp-قيمةتشير إلى احتمال عدم وجود فرق كبير.

الجيني	التعلم	CI	CI	لي	لي	حد أدنى	الحد الأعلى	قيمة p
	شرط	ساذج	مدرب		اختلاف	(فاصل 95٪ كونفوشينس)	(فاصل 95٪ كونفوشينس)
تحكم	STM	0.467	0.116	0.752	NA	NA	NA	NA
داب في رناي	STM	0.699	0.257	0.633	0.119	-0.03	0.265	0.116
تحكم	LTM	0.59	0.384	0.348	NA	NA	NA	NA
داب في رناي	LTM	0.697	0.65	0.068	0.28	0.103	0.446	0.003

الملف التكميلي S1: خطة بناء غرفة المغازلة. يمكن فتح الملف مع أي تطبيق يسمح ملحقات .stp (CAD-files). الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

ملف إضافي S2: مثال على ملف إدخال البرنامج النصي Analearn. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي S3: النصي Analearn.R. يمكن فتح الملف مع R-Studio. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
P{KK101437}VIE-260B	VDRC	101437	Dhat-at-RNAi in 60100 background
P{KK108109}VIE-260B	-	-	Control-RNAi in 60100 background (gift from K. Keleman)
w+, UAS-dcr2/yhh;;elav-Gal4 (III)	-	-	panneuronal driver line
Containers for plant tissue culture	VWR	960177	175 mL plastic vials
Folded filters	Whatman	10311643	Filter paper to enlarge area flies can pupate on
Flat-bottom blocks (96-wells)	Qiagen	19579	Used for housing blocks
MicroAmp Clear Adhesive Film	Applied Biosystems	4306311	PCR adhesive film as lid on flat-bottom blocks
Razor blade	-	-	Any sharp will do
Needle	-	-	0.8 mm diameter
Aspirator	-	-	Cut a 1mL pipet tip with scissors in order to have two pieces. The narrow tip of the pipettip is placed as fly entrance in a ~80 cm flexible hose. To prevent a fly from getting in the hose, a normal piece of cotton or small mesh gaze is placed in between the tip and the hose. The other half of the pipettip can be used as mouth piece at the end of the hose.
Courtship chambers	-	-	file S1 can be opened with indicated CAD software
Camcorder	Sony	-	camera specification: >4M pixels, full HD.
For manual quantification, any simple video recording device has the potential to produce a video of sufficient quality to observe courtship behavior accurately. For automated quantification, there will likely be different requirements depending on the software to be used, and users should investigate this thoroughly if automated quantification is desired.
Name	Company	Catalog Number	Comments
power food
Agar	Sigma	A7002
Yeast	Bruggeman	-
Yeast extract	MP biomedicals	0210330391
Peptone	Sigma	P6838
Sucrose	Sigma	S9378
Glucose	Sigma	G7021
MgSO4	Sigma	M2643
CaCl2	Merck	1023780500
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	-
Yeast paste	-		yeast grains and water mixture in a 1:1 ratio
Name	Company	Catalog Number	Comments
normal food
Agar	MP biomedicals	215017890
Yeast	bruggeman	-
Corn flour	de Molen	-
Sugar	de Molen	-
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	-